本發(fā)明屬于農(nóng)用殺菌劑，具體的說是一種應用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的報告系統(tǒng)及其應用。

背景技術(shù)：

ⅲ型分泌系統(tǒng)對病原細菌，包括植物、動物以及人類致病細菌致病性的發(fā)揮均具有重要意義。在適宜的環(huán)境條件下，當病原細菌與宿主接觸，ⅲ型分泌系統(tǒng)在相關(guān)基因的調(diào)控下，形成針管狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的基座錨定于細菌的壁膜結(jié)構(gòu)上，尖端則溶解宿主細胞的細胞壁及細胞膜，進入細胞內(nèi)部，隨后將細菌細胞內(nèi)合成的多種致病效應蛋白通過針管結(jié)構(gòu)導入被侵染細胞內(nèi)。這些致病效應蛋白能夠破壞被侵染細胞的正常生理代謝反應，最終導致細胞裂解，表現(xiàn)出發(fā)病癥狀。

相關(guān)研究已經(jīng)證明，ⅲ型分泌系統(tǒng)是病原細菌致病的必要條件，如果ⅲ型分泌系統(tǒng)的正常功能受到干擾破壞，病原細菌就會喪失致病性，因此可以使用ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑來防治植物細菌性病害。已經(jīng)有研究人員針對ⅲ型分泌系統(tǒng)的特點設(shè)計了不同的方案來篩選其抑制劑，例如采用免疫學的方法，具體采用酶聯(lián)免疫、蛋白雜交等方法，其操作步驟、結(jié)果檢查方法相對復雜、繁瑣，導致篩選效率相對較低。

仲胺是很多天然產(chǎn)物以及生物活性分子的合成子，同時也是現(xiàn)代醫(yī)藥及農(nóng)藥的關(guān)鍵活性官能團。專利wo2009145829a1中公開了用于醫(yī)藥領(lǐng)域的、包括仲胺類化合物在內(nèi)的多種人工合成的不同結(jié)構(gòu)類型的化合物，作為ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑來治療人類疾病。但其并沒有記載以及論證其可作為植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑，并用于農(nóng)用殺菌劑領(lǐng)域中的記載。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了更加有效的防治植物細菌性病害，進一步豐富細菌性病害防治藥劑的種類，本發(fā)明提供了一種應用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的報告系統(tǒng)及其應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種應用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的報告系統(tǒng)，系統(tǒng)含報告病原菌和報告載體，其中，報告病原菌內(nèi)含植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)，報告載體為含有β-內(nèi)酰胺酶合成基因以及iii型分泌系統(tǒng)信號肽的表達載體；所述報告載體轉(zhuǎn)入所述植物病原細菌中后，所述報告載體中的iii型分泌系統(tǒng)信號肽能與報告病原菌中的ⅲ型分泌系統(tǒng)共同作用，使所述報告載體的β-內(nèi)酰胺酶合成基因合成的β-內(nèi)酰胺酶外泌。

所述報告病原菌不具有合成β-內(nèi)酰胺酶的能力；即所述報告病原菌自身基因組中帶有β-內(nèi)酰胺酶合成基因，需通過突變處理，將帶有的β-內(nèi)酰胺酶合成基因得以破壞(報告病原菌如果自身基因組帶有β-內(nèi)酰胺酶合成基因，則需要采用缺失突變或者插入突變等方法對其進行破壞，避免對報告系統(tǒng)的干擾)。

所述報告病原菌為引起瓜類細菌性果斑病的西瓜食酸菌的β-內(nèi)酰胺酶合成基因penp的缺失突變體acidovoraxcitrulli△penp。

所述報告病原菌為缺失penp第224至815位堿基序列的缺失突變體，即a.citrulliδpenp。其在第224至815位堿基序列突變是為了確保破壞報告病原菌基因組合成β-內(nèi)酰胺酶的能力，從而確保報告病原菌細胞內(nèi)合成的β-內(nèi)酰胺酶均來自于報告載體，并且在ⅲ型分泌系統(tǒng)信號肽的協(xié)助下通過報告病原菌的ⅲ型分泌系統(tǒng)向細胞外分泌。

