本發(fā)明涉及一種以多表位肽段組合抗原刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的方法，屬于生物技術(shù)、特異性抗體檢測(cè)和疫苗制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染所致。HBV顆粒由乙肝表面抗原(HBsAg)和來自宿主的脂質(zhì)組成，是直徑約為42nm的球形結(jié)構(gòu)。HBsAg包括3種被膜糖蛋白，即大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)和小蛋白(SHBs)。乙肝病毒大分子蛋白表面又分為前S1區(qū)、前S2區(qū)和S區(qū)。有研究表明，PreS1只存在于表面抗原的大分子蛋白中，是乙肝早期診斷和病毒復(fù)制的指標(biāo)，在病毒顆粒的裝配和感染中起重要作用；目前最受關(guān)注的兩個(gè)重要表位：第21-47號(hào)氨基酸所在的表位(簡(jiǎn)稱P21表位)和第94-117號(hào)氨基酸所在的表位(簡(jiǎn)稱P94表位)，存在病毒與肝細(xì)胞膜的結(jié)合位點(diǎn)。

根據(jù)HBV全基因組序列差別>8％將HBV分為A-I九個(gè)基因型，根據(jù)S基因的差別>4％可將HBV基因型分為20個(gè)亞型。目前，國際上已經(jīng)存在不同基因型的參照序列以及以此為依據(jù)建立了多種基因型檢測(cè)方法，但這些參照株多為單一患者來源，本身就存在多種堿基替代情況，且不同地區(qū)的相同基因型或亞型間還有較大差異，對(duì)于不同地區(qū)需建立相應(yīng)適合的參照序列，這對(duì)于具體研究時(shí)所用的多肽序列選擇造成了很大的困難。

目前，多肽主要通過化學(xué)合成和生物合成制備得到，其中多肽的化學(xué)合成有液相合成和固相合成之分，每種多肽合成方法應(yīng)用方式不同且各有利弊。對(duì)于小片段多肽的合成(30個(gè)氨基酸以內(nèi)，少數(shù)為50個(gè)氨基酸以內(nèi))多采用固相逐步合成方法，該方法精準(zhǔn)和有針對(duì)性，但隨著氨基酸數(shù)量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增長(zhǎng)，目的肽的純度相應(yīng)降低，后續(xù)的純化和重復(fù)性愈加困難。對(duì)于大片段多肽(含100個(gè)以上氨基酸)目前大多應(yīng)用液相分段合成法，原理是根據(jù)多肽片段在溶液中的專一性或化學(xué)選擇性，自發(fā)連接成長(zhǎng)肽，但步驟繁瑣，不易合成，且精準(zhǔn)度和針對(duì)性有待完善。

