本發(fā)明涉及一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)及方法，屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，適合于要求高通量，在線檢測以及對擴增模板進行完全定量的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種非常重要的核酸分析方法，得益于能夠快速對目標分子進行富集，為下一步分析準備，故其廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學與生物研究領(lǐng)域，大大加快了生物基因組結(jié)構(gòu)研究進程。傳統(tǒng)的PCR儀器由于液體體積量大，故需要循環(huán)復雜的加熱和冷卻循環(huán)，消耗大量能源，缺少實時監(jiān)測同時不能夠進行絕對定量分析。數(shù)字PCR技術(shù)是近年快速發(fā)展的新型PCR技術(shù)，可進行絕對定量的核酸檢測術(shù)?；驹硎峭ㄟ^將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元至多包含一個拷貝的目標分子，在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，其應(yīng)用領(lǐng)域包括：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

基于這些優(yōu)勢液滴數(shù)字PCR被廣泛的應(yīng)用低模板濃度目標分子的檢測?，F(xiàn)有基于液滴數(shù)字PCR設(shè)備通常將整個循環(huán)分為三個部分：液滴發(fā)生裝置(2)，熱循環(huán)控制器和液滴熒光檢測器，需要液滴在各個模塊中進行轉(zhuǎn)移，在移動和熱循環(huán)過程中容易造成液滴破碎以及液滴之間相互融合導致不均勻，并且極易造成試劑之間的交叉污染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明技術(shù)解決問題：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)及方法，具有高度的一體化設(shè)計，集成承壓能力強的液滴發(fā)生裝置(2)以及采用剛性熱循環(huán)流道裝置，具有高導熱性的同時能夠有效的抑制液滴破碎與樣品之間的交叉污染。

為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)，包括：動力裝置、液滴發(fā)生裝置、液滴PCR反應(yīng)模組、熒光檢測控制器、PC控制模塊；動力裝置包括反應(yīng)試劑推進器(6)及油相推進器(7)；液滴PCR反應(yīng)模組(3)包括剛性熱循環(huán)模塊(8)和熱循環(huán)溫度控制模塊(15)；

試劑通過反應(yīng)試劑推進器(6)以及油相推進器(7)分三路推進入液滴發(fā)生裝置(2)中，在液滴發(fā)生裝置(2)中產(chǎn)生大量油包反應(yīng)試劑納升級液滴，通過反應(yīng)試劑推進器(6)以及油相推進器(7)來調(diào)節(jié)液滴發(fā)成裝置(2)的進出口流量，進而形成對液滴生成以及液滴大小的控制；液滴發(fā)生裝置(2)的出口與剛性熱循環(huán)模塊(8)上的熱剛性流道(9)入口相連接，同時熱循環(huán)溫度控制模塊(15)對剛性流道(9)表面溫度進行控制；液滴在剛性熱循環(huán)模塊(8)經(jīng)過熱循環(huán)后進入熒光檢測控制器(4)，熒光檢測控制器(4)對已經(jīng)通過熱循環(huán)后的液滴進行實時在線熒光檢測，同時PC控制模塊(5)對液滴熒光檢測結(jié)果進行分析轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，整個系統(tǒng)形成以前端液滴生成，PCR反應(yīng)熱循環(huán)以及末端液滴熒光實時在線檢測的一體化設(shè)計。

上述的剛性熱循環(huán)模塊(8)主要由剛性流道(9)，剛性圓柱體(11)，圓柱形加熱裝置孔槽(12)以及熱電偶安置孔槽(13)，其中剛性流道(9)是一個呈8字形均勻的纏繞于具有兩個不同溫度區(qū)的剛性圓柱體(11)上，液滴在高導熱剛性流道(9)兩個溫度區(qū)間來回穩(wěn)定流動，同時剛性圓柱體(11)中間部位有安置圓柱形加熱裝置的孔槽，剛性圓柱體(11)端部緊貼有一熱電偶傳感器用于檢測導熱部件溫度。