所述系統(tǒng)能在ph為5.2-6.5、且含有5mm-25mmmgcl2的lb(luria-bertani)培養(yǎng)液中，于25-35℃條件下，所述報告系統(tǒng)中ⅲ型分泌系統(tǒng)正常表達，使報告載體上合成的β-內(nèi)酰胺酶在ⅲ型分泌系統(tǒng)信號肽的協(xié)助下通過ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌至細胞外。

進一步的說，所述報告病原菌為引起瓜類細菌性果斑病的西瓜食酸菌(acidovoraxcitrulli)β-內(nèi)酰胺酶合成基因缺失突變體，在本系統(tǒng)中，將acidovoraxcitrulli中的β-內(nèi)酰胺酶合成基因命名為penp，對應的突變體表示為acidovoraxcitrulli△penp。野生型a.citrulli已經(jīng)完成全基因組測序，本系統(tǒng)中涉及的分子操作所使用的基因組信息均來自發(fā)表于ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫的a.citrulli全基因組(nc_008752.1)。因為野生型西瓜食酸菌a.citrulli基因組本身帶有β-內(nèi)酰胺酶合成基因penp(geneid:4667746)，合成的β-內(nèi)酰胺酶penp通過ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌至細胞外，水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，從而使野生型a.citrulli表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性。為了避免野生型a.citrulli基因組上penp基因?qū)Ρ竞Y選報告系統(tǒng)的干擾，因此采用缺失突變的方法，缺失penp第224至815位堿基序列，最終獲得野生型a.citrulli的β-內(nèi)酰胺酶合成基因penp的缺失突變體，即a.citrulliδpenp，作為篩選系統(tǒng)中的報告菌。

可選地，上述報告載體中含有的β-內(nèi)酰胺酶合成基因與報告病原菌源于同一病菌。當然，報告載體中含有的β-內(nèi)酰胺酶合成基因也可采用其它病菌中的β-內(nèi)酰胺酶合成基因，只要能實現(xiàn)本發(fā)明目的，所述報告載體和報告病原菌來源不受限定。

本發(fā)明中用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑篩選的報告系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括：首先構(gòu)建報告病原菌，所述報告病原菌包括ⅲ型分泌系統(tǒng)，以及含有a.citrulli中β-內(nèi)酰胺酶合成基因penp和ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白n端信號肽合成基因的報告載體pzac-3502sig-penp；通過三親交配將報告載體轉(zhuǎn)入a.citrulliδpenp，構(gòu)成a.citrulliδpenp(pzac-3502sig-penp)。

進一步說，所述系統(tǒng)為以侵染甜瓜引起細菌性果斑病的acidovoraxcitrulli作為防治對象，首先構(gòu)建其β-內(nèi)酰胺酶合成基因penp的缺失突變體a.citrulliδpenp，同時，以質(zhì)粒pbbr1mcs-2為基礎(chǔ)，克隆pzlq質(zhì)粒的ptrc啟動子、多克隆位點(mcs)、3xflag標簽、終止子(terminator)區(qū)域，新質(zhì)粒命名為pzac，再將penp連同acidovoraxcitrulli的ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白aave_3502(geneid:4665435)n端180個堿基的信號肽合成基因(命名為3502sig)按閱讀框順序連接至pzac成為報告載體，命名為pzac-3502sig-penp，再將其通過三親交配的方式轉(zhuǎn)化進入a.citrulliδpenp，構(gòu)成a.citrulliδpenp(pzac-3502sig-penp)。

本發(fā)明還提供了一種所述的應用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的報告系統(tǒng)在篩選植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑中的應用。

進一步的說，利用報告系統(tǒng)在采用高通量的方式篩選ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑中的應用；

其中，報告系統(tǒng)以96孔細胞培養(yǎng)板為載體應用在高通量(高通量即在96孔細胞培養(yǎng)板或是更多孔的細胞培養(yǎng)板)的篩選方式中在篩選ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑的應用。