疫苗是將病原微生物(如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。目前疫苗的制備仍不完善，不同人群接種疫苗后會(huì)產(chǎn)生不同程度的副反應(yīng)，效果不穩(wěn)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決同一基因型的抗原肽段復(fù)雜多變或者抗原突變株增生，大片段多肽合成較困難的現(xiàn)狀，以及目前疫苗存在的效果不穩(wěn)定的問題，本發(fā)明提供一種多表位肽段組合抗原，以及以組合抗原刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的方法。本發(fā)明應(yīng)用肽段組合的方式，由幾個(gè)重要的小肽的合成來替代原病原微生物，會(huì)更為純凈，相應(yīng)的副反應(yīng)較小，免疫針對(duì)性相比于完整的病原微生物要好。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種組合抗原，所述組合抗原是將多個(gè)表位肽段組合而得到的抗原。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述組合抗原，是用于檢測(cè)乙肝病毒PreS1抗體、乙肝病毒PreS2抗體、甲肝病毒VP1抗體、甲肝病毒VP3抗體、丙肝病毒E2抗體等。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述組合抗原，是用于檢測(cè)抗乙型肝炎病毒抗體的組合抗原。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表位，包括乙肝病毒PreS1抗體的P21表位、P94表位，PreS2抗體的120-145號(hào)氨基酸表位；甲肝VP1抗體的11-25號(hào)氨基酸表位、VP3抗體的102-121號(hào)氨基酸表位；丙肝病毒E2抗體的384-410號(hào)氨基酸表位、412-423號(hào)氨基酸表位、523-535號(hào)氨基酸表位等。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述組合抗原包含氨基酸序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述氨基酸序列為SEQ ID NO.1的肽段即為P21表位的肽段；氨基酸序列為SEQ ID NO.2的肽段即為P94表位的肽段。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述組合抗原是將序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段分別偶聯(lián)大蛋白后，將偶聯(lián)后的復(fù)合物混合得到的。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述大蛋白可以是KLH、OVA、BSA等中的任意一種。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述組合抗原中氨基酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的肽段的摩爾比在1:10～10:1之間。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種以組合抗原刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體的方法，所述方法是以多表位肽段組合的方式代替全長(zhǎng)肽段作為抗原刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法，是采用兩個(gè)以上表位的肽段，分別偶聯(lián)大蛋白，然后以偶聯(lián)有大蛋白的兩個(gè)以上的肽段作為抗原。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述特異性抗體是指乙肝病毒PreS1抗體、乙肝病毒PreS2抗體、甲肝病毒VP1抗體、甲肝病毒VP3抗體、丙肝病毒E2抗體等。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表位，包括乙肝病毒PreS1抗體的P21表位、P94表位，PreS2抗體的120-145號(hào)氨基酸表位；甲肝VP1抗體的11-25號(hào)氨基酸表位、VP3抗體的102-121號(hào)氨基酸表位；丙肝病毒E2抗體的384-410號(hào)氨基酸表位、412-423號(hào)氨基酸表位、523-535號(hào)氨基酸表位等。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述肽段包括氨基酸序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的肽段。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述氨基酸序列為SEQ ID NO.1的肽段即為P21表位的肽段；氨基酸序列為SEQ ID NO.2的肽段即為P94表位的肽段。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述兩個(gè)以上的肽段，各肽段相互之間的摩爾比在1:10～10:1之間。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述大蛋白可以是KLH、OVA、BSA等中的任意一種。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明應(yīng)用肽段組合的方式，由幾個(gè)重要的小肽的合成來替代原病原微生物，會(huì)更為純凈，相應(yīng)的副反應(yīng)較小，免疫針對(duì)性相比于完整的病原微生物要好。

附圖說明

圖1：不同包被方式抗體檢測(cè)吸光度值及顯著性圖；

圖2：包被P21&P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)的抗體檢測(cè)吸光度值圖；

圖3：包被P21-KLH、P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)的抗體檢測(cè)吸光度值圖

圖4：包被P21&P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)的抗體檢測(cè)吸光度值顯著性圖；

圖5：包被P21-KLH與PreS1全長(zhǎng)的抗體檢測(cè)吸光度值顯著性圖；

圖6：包被P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)的抗體檢測(cè)吸光度值顯著性圖。

具體實(shí)施方案

下面結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式，即通過以B基因型為例兩表位肽段組合代替全長(zhǎng)檢測(cè)乙型肝炎病毒前S1抗體來具體說明本發(fā)明方法，但不限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：通過兩表位肽段組合代替全長(zhǎng)的方式檢測(cè)抗乙型肝炎病毒前S1抗體

間接ELISA方法檢測(cè)HBV患者血清中抗體濃度，其中包被抗原的選擇至關(guān)重要。常規(guī)ELISA方法需提前確定HBV患者的基因型，根據(jù)其選擇合適的包被多肽序列。但是存在兩個(gè)問題：第一，目前，HBV分為A-I九個(gè)基因型；即便對(duì)于同種基因型的參照株，由于地區(qū)差異及自身堿基替換等情況，存在多種不同的氨基酸序列，對(duì)于研究時(shí)選擇何種多肽序列造成了困難；第二，目前對(duì)于小片段多肽(少于30個(gè)氨基酸)多采用固相合成的方法，易于合成，但隨著氨基酸數(shù)量的增加，合成效率逐步下降，后續(xù)的純化和重復(fù)性愈加困難；