上述的熱循環(huán)溫度控制模塊(15)包括熱電偶傳感器(14)，PC客戶端軟件模塊(16)，單片機(17)，控制電路(18)，DC電源(19)以及安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器(20)。其中，熱電偶傳感器(14)與剛性熱循環(huán)模塊中的剛性圓柱體(11)熱接觸，實時返回溫度數(shù)據(jù)給安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器(20)，安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器通過TCP/IP接口(或者GPIB接口)將采集到的溫度數(shù)據(jù)上傳到PC端，被PC客戶端軟件模塊(16)收集處理，通過PID邏輯計算得出需要發(fā)送給單片機(17)的程控信號。PC客戶端軟件同時通過可編程儀器標準指令(SCPI)控制安捷倫儀器的數(shù)據(jù)采集參數(shù)(采樣時間，采樣模式，采樣開始和結(jié)束)。由PC客戶端軟件計算得到的控制信號經(jīng)由USB接口傳送到單片機(17)，單片機按照程控信號的指令調(diào)節(jié)PWM輸出口的占空比，從而控制晶體管(10)的開關(guān)，進而調(diào)節(jié)DC電源(19)的輸出功率，而功率的改變引起剛性熱循環(huán)模塊的溫度變化，這樣完成一個溫度控制循環(huán)過程。

上述動力裝置(1)包括反應(yīng)試劑推進器(6)以及油相推進器(7)。通過反應(yīng)試劑推進器(6)以及油相推進器(7)將試劑分三路推進入液滴發(fā)生裝置(2)中，在液滴發(fā)生裝置中產(chǎn)生大量油包反應(yīng)試劑納升級液滴。通過反應(yīng)試劑推進器(6)以及油相推進器(7)來調(diào)節(jié)液滴發(fā)成裝置(2)的進出口流量來影響流道內(nèi)壓力差，進而形成對液滴生成以及液滴大小的控制。

上述熒光檢測控制器(4)組成部分包括改進的進樣針(24)，熒光檢測器(25)(guava easyCyte 5，Merck Millipore，美國)以及熒光數(shù)據(jù)收集分析軟件(26)。剛性流道(9)末端與改進進樣針(24)進行對接，接入熒光檢測器，而后經(jīng)過數(shù)據(jù)收集分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。

本發(fā)明的工作原理是：對樣品進行稀釋后，通過功率裝置以及液滴發(fā)生器生成部分包含樣品的液滴，通過熱循環(huán)控制裝置，使得包含樣品液滴性狀改變，從而改變被測樣本的受激發(fā)光的強度，通過末端光學部件對包含樣品液滴進行激發(fā)后，計算機統(tǒng)計檢測到的發(fā)光強度，并經(jīng)過一定的數(shù)據(jù)處理獲取最終獲取樣品具有的生物信息如附圖6所示。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果如下：

(1)本發(fā)明與現(xiàn)有數(shù)字PCR儀器的主要區(qū)別在于整個系統(tǒng)形成以前端液滴生成，PCR反應(yīng)熱循環(huán)以及末端液滴熒光實時在線檢測的一體化設(shè)計，實現(xiàn)擴增與檢測一步操作，能夠有效減小現(xiàn)有分體式多步驟操作帶來樣品污染以及液滴融合等問題。

(2)本發(fā)明采用了剛性管道，得益于剛性流道為具有非彈性壁面能夠有效抑制液滴在熱循環(huán)運輸過程，由于管道變形導致管內(nèi)水利條件變化而造成液滴破裂與融合。同時由于具有高熱傳導系數(shù)(16W/M-K.20℃下測量)，相比于常規(guī)采用的聚四氟乙烯管(0.27W/M-K.20℃下測量)導熱效率有很大的提升。

(3)本發(fā)明采用了末端熒光檢測，在傳統(tǒng)離線的檢測有三點缺陷；由于含有目標模板的液滴其密度比作為連續(xù)相的礦物油的密度要大很多，隨著檢測時間的推移，液滴就會順著重力的方向往下沉，這樣經(jīng)過一定時間后，液滴將完全沉積在檢測管底端；傳統(tǒng)熒光檢測儀器中的內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)置中，為保護進樣針，特意讓進樣針針端與樣品管底端之間保留了一段距離，以免其不小心觸碰到管底，造成損傷。在這種情況下，當檢測進行到一定時間后，流式細胞儀便會因為進樣針抽取不到沉降在樣品管底部大量的液滴而導致無法正常檢測出熒光信號；由于采用油包試劑模式，故在一定時間內(nèi)液滴收集的體積遠遠比油的體積小的多，所以單個樣品管內(nèi)能收集到的液滴十分有限，這樣就需要連續(xù)收集多管，就會造成實驗效率降低。本發(fā)明得益于進樣針的改造，用內(nèi)徑為200um的玻璃毛細管替代流式細胞儀自帶的進樣針，新進樣針能直接與擴增系統(tǒng)相連，使得儀器能對微液滴進行實時，連續(xù)，高通量，檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)流程圖；

圖2為圖1中生成液滴裝置示意圖；

圖3為圖1中剛性通道具體纏繞結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明采用的熒光檢測改進后進樣針；