一種利用所述的報告系統(tǒng)高通量篩選細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑的方法：

使待篩選物與所述應用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的報告系統(tǒng)混合，共同培養(yǎng)，形成測試體系；且所述報告載體中的iii型分泌系統(tǒng)信號肽能與報告病原菌中的ⅲ型分泌系統(tǒng)共同作用，使所述報告載體的β-內(nèi)酰胺酶合成基因合成的β-內(nèi)酰胺酶外泌；

向所述測試體系中加入顯色底物，通過所述顯色底物的顏色變化以判斷所述待篩選物是否具有抑制植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)性能。

所述報告病原菌為引起瓜類細菌性果斑病的西瓜食酸菌的β-內(nèi)酰胺酶合成基因penp的缺失突變體acidovoraxcitrulli△penp；

所述顯色底物為頭孢硝噻吩；

待篩選物與所述應用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的報告系統(tǒng)混合，于ph為5.2-6.5、且含有5mm-25mmmgcl2的lb(luria-bertani)培養(yǎng)液中，在25-35℃條件下共同培養(yǎng)。

進一步的所說，在96孔細胞培養(yǎng)板中將待篩選物與上述報告系統(tǒng)混合，在誘導條件下對細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)進行誘導培養(yǎng)，誘導結(jié)束后向混合物中加入β-內(nèi)酰胺酶的顯色底物頭孢硝噻吩，通過培養(yǎng)液顏色的變化，判斷待篩選物是否為抑制病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制劑。利用待篩選物是否引起報告系統(tǒng)中的β-內(nèi)酰胺酶通過ⅲ型分泌系統(tǒng)信號肽協(xié)助下分泌至細胞外使培養(yǎng)液中頭孢硝噻吩得以裂解，進而改變培養(yǎng)液顏色，從而高通量的判斷待篩選物是否為抑制病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制劑。

所述培養(yǎng)液顏色無變化，即待篩選物為抑制病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制劑。

一種仲胺類化合物在作為細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑中的應用，仲胺類化合物作為植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑中的應用。

一種植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑篩選的報告系統(tǒng)的應用，所述系統(tǒng)在高通量篩選ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑中的應用。

一種利用所述的報告系統(tǒng)高通量篩選細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑的方法，將待篩選物與上述報告系統(tǒng)混合共同誘導培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板，誘導培養(yǎng)過程中加入β-內(nèi)酰胺酶的顯色底物頭孢硝噻吩，利用待篩選物是否引起報告系統(tǒng)中的β-內(nèi)酰胺酶通過ⅲ性分泌系統(tǒng)信號肽協(xié)助下分泌至細胞外使培養(yǎng)液中頭孢硝噻吩得以裂解，進而改變培養(yǎng)液顏色，從而高通量的判斷待篩選物是否為抑制病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制劑。所述培養(yǎng)液顏色無變化，即待篩選物為抑制病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制劑。所述待篩選物與上述報告系統(tǒng)混合在ph5.8含有mgcl2的lb培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)。

具體為：以侵染甜瓜引起果斑病的acidovoraxcitrulli作為防治對象獲得帶有報告載體pzac-3502sig-penp的a.citrulliδpenp系統(tǒng)；上述帶有報告載體的系統(tǒng)在適宜條件下與待篩選物在培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)48h，之后向培養(yǎng)液中加入β-內(nèi)酰胺酶的顯色底物頭孢硝噻吩，β-內(nèi)酰胺酶能夠裂解頭孢硝噻吩，導致頭孢硝噻吩溶液的顏色由橙黃色變?yōu)樯罴t色。如果待篩選物對ⅲ型分泌系統(tǒng)沒有抑制作用，β-內(nèi)酰胺酶在ⅲ型分泌系統(tǒng)信號肽的協(xié)助下，能夠通過ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌至細胞外的培養(yǎng)液中，對頭孢硝噻吩進行裂解，導致溶液顏色由橙黃色變?yōu)樯罴t色。相反的，如果待篩選物抑制了ⅲ型分泌系統(tǒng)的正常功能，β-內(nèi)酰胺酶不能分泌至細胞外的溶液中，頭孢硝噻吩不會被裂解，溶液顏色仍舊保持橙黃色。因此通過溶液顏色的變化，就可以判斷化合物的生物活性。對該篩選體系進行優(yōu)化設(shè)計，在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)完成化合物與病原細菌共同培養(yǎng)和顯色反應的過程，使用酶標儀對顯色反應的結(jié)果進行檢查，進一步提高該體系的篩選效率，使其單次篩選效率達到800個待篩選物，完成一次篩選周期為48小時，成為一種ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑的高通量篩選體系。