大片段多肽(多于100個(gè)氨基酸)多采用液相分段合成法，但步驟繁瑣，不易合成，且精準(zhǔn)度和針對(duì)性有待完善。

根據(jù)本申請(qǐng)的研究方法，結(jié)合實(shí)際情況，檢測(cè)抗體的方法為：確定全長(zhǎng)肽段上幾個(gè)重要的表位肽段，通過偶聯(lián)大蛋白提高其免疫原性，通過全長(zhǎng)肽段中兩個(gè)重要表位肽段組合來代替全長(zhǎng)肽段作為抗原進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)。

具體實(shí)施步驟設(shè)計(jì)如下：

步驟一：提取慢性乙肝患者血清中的病毒DNA

獲取慢性乙肝患者血樣213例，血樣提供者年齡跨度較大(7歲-73歲)，男性占61％(130/213)，具有研究意義。使用TAKARA公司的DNA提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，Catalog No.9766)，對(duì)213例樣本進(jìn)行病毒基因提取，將提取的乙肝病毒DNA作為模板鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

步驟二：PCR擴(kuò)增病毒前S1區(qū)域并進(jìn)行測(cè)序

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)分別對(duì)213例DNA樣本進(jìn)行DNA模板鏈的擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置進(jìn)行對(duì)照品(未添加DNA模板的空白組)，反應(yīng)體系均為50μL，各試劑加入量詳見表1。

為提高產(chǎn)物純度，采用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，使用的引物序列見表2。

第一輪PCR反應(yīng)程序設(shè)置為95℃預(yù)變性3min，95℃變性40sec，55℃退火30sec，72℃鏈延長(zhǎng)40sec，72℃穩(wěn)定3min，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。第二輪PCR反應(yīng)程序設(shè)置為95℃預(yù)變性3min，95℃變性40sec，50℃退火30sec，72℃鏈延長(zhǎng)40sec，72℃穩(wěn)定3min，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

213例DNA提取樣品中，一次擴(kuò)增不成功的樣品將進(jìn)行第二次擴(kuò)增，以排除PCR實(shí)驗(yàn)誤差。若兩次擴(kuò)增均未成功(相應(yīng)位置沒有呈現(xiàn)條帶)，則認(rèn)為該樣品的DNA提取步驟未成功。

PCR擴(kuò)增結(jié)果為：202例DNA提取樣品擴(kuò)增成功；11例樣品擴(kuò)增失敗。

表1 PCR反應(yīng)體系試劑加入量表

表2 PCR擴(kuò)增使用的引物表

步驟三：比對(duì)前S1區(qū)域中P21和P94肽段序列，確定患者感染的P21和P94基因型及相應(yīng)的氨基酸序列

委托生工生物工程(上海)股份有限公司，對(duì)202例PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序引物序列為GGTTGGTCTTCCAAACCTCG(SEQ ID NO:7)，單向測(cè)通，測(cè)序片段長(zhǎng)度約600bp。將各樣本的測(cè)序結(jié)果翻譯為氨基酸序列后，分別與P21和P94的參照序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定感染B基因型的患者血清樣本14例。

步驟四：將P21B基因型和P94B基因型肽段偶聯(lián)大蛋白，以提高其免疫原性。

分別訂購B基因型的P21和P94肽段，并將其偶聯(lián)KLH大蛋白；訂購B基因型的PreS1全長(zhǎng)肽段(安比奇生物科技有限公司)。

P21(B基因型)肽段序列為(SEQ ID NO:1)：PLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNP

P94(B基因型)肽段序列為(SEQ ID NO:2)：PASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHP

PreS1全長(zhǎng)(B基因型)肽段序列為(SEQ ID NO:8)：

MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPHKDNWPDANKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGLLTTVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPQA

步驟五：組合包被P21-KLH和P94-KLH肽段，ELISA檢測(cè)感染B基因型的患者血樣14個(gè)。

將B基因型P21-KLH肽段和B基因型P94-KLH肽段在0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液中以濃度10μg/ml稀釋后，在96孔板(NEST)上包被過夜。用含1％BSA的PBS溶液將待測(cè)血清樣本稀釋125倍，37℃孵育1h。酶標(biāo)二抗(從山羊體內(nèi)分離出的人IGg抗體，目錄號(hào)A-8667，Sigma Aldrich)稀釋20000倍后，37℃孵育1h。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的TMB作為顯色底物，室溫孵育20min后，2M H₂SO₄終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后10min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD₄₅₀的值。

每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。

步驟六：?jiǎn)我话籔reS1全長(zhǎng)肽段，ELISA檢測(cè)感染B基因型的患者血樣14個(gè)。

將PreS1全長(zhǎng)肽段在0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液中以濃度10μg/ml稀釋后，在96孔板(NEST)上包被過夜。用含1％BSA的PBS溶液將待測(cè)血清樣本稀釋125倍，37℃孵育1h。酶標(biāo)二抗(從山羊體內(nèi)分離出的人IGg抗體，目錄號(hào)A-8667，Sigma Aldrich)稀釋20000倍后，37℃孵育1h。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的TMB作為顯色底物，室溫孵育20min后，2M H₂SO₄終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后10min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD₄₅₀的值。

每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。

步驟七：?jiǎn)我话籔21-KLH肽段，ELISA檢測(cè)感染B基因型的患者血樣14個(gè)。

將P21-KLH肽段在0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液中以濃度10μg/ml稀釋后，在96孔板(NEST)上包被過夜。用含1％BSA的PBS溶液將待測(cè)血清樣本稀釋125倍，37℃孵育1h。酶標(biāo)二抗(從山羊體內(nèi)分離出的人IGg抗體，目錄號(hào)A-8667，Sigma Aldrich)稀釋20000倍后，37℃孵育1h。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的TMB作為顯色底物，室溫孵育20min后，2M H₂SO₄終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后10min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD₄₅₀的值。

每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。

步驟八：?jiǎn)我话籔94-KLH肽段，ELISA檢測(cè)感染B基因型的患者血樣14個(gè)。

將P94-KLH肽段在0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液中以濃度10μg/ml稀釋后，在96孔板(NEST)上包被過夜。用含1％BSA的PBS溶液將待測(cè)血清樣本稀釋125倍，37℃孵育1h。酶標(biāo)二抗(從山羊體內(nèi)分離出的人IGg抗體，目錄號(hào)A-8667，Sigma Aldrich)稀釋20000倍后，37℃孵育1h。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的TMB作為顯色底物，室溫孵育20min后，2M H₂SO₄終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后10min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD₄₅₀的值。

每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。

步驟九：利用SPSS軟件分析組合兩肽段組合檢測(cè)能否代替全長(zhǎng)檢測(cè)特異性抗體。

為驗(yàn)證組合兩肽段檢測(cè)能否代替全長(zhǎng)檢測(cè)特異性抗體，本專利利用SPSS 19.0軟件對(duì)HBV患者血清中PreS1抗體的檢測(cè)吸光度值進(jìn)行顯著性分析，采用t檢驗(yàn)法，置信度為95％。

(1)質(zhì)量比：組合P21&P94-KLH肽段、單一PreS1全長(zhǎng)肽段、單一P21-KLH、單一P94-KLH的包被濃度均為10μg/ml，即目標(biāo)包被抗原的質(zhì)量相同。

(2)摩爾數(shù)比：P21含有27個(gè)氨基酸，P94含有24個(gè)氨基酸，PreS1全長(zhǎng)含有119個(gè)氨基酸，KLH約由3400個(gè)氨基酸組成。

