本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT-LAMP反應(yīng)引物組、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

隨著魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展壯大，養(yǎng)殖過(guò)程中各種疾病的出現(xiàn)，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。魚(yú)神經(jīng)壞死病毒(nervous necrosis virous,NNV)是一種世界范圍內(nèi)流行、嚴(yán)重危害多種海水和淡水魚(yú)類(lèi)的傳染性病原?？梢詫?dǎo)致魚(yú)類(lèi)病毒性神經(jīng)壞死病又稱(chēng)病毒性腦病和視網(wǎng)膜病，具有極高的傳染性和危害性，嚴(yán)重情況下，仔魚(yú)和幼魚(yú)的死亡率可以達(dá)到100％。近年來(lái)研究表明，NNV病毒的感染可以破壞線粒體，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。對(duì)于魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病目前尚無(wú)有效的防治方法，由于該傳染病很大一部分來(lái)自親魚(yú)的垂直傳播，因此，加強(qiáng)苗種的檢疫，使用健康不帶毒的種苗進(jìn)行養(yǎng)殖，可以大大減少該傳染病的爆發(fā)幾率。目前使用的檢測(cè)方法有顯微鏡觀察法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和細(xì)胞培養(yǎng)法。本發(fā)明建立了一種方便快捷的RT-LAMP病毒核酸檢測(cè)法。

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，LAMP反應(yīng)是在一個(gè)恒定溫度的條件下進(jìn)行的，樣品的擴(kuò)增發(fā)生在環(huán)區(qū)域，包含兩種方式：一種是在頸環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域3’端的自我延伸，另一種是新的引物在環(huán)區(qū)域發(fā)生的延伸。由于LAMP技術(shù)具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、快速簡(jiǎn)便、成本低廉等特點(diǎn)，使其廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)、胚胎性別鑒定、食品衛(wèi)生檢測(cè)等方面。

中國(guó)專(zhuān)利200910039534.4公開(kāi)了一種赤點(diǎn)魚(yú)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)用引物組、檢測(cè)方法和快速診斷試劑盒，通過(guò)內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、外引物F3和外引物B3組成引物組，能夠在1小時(shí)左右完成擴(kuò)增。

本發(fā)明利用RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，建立了魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的快速檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)比選取了特異性好的一組擴(kuò)增引物，并優(yōu)化了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等條件，檢驗(yàn)了該方法的靈敏性和特異性，最終建立了一套不依賴(lài)復(fù)雜設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，只需肉眼觀察就可以實(shí)施的檢測(cè)方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是介紹一種操作簡(jiǎn)單、不依賴(lài)復(fù)雜的設(shè)備、特異性強(qiáng)、成本低廉的魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT-LAMP檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下：

一種檢測(cè)魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT-LAMP反應(yīng)引物組，其特征在于，所述RT-LAMP反應(yīng)引物組包含外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP，其中：

外引物F3序列如SeqID NO.1所示，外引物B3序列如SeqID NO.2所示，內(nèi)引物FIP序列如SeqID NO.3所示，內(nèi)引物BIP序列如SeqID NO.4所示。

優(yōu)選地，含有上述RT-LAMP反應(yīng)引物組的檢測(cè)魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT-LAMP試劑盒，包含如下試劑：引物組、10×反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase-Free水。

優(yōu)選地，所述10×反應(yīng)緩沖液包括：200mM pH 8.8的Tris-HCl；100mM(NH₄)₂SO₄；100mM KCl；20mM MgSO₄；1％TritonX-100；50mM dNTPs；100mM DTT；100mM鈣黃綠素。

優(yōu)選地，所述引物組中，內(nèi)引物BIP、FIP濃度均為400pmol，外引物B3、F3濃度均為50pmol。

上述檢測(cè)魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT-LAMP試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

(1)總RNA的提??；

(2)吸取檢測(cè)試劑盒的試劑，與提取的RNA混合，配置RT-LAMP檢測(cè)體系；

(3)將步驟(2)配置好的檢測(cè)體系置于61℃下恒溫反應(yīng)30min，80℃滅活5min；

(4)判定有無(wú)NNV病毒。

優(yōu)選地，步驟(1)所述總RNA提取是通過(guò)解剖獲得魚(yú)的眼和腦組織，提取總RNA。

優(yōu)選地，步驟(2)所述RT-LAMP檢測(cè)體系按25μl為例，包括引物組1μl，10×反應(yīng)緩沖液2.5μl，Bst DNA聚合酶1μl，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl，RNase-Free水18.5μl，提取的總RNA1μl。