一種仲胺類化合物在作為細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑中的應用，仲胺類化合物作為植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑中的應用。

所述仲胺類化合物通式如下所示：

式中：

式中：

a1、a2、a3分別獨立相同或不同的選自cr3或n；

r1選自氫、鹵原子、硝基、氰基、conh2、ch2conh2、ch2cn、c1-c12烷基、鹵代c1-c12烷基、c1-c12烷氧基、鹵代c1-c12烷氧基、c1-c12烷硫基、c1-c12烷磺?；?、c1-c12烷基羰基、c1-c12烷氧基c1-c12烷基、c1-c12烷氧基羰基、c1-c12烷氧基羰基c1-c12烷基、c1-c12鹵代烷氧基c1-c12烷基，被一個或多個r3進一步取代的胺基c1-c12烷基、芳基、雜芳基、芳氧基、芳基c1-c12烷基、芳基c1-c12烷基氧基、雜芳基c1-c12烷基、雜芳基c1-c12烷氧基；

r2選自被一個或多個r3進一步取代的苯環(huán)、吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)或呋喃環(huán)；

r3選自氫、鹵原子、硝基、氰基、conh2、ch2conh2、ch2cn、c1-c12烷基、鹵代c1-c12烷基、c1-c12烷氧基、鹵代c1-c12烷氧基、c1-c12烷硫基、c1-c12烷磺?；?、c1-c12烷基羰基、c1-c12烷氧基c1-c12烷基、c1-c12烷氧基羰基、c1-c12烷氧基羰基c1-c12烷基或c1-c12鹵代烷氧基c1-c12烷基。進一步可選，所述仲胺類化合物為，通式i中：

a1、a2、a3分別獨立選自cr3；

r1選自氫、鹵原子、硝基、氰基、c1-c6烷基、鹵代c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、鹵代c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷磺?；?、c1-c6烷基羰基、c1-c6烷氧基c1-c12烷基、c1-c6烷氧基羰基、c1-c6烷氧基羰基c1-c6烷基或c1-c6鹵代烷氧基c1-c6烷基；

r2選自被一個或多個r3進一步取代的苯環(huán)、吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)或呋喃環(huán)；

r3選自鹵原子、硝基、氰基、c1-c6烷基、鹵代c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、鹵代c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷磺?；?、c1-c6烷基羰基、c1-c6烷氧基c1-c12烷基、c1-c6烷氧基羰基、c1-c6烷氧基羰基c1-c6烷基或c1-c6鹵代烷氧基c1-c6烷基。

所述更進一步優(yōu)選的仲胺類化合物為，通式i中：

a1、a2、a3分別獨立選自cr3；

r1選自氫、鹵原子、硝基、氰基、c1-c6烷基或鹵代c1-c6烷基；

r2選自被一個或多個r3進一步取代的苯環(huán)、吡啶環(huán)、噻唑環(huán)、噻吩環(huán)或呋喃環(huán)；

r3選自鹵原子、硝基、氰基、c1-c6烷基、鹵代c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、鹵代c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基或c1-c6烷磺?；?。