圖5為本發(fā)明采用的熱循環(huán)溫度控制方式；

圖6是一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR熒光檢測結(jié)果圖，其中左圖表示液滴大小與負責度分布情況，右圖表示左圖選中區(qū)域(R1)中液滴時實熒光檢測分布情況。

具體實施方式

如圖1所示，本發(fā)明包括動力裝置1、液滴發(fā)生裝置2、液滴PCR反應(yīng)模組3、熒光檢測控制器4和PC控制模塊5。在該實例中，采用添加EM90的礦物油作連續(xù)相流體，含有目標DNA模板的樣品則作分散相流體，以此來產(chǎn)生含有模板分子的單分散液滴。其中，礦物油內(nèi)所含的EM90體積分數(shù)為2％，含有DNA模板的樣品具體配比如下：每1mL PCR Mix反應(yīng)試劑中含873μLddH2O、100μL 10*Buffer、20μL dNTP Mix、0.9μL Lib5S1、0.9μL Lib3A2以及5μL Pfu酶5U/mL，待上述配比完成后，再向其中加入4％的EvaGreen染料,該染料能與特定模板結(jié)合后，受特定波長的光激發(fā)后會產(chǎn)生熒光，其熒光強度可用于表征本實驗擴增效率。通過反應(yīng)試劑推進器6以及油相推進器7將試劑分三路推進入液滴發(fā)生裝置2中，在液滴發(fā)生裝置中產(chǎn)生大量油包反應(yīng)試劑納升級液滴；液滴發(fā)生裝置2出口與剛性熱循環(huán)模塊8上的剛性流道9入口相連接，同時熱循環(huán)溫度控制模塊15對剛性流道9溫度進行控制；液滴在剛性熱循環(huán)模塊8經(jīng)過熱循環(huán)后進入熒光檢測控制器4，熒光檢測控制器對已經(jīng)通過熱循環(huán)后的液滴進行實時在線熒光檢測，同時PC控制模塊5對液滴熒光檢測結(jié)果進行分析轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。整個系統(tǒng)形成以前端液滴生成，PCR反應(yīng)熱循環(huán)以及末端液滴熒光實時在線檢測的一體化設(shè)計。

如圖2所示為液滴發(fā)生裝置2，包括擰緊螺母21，液滴發(fā)生裝置主體22以及適配器23。動力裝置1將包含樣品的試劑推入液滴發(fā)生裝置2其中一個入口，同時將油相推入與反應(yīng)試劑入口互相垂直的兩個入口，由于流體剪切力的作用后而生成大量油包反應(yīng)試劑納升級液滴。動力裝置1是通過毛細玻璃管27將試劑推進到液滴發(fā)生裝置中。在準備連接用的毛細管時，應(yīng)該使用專業(yè)的切割工具毛細管環(huán)形刀來裁剪，以此確保斷面的平整性，避免出現(xiàn)玻璃破碎剝落，堵塞接頭的現(xiàn)象。此外，對裁剪完的玻璃毛細管需進行顯微鏡觀察，如發(fā)現(xiàn)有不平整之處，便可使用陶瓷片將切口輕輕磨平。由于該種液滴發(fā)生裝置2的組裝和拆卸都非常方便，于是在實驗正式開始前的準備過程中，通常將還未組裝好的接頭部件先直接放入超聲清洗器中清洗一遍，之后向接頭內(nèi)部通入酒精再次清洗，最后用氮氣進行吹干。在裝配時將毛細玻璃管伸入適配器23中，再采用擰緊螺母21將其擰緊在液滴發(fā)生裝置主體22上。液滴發(fā)生裝置2安裝完成后，開啟反應(yīng)試劑推進器6以及油相推進器7將試劑推入液滴發(fā)生裝置2中，通過調(diào)整推進器流量來控制液滴發(fā)生裝置所生成液滴大小。

如圖3所示為剛性流道9具體纏繞結(jié)構(gòu)示意圖。剛性熱循環(huán)模塊8主要由剛性流道9，剛性圓柱體11，圓柱形加熱裝置孔槽12以及熱電偶安置孔槽13組成，其中剛性流道9是一個呈8字形均勻的纏繞于兩個不同溫度的剛性圓柱體11上，液滴在剛性流道9中沿著兩個不同溫度區(qū)的剛性圓柱體11來回穩(wěn)定流動，同時剛性圓柱體11中間部位有安置圓柱形加熱裝置的孔槽，同時熱電偶安置孔槽13內(nèi)安放熱電偶傳感器14與剛性熱循環(huán)模塊中的剛性圓柱體11進行熱接觸，實時返回溫度數(shù)據(jù)。