因此組合P21&P94-KLH的摩爾數(shù)僅為PreS1全長(zhǎng)的3.5％，證明P21&P94-KLH肽段的抗體捕捉能力更強(qiáng)。

(3)顯著性分析：(其中顯著性均為t檢驗(yàn)的單邊檢驗(yàn))

P21&P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果分析如表3所示。

表3 P21&P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)包被檢測(cè)吸光度值顯著性分析結(jié)果

包被P21&P94-KLH檢測(cè)的抗體濃度大于包被PreS1全長(zhǎng)檢測(cè)的抗體濃度(除11號(hào))(圖1、圖2)，兩種包被方式之間的顯著性均小于0.05(*)(圖3)。證明兩表位肽段組合可以提高抗體檢測(cè)的靈敏度，且P21和P94兩個(gè)表位可以較好地覆蓋PreS1抗體的抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，即P21和P94兩表位肽段組合可以有效地代替代替全長(zhǎng)肽段用于PreS1抗體檢測(cè)。

P21-KLH與PreS1全長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果分析如表4所示。

表4 P21-KLH與PreS1全長(zhǎng)包被檢測(cè)吸光度值顯著性分析結(jié)果

表5 P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)包被檢測(cè)吸光度值顯著性分析結(jié)果

P21-KLH與PreS1全長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果分析如表4所示。其中12例樣本包被P21-KLH檢測(cè)的抗體濃度大于包被PreS1全長(zhǎng)檢測(cè)的抗體濃度，2例樣本(11號(hào)和14號(hào))包被P21-KLH檢測(cè)的抗體濃度略小于包被PreS1全長(zhǎng)檢測(cè)的抗體濃度(圖1、圖3)；其中13例樣本的兩種包被方式之間的顯著性均小于0.05(*)，1例樣本(12號(hào))的顯著性大于0.05(圖5)。P94-KLH與PreS1全長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果分析如表5所示。其中1例樣本(1號(hào))包被P94-KLH檢測(cè)的抗體濃度大于包被PreS1全長(zhǎng)檢測(cè)的抗體濃度，其余13例樣本包被P94-KLH檢測(cè)的抗體濃度小于包被PreS1全長(zhǎng)檢測(cè)的抗體濃度(圖1、圖3)；其中11例樣本的兩種包被方式之間的顯著性均小于0.05(*)，3例樣本(5號(hào)、7號(hào)、8號(hào))的顯著性大于0.05(圖6)。單一包被P21-KLH或P94-KLH時(shí)檢測(cè)抗體與包被全長(zhǎng)檢測(cè)抗體的顯著性關(guān)系不唯一，證明PreS1抗體的抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)主要位于P21和P94兩個(gè)表位上，而單一的P21表位或P94表位不能夠有效地覆蓋PreS1抗體的全部抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，即單一的P21表位或P94表位不能有效地代替全長(zhǎng)肽段用于PreS1抗體檢測(cè)。

綜上所述，通過全長(zhǎng)肽段中兩個(gè)重要表位肽段組合作為抗原的方式檢測(cè)特異性抗體，可以有效地覆蓋抗原抗體的全部抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，可以有效地代替全長(zhǎng)肽段用于PreS1抗體檢測(cè)，還可以提高抗體的檢測(cè)靈敏度。

實(shí)施例2：以兩表位肽段組合作為抗原刺激小鼠制備單克隆抗體

步驟一：多肽合成及偶聯(lián)

合成P21和P94表位肽段，各肽段分別偶聯(lián)KLH和BSA。偶聯(lián)KLH的肽段將分別用于免疫兩組動(dòng)物，而BSA偶聯(lián)復(fù)合物將用于篩選，以排除針對(duì)KLH的抗體反映。