一種殺菌劑組合物，以上述篩選獲得如通式(ⅰ)所示化合物作為活性組分；其中，組合物中活性組分的重量含量為0.1-99％。

上面給出的通式(ⅰ)的定義中，匯集所用術(shù)語一般代表如下取代基：

鹵：指氟、氯、溴、碘。

烷基：直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基。

鹵代烷基：直鏈或支鏈烷基，其上的氫原子可以部分或者全部被鹵素原子所取代，例如氟甲基、氯甲基、溴甲基、二氟甲基、二氯甲基、三氟甲基、三氯甲基。

烷氧基：直鏈或支鏈烷基，經(jīng)氧原子鍵連接到結(jié)構(gòu)上。

鹵代烷氧基：直鏈或支鏈烷氧基，在這些烷氧基上的氫原子可以全部或者部分被鹵素原子所取代。例如，氟甲氧基、氯甲氧基、二氟甲氧基、二氯甲氧基、三氟甲氧基、三氯甲氧基、氟氯甲氧基。

鏈烯基：直鏈或者支鏈并可在任何位置上存在有雙鍵，例如乙烯基、烯丙基。取代鏈烯基包括任意取代的芳基鏈烯基。

炔基：直鏈或支鏈并可在任何位置上存在有三鍵，例如乙炔基、炔丙基，取代炔基包括任意取代的芳炔基。

芳基以及芳烷基、芳基鏈烯基、芳炔基、芳氧基和芳氧基烷基中的芳基部分包括苯基和萘基。

苯氧基、芐氧基、苯基、芐基中取代基為氫，烷基、烷氧基、鹵代烷基、鹵代烷氧基、鹵素、硝基等，取代基的數(shù)目可為0-5。

上述所指雜芳基是含一個或多個n、o、s雜原子的五元環(huán)或者六元環(huán)，例如吡啶、呋喃、嘧啶、吡嗪、噠嗪、三嗪、喹啉、苯并呋喃。

上述化合物中，由于碳-碳雙鍵和碳-氮雙鍵連接不同的取代基而可形成幾何異構(gòu)體(分別以z和e來表示不同的構(gòu)型)。本發(fā)明包括z型異構(gòu)體和e型異構(gòu)體及其任何比例的混合物。

上述篩選獲得化合物具有優(yōu)異的殺細菌活性，它們可以通過葉面噴霧、種子處理等方式來防治多種植物細菌性病害，特別適合于防治下列病害：甜瓜果斑病、黃瓜細菌性角斑病、大白菜軟腐病、水稻白葉枯病、水稻細菌性條斑病、柑橘潰瘍病、番茄青枯病、番茄細菌性葉斑病等。

由上述獲得化合物可作為殺細菌組合物，在組合物中含有0.1-99％重量的通式(ⅰ)的化合物及其立體異構(gòu)體的活性組分。本發(fā)明組合物中的載體是滿足如下條件的物質(zhì)：它與活性成分組合配制后便于在待處理位點的使用，例如植株葉片、種子以及土壤；同時有利于儲存、運輸、操作。載體可以是固體或液體，包括通常為氣體但是已經(jīng)壓縮成液體的物質(zhì)，通常在配制殺菌組合物中所用的載體都可以使用。

可將本發(fā)明的殺細菌組合物配制為可直接噴霧溶液、粉末、懸浮液、高度濃縮的水性、油性或其它懸浮液、分散體、乳液、油分散體、糊、粉劑、撒播用混合物或顆粒，且可通過噴霧、霧化、撒粉、撒播、或傾倒等方式施用。施用形式取決于特定目的；在各種情況下，應確保本發(fā)明組合物精細且均勻分布。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

本發(fā)明針對ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑的篩選，以β-內(nèi)酰胺酶與顯色底物頭孢硝噻吩的相互作用為基礎(chǔ)，提出了一種全新的高通量篩選方法，具體通過人工誘導細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)表達，將報告載體基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運至細胞外，與顯色底物反應，根據(jù)顏色變化來判斷ⅲ型分泌系統(tǒng)是否受到抑制；并且利用該方法發(fā)現(xiàn)了一類仲胺類ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑。