優(yōu)選地，步驟(4)中，有無(wú)NNV病毒的判定方法為：根據(jù)反應(yīng)后管內(nèi)液體有無(wú)綠色熒光判斷檢測(cè)樣品為陰性或陽(yáng)性，其中，有綠色熒光的為陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)綠色熒光的為陰性結(jié)果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明結(jié)果表明最佳擴(kuò)增時(shí)間為30分鐘。本發(fā)明無(wú)需復(fù)雜設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，結(jié)果容易判定，由于鈣黃綠素為預(yù)先加入到反應(yīng)體系中，而非反應(yīng)結(jié)束后再打開(kāi)蓋子加入，因此整個(gè)過(guò)程無(wú)需開(kāi)蓋，避免了氣溶膠的污染。

附圖說(shuō)明：

圖1熒光目視結(jié)果；

圖2 RT-LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖3 RT-LAMP的靈敏性擴(kuò)增結(jié)果；

序列表說(shuō)明：

SeqID NO.1外引物F3序列；

SeqID NO.2外引物B3序列；

SeqID NO.3內(nèi)引物FIP序列；

SeqID NO.4內(nèi)引物BIP序列。

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1：引物的制備。

參照魚(yú)神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因序列(GenBank:AF245004.1)，制備引物組，包含外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP，其中：

外引物F3序列如SeqID NO.1所示，外引物B3序列如SeqID NO.2所示，內(nèi)引物FIP序列如SeqID NO.3所示，內(nèi)引物BIP序列如SeqID NO.4所示；

實(shí)施例2：一種魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒的配制。

其中，10×反應(yīng)緩沖液包括：200mM pH 8.8的Tris-HCl；100mM(NH₄)₂SO₄；100mM KCl；20mM MgSO₄；1％TritonX-100；50mM dNTPs；100mM DTT；100mM鈣黃綠素。

引物組濃度為：內(nèi)引物BIP、FIP濃度均為400pmol，外引物B3、F3濃度均為50pmol。

實(shí)施例3：產(chǎn)物檢測(cè)。

(1)總RNA的提取：

取石斑魚(yú)的腦及眼組織20mg，在液氮中磨碎；加入600μL Buffer RL，室溫放置5分鐘；12000rpm離心5分鐘，取上清；向上清溶液中加入1倍體積的70％的乙醇，混勻；將所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入350μL Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入500μL Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中；12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干吸附柱中的無(wú)水乙醇；將吸附柱轉(zhuǎn)入新的離心管中，向吸附柱中間加入50μL RNase Free Water，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集RNA溶液。

(2)配置RT-LAMP檢測(cè)體系：

按25μl為例，取RT-LAMP反應(yīng)試劑盒(按實(shí)施例2制備)試劑24μl(其中，10×反應(yīng)緩沖液2.5μL、引物組1.0μL、Bst DNA聚合酶1.0μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0μL、RNase-Free水18.5μL)，加入提取的總RNA 1μl。

(3)反應(yīng)：

將配置好的RT-LAMP檢測(cè)體系置于61℃條件下恒溫30min，再置于80℃下滅活5min。

(4)產(chǎn)物結(jié)果的判斷：

RT-LAMP反應(yīng)的目視檢測(cè)：根據(jù)反應(yīng)后管內(nèi)液體有無(wú)綠色熒光判斷檢測(cè)樣品為陰性或陽(yáng)性，其中，有綠色熒光的為陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)綠色熒光的為陰性結(jié)果。結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例4：特異性檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)選取9種常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)病毒的核酸，1斜帶魚(yú)神經(jīng)壞死病毒、2傳染性胰臟壞死病毒、3病毒性出血性敗血癥病毒、4淋巴囊腫病毒、5大菱鲆紅體病虹彩病毒、6傳染性鮭魚(yú)貧血癥病毒、7嗜水氣單胞菌、8哈維氏弧菌、9鰻弧菌核酸，利用上述試驗(yàn)建立的方法，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明只有含有NNV核酸的樣品有綠色熒光，其余無(wú)熒光，本發(fā)明建立的RT-LAMP法對(duì)NNV有特異性。

進(jìn)一步的，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取20尾赤點(diǎn)魚(yú)魚(yú)苗，分別采用本實(shí)驗(yàn)的RT-LAMP法和RT-PCR法，檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的RT-LAMP法準(zhǔn)確可靠。

實(shí)施例5：靈敏性檢測(cè)。

將提取的總RNA分別稀釋至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5，并以稀釋后的樣品為模板，進(jìn)行反應(yīng)。

同時(shí)利用上述稀釋樣品進(jìn)行RT-PCR對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果表明其靈敏度與本發(fā)明的RT-LAMP法相當(dāng)，然而相對(duì)于耗時(shí)6h的RT-PCR法，本發(fā)明的RT-LAMP法優(yōu)化后僅需要30min既可以完成，如圖3所示。

本發(fā)明由于引物的設(shè)計(jì)是針對(duì)高度保守區(qū)，且不同毒株間無(wú)明顯差異，因此本發(fā)明提供的檢測(cè)方法有著更加廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 斯澳生物科技（蘇州）有限公司

<120> 一種魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的RT-LAMP反應(yīng)引物組、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用方法

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<170> PatentIn version 3.5

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