步驟二：動(dòng)物免疫

1)第一次免疫：以P21-KLH和P94-KLH按照1:1組合，作為組合抗原分別免疫動(dòng)物，與弗氏完全佐劑(MP公司產(chǎn)品，Cat No.642852)等體積進(jìn)行混合乳化，皮下初次免疫6只Balb/C小鼠，用量為60μg蛋白/200μl/只小鼠。

2)第二次免疫：皮下免疫，用弗氏不完全佐劑(MP公司產(chǎn)品，Cat No.642862)與組合抗原等體積混合乳化，免疫量為30μg蛋白/200μl/只小鼠。

3)第一次取血：眼眶取血100μl，室溫放置半小時(shí)后，2000g離心5分鐘，收集血清，用于測(cè)定血清滴度，測(cè)定完畢，放-20℃低溫保存。

4)第三次免疫:同步驟2)的第二次免疫。

5)第二次取血：同步驟3)的第一次取血。

6)第四次免疫：同步驟2)的第二次免疫。

7)第三次取血：同步驟3)的第一次取血。

步驟三：血清滴度測(cè)定

步驟四：與臨床樣本比對(duì)篩選和確認(rèn)

步驟五：沖擊免疫

根據(jù)小鼠血清與臨床樣本比對(duì)評(píng)估結(jié)果，選取小鼠進(jìn)行沖擊免疫。沖擊免疫步驟為：將多肽偶聯(lián)KLH蛋白取出50ng，用生理鹽水稀釋為0.3ml，用1ml注射器注射到小鼠腹腔，這個(gè)過程操作需要緩慢，避免刺破小鼠腸道。

步驟六：細(xì)胞融合

步驟七：陽性克隆篩選

步驟八：雜交瘤細(xì)胞株的篩選和確認(rèn)

步驟九：雜交瘤細(xì)胞株的亞克隆

結(jié)果表明，將組合抗原作為抗原刺激小鼠免疫系統(tǒng)，在小鼠體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，通過篩選克隆可以得到特異性的B基因型單克隆抗體。

綜上，組合P21-KLH和P94-KLH兩表位肽段作為一個(gè)組合抗原代替全長(zhǎng)肽段作為抗原刺激機(jī)體，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的PreS1抗體，有利于機(jī)體對(duì)抗病毒侵染，起到疫苗的作用。因此為了預(yù)防乙肝病毒的感染，可用該組合抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)乙肝疫苗(滅活病毒、基因重組表達(dá)抗原等)制備新型疫苗，有三點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：(1)組合抗原為多表位小肽偶聯(lián)KLH等大蛋白，顯著增強(qiáng)了抗原的免疫原性，與原來的全長(zhǎng)肽段相比，可以更好地刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體；(2)組合抗原疫苗更為純凈，刺激機(jī)體后產(chǎn)生的副反應(yīng)較?。涸摻M合抗原僅為固相合成的氨基酸片段，相比于滅活病毒，會(huì)大大減少病毒致病因素；(3)組合抗原疫苗更易于純化制得：相比于滅活病毒和基因重組表達(dá)抗原，組合抗原在肽段制備時(shí)可選擇明確的氨基酸序列，因此可大大簡(jiǎn)化后期純化的過程。因此，利用組合抗原制備新型疫苗可解決傳統(tǒng)疫苗制備中副反應(yīng)較大和后期純化過程復(fù)雜的問題，并且組合抗原可以代替完整的病原微生物會(huì)增強(qiáng)疫苗的免疫針對(duì)性。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種以多表位肽段組合抗原刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ala

1 5 10 15

Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro

20 25

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser

1 5 10 15

Pro Pro Leu Arg Asp Thr His Pro

20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggtcaccat attcttggga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccccgcctgt aacacgagca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgggaacaa gatctacagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcctgatgc gatgttctcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggttggtctt ccaaacctcg 20

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu

1 5 10 15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

20 25 30

Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His

35 40 45

Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly

50 55 60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

65 70 75 80

Ala Gln Gly Leu Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

85 90 95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu

100 105 110

Arg Asp Thr His Pro Gln Ala

115