采用本發(fā)明的方法可高通量篩選以化合物作為細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑，篩選獲得化合物通過抑制ⅲ型分泌系統(tǒng)使病原細菌喪失致病能力，從而達到防治病害的目的。尤其對甜瓜細菌性果斑病、黃瓜細菌性斑點病、番茄青枯病、水稻白葉枯病等細菌性病害都有很好的防治效果。

可選地，本發(fā)明構(gòu)建專門用于ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑篩選的報告系統(tǒng)，建立了專門針對a.citrulli中ⅲ型分泌系統(tǒng)表達的最佳誘導條件，并選擇理想的顯色底物作為檢測手段，其基本原理不同于已有的篩選方法，同時具有操作步驟簡便、篩選效率高、結(jié)果檢測準確、直觀的特點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的報告載體pzac-3502sig-penp示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例提供的本發(fā)明高通量篩選體系的技術(shù)路線圖。

具體實施方式

以下以具體的實例來進一步說明本發(fā)明。

實施例1

以侵染甜瓜引起果斑病的acidovoraxcitrulli作為防治對象，

所述報告病原菌為缺失β-內(nèi)酰胺酶合成基因penp(ncbigeneid:4667746,)的引起瓜類細菌性果斑病的西瓜食酸菌(acidovoraxcitrulli)(ncbiaccession:nc_008752.1)的缺失突變體。即，缺失penp第224至815位堿基序列的西瓜食酸菌，即a.citrulliδpenp。

具體：根據(jù)西瓜食酸菌(a.citrulli)基因組信息(ncbiaccession:nc_008752.1)，設(shè)計β-內(nèi)酰胺酶penp(ncbigeneid:4667746)上下游pcr引物，上游一對pcr引物序列為penp-f1:tagaattctggtgagcaggcgc和penp-r1:taggatccgtttgaaggtgctgcac；下游一對pcr引物為penp-f2：taggatccggagcagcgcg和penp-r2:tatctagaggcatccgcaccg。經(jīng)pcr擴增penp上下游堿基片段，而后將擴增片段連接至具有卡那霉素抗性的自殺載體psr47s，連接載體后再通過三親交配轉(zhuǎn)化進入經(jīng)人工誘導具有利福霉素抗性的西瓜食酸菌(a.citrulli)，之后在同時含有利福霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選獲得一次重組菌株，然后脫離抗生素進行繼代培養(yǎng)，將培養(yǎng)物分別在只含有利福霉素以及同時含有利福霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基上對應培養(yǎng)，獲得只在利福霉素培養(yǎng)基上生長而不能在同時含有利福霉素和卡那霉素培養(yǎng)基上生長的，丟失卡那霉素抗性的二次重組突變體，使用前文提到的penp基因引物對penp-f1和penp-r2對penp基因缺失突變體進行pcr檢查，正確的菌株命名為a.citrulli△penp。

報告載體以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，使用商品化質(zhì)粒pbbr1mcs-2為基礎(chǔ)，克隆pzlq質(zhì)粒的ptrc啟動子、多克隆位點(mcs)、3xflag標簽、終止子(terminator)區(qū)域，新質(zhì)粒命名為pzac，再將penp連同acidovoraxcitrulli的ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白aave_3502(geneid:4665435)_n端180個堿基的信號肽合成基因(命名為3502sig)按閱讀框順序連接至pzac成為報告載體，命名為pzac-3502sig-penp，再將其通過三親交配的方式轉(zhuǎn)化進入a.citrulliδpenp。構(gòu)成a.citrulliδpenp(pzac-3502sig-penp)(參見圖2)。