剛性流道9為高導熱剛性流道，采用的是304不銹鋼毛細管，管壁厚0.1mm，管內(nèi)徑0.35mm，其導熱系數(shù)為16W/M-K(20℃下測量)，相比于常規(guī)采用同樣管徑的聚四氟乙烯管0.27W/M-K(20℃下測量)導熱效率有極大的提升。

如圖4所示為本發(fā)明采用的熒光檢測改進后進樣針24，其中包括處理后的玻璃毛細管28，為進樣針主體29。采用的玻璃毛細管的內(nèi)徑為200um，外徑為360um。將玻璃毛細管作為檢測窗口部分放置在溫度為200度濃硫酸中經(jīng)過一小時后去除表面涂層替代流式細胞儀自帶的進樣針，其中在玻璃毛細管中間部分去除表面涂層的部分作為檢測窗口。新進樣針能直接與剛性流道9末端相連后液滴經(jīng)過熒光檢測控制器4檢測窗口，實現(xiàn)對微液滴進行在線實時、連續(xù)檢測。

如圖5所示為本發(fā)明采用的熱循環(huán)溫度控制方式，主要熱電偶傳感器14，PC客戶端軟件模塊16，單片機17，DC電源19以及安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器20。其中，熱電偶傳感器14與剛性熱循環(huán)模塊中的剛性圓柱體3-2熱接觸，實時返回溫度數(shù)據(jù)給安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器20，安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器通過TCP/IP接口或者GPIB接口將采集到的溫度數(shù)據(jù)上傳到PC端，被PC客戶端軟件模塊16收集處理，通過PID邏輯計算得出需要發(fā)送給單片機17的程控信號。PC客戶端軟件同時通過可編程儀器標準指令SCPI控制安捷倫儀器的數(shù)據(jù)采集參數(shù)采樣時間，采樣模式，采樣開始和結(jié)束。由PC客戶端軟件計算得到的控制信號經(jīng)由USB接口傳送到單片機17，單片機按照程控信號的指令調(diào)節(jié)PWM輸出口的占空比，從而控制晶體管10的開關(guān)，進而調(diào)節(jié)DC電源19的輸出功率。而功率的改變勢必改變剛性熱循環(huán)模塊的溫度，這樣完成一個溫度控制循環(huán)過程。

如圖6所示是一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR結(jié)合實例得到的熒光檢測結(jié)果圖。由于熒光檢測控制器4采用的是流式細胞術(shù)測量，通常用兩種散射方向的散射光進行測量：前向角散射FSC和側(cè)向散射SSC。前向角散射光FSC的強度與顆粒的大小有關(guān)，對于同種顆粒群體，前向角散射光強隨顆粒截面積的增大而增大；對于球形顆粒，則在小立體角范圍內(nèi)前向角散射光強基本上和顆粒截面積的大小成線性關(guān)系。而側(cè)向散射光SSC的測量主要是用來獲取關(guān)于顆粒內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的信息。因此，在本實驗中液滴熒光檢測結(jié)果中，前向散射光FSC的測量值反映的便是液滴的大小，而側(cè)向散射光SSC的測量值反映的則是液滴的內(nèi)部結(jié)構(gòu)?；谠谥暗臉悠放渲浦?，使用的熒光染色劑Evagreen染料，其與特定模板結(jié)合后，受到激光的激發(fā)便會發(fā)出綠色的熒光，故在進行檢測時，只需測定綠色熒光的值便可判定實驗效果。隨著液滴連續(xù)不斷地經(jīng)過進樣針24進入檢測系統(tǒng)，可以從PC控制模塊5上得到圖6所示的檢測結(jié)果，其圖6左圖橫坐標FSC值反映液滴大小均穩(wěn)定在15000FSC-HLin，即說明液滴尺寸基本保持不變，整個系統(tǒng)的穩(wěn)定性得到驗證。隨著檢測時間的推移，液滴熒光值基本保持不變，其中含有模板分子的液滴被準確識別出來，其熒光值保持在1400GRN-HLog，而不含有模板分子液滴的熒光值保持在450GRN-HLog。這就表明：在兩溫度段的循環(huán)擴增系統(tǒng)內(nèi)，包裹在液滴中的目標DNA分子確實進行了穩(wěn)定有效的擴增，即擴增系統(tǒng)的有效性得到了驗證。

提供以上實施案例僅僅是為了描述本發(fā)明的目的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定。不脫離本發(fā)明的精神和原理而做出的各種等同替換和修改，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。