實施例2

參見圖1，植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)抑制劑的高通量篩選方法為：將培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期的報告系統(tǒng)a.citrulliδpenp(pzac-3502sig-penp)使用ph5.8，含有10mmmgcl2的lb(luria-bertani)培養(yǎng)液，稀釋100倍，按照每孔200μl分裝至96孔細胞培養(yǎng)板，再向板孔中分別加入終濃度為100μg/ml的待篩選化合物溶液，于28℃，培養(yǎng)48h，向板孔中加入終濃度為25μg/ml的頭孢硝噻吩溶液，根據(jù)溶液顏色變化來判斷化合物生物活性。如果溶液顏色保持橙黃色，說明化合物對ⅲ型分泌系統(tǒng)有抑制作用，報告系統(tǒng)在細胞內(nèi)合成的β-內(nèi)酰胺酶不能通過ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌至細胞外裂解頭孢硝噻吩。如果溶液顏色由橙黃色變?yōu)樯罴t色，表明化合物對ⅲ型分泌系統(tǒng)沒有抑制作用，報告載體在細胞內(nèi)合成的頭孢硝噻吩能夠通過ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌至細胞外裂解頭孢硝噻吩。由于紅色在500nm具有最大光吸收，可以用酶標儀對篩選結(jié)果進行檢測。每塊96孔細胞培養(yǎng)板除去對照板孔，可篩選80個化合物，試驗設(shè)置3次重復，一次試驗使用30塊細胞培養(yǎng)板，可以完成800個化合物篩選，實現(xiàn)高通量篩選。通過對大量人工合成化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)了一類如通式(ⅰ)所示的仲胺類化合物對植物病原細菌的ⅲ型分泌系統(tǒng)具有抑制作用。

所述lb(luria-bertani)培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g、酵母粉5g和nacl5g，蒸餾水定容至1l。使用鹽酸調(diào)整ph至5.8，高溫濕熱滅菌后，待用；mgcl2溶液單獨高溫濕熱滅菌，在進行篩選試驗時加入。

所述篩選獲得仲胺類化合物如下

表1通式(ⅰ)中不同取代基化合物

實施例3利用上述篩選獲得化合物作為活性組分，獲得10％水乳劑

按重量百分比計，通過上述實施例篩選獲得表1中29號化合物10％，聚乙烯醇0.8％，烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚8.5％，農(nóng)乳220116％，二甲基甲酰胺11％，乙二醇5％，水補足至100％。

實施例4利用上述篩選獲得化合物作為活性組分，獲得40％懸浮劑

按重量百分比計，通過上述實施例篩選獲得表1中56號化合物40％，木質(zhì)素磺酸鈣5％，白碳黑0.3％，乙二醇4％，消泡劑少許，水補足至100％。

實施例5利用上述篩選獲得化合物作為活性組分，獲得50％水分散粒劑

按重量百分比計，通過上述實施例篩選獲得表1中75號化合物50％，甲基萘磺酸鈉甲醛縮合物12％，環(huán)氧聚醚5％，可溶性淀粉15％，石膏補足至100％。

實施例6利用上述篩選獲得化合物作為活性組分，獲得70％可濕性粉劑

按重量百分比計，通過上述實施例篩選獲得表1中117號化合物70％，十二烷基硫酸鈉1.5％，羧甲基纖維素1％，木質(zhì)素磺酸鈉10％，輕質(zhì)碳酸鈣補足至100％。

實施例7利用上述篩選獲得化合物作為活性組分，獲得25％懸浮-乳劑濃縮物

按重量百分比計，通過上述實施例篩選獲得表1中156號化合物25％，十二烷基醇聚乙二醇磷酸酯4％，乙氧基甘油三酸酯2％，十二烷基苯磺酸鈣1.5％，環(huán)氧甲乙烷環(huán)氧丙烷共聚物2.5％，環(huán)己酮30％，烷基芳基餾分補足至100％。

實施例8對甜瓜果斑病菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制活性測定

按照前文所述的試驗方法，將待測通式(ⅰ)的化合物用少量n，n二甲基甲酰胺溶解，用水稀釋至所需要的濃度，將其與帶有ⅲ型分泌系統(tǒng)報告載體的甜瓜果斑病菌共同培養(yǎng)，48小時后加入顯色底物頭孢硝噻吩，根據(jù)顏色變化判斷化合物是否對ⅲ型分泌系統(tǒng)具有抑制作用。

部分測試結(jié)果如下：

50mg/l時，表1中化合物13，16，17，19，21，22，25，29，31，32，33，49，56，64，71，75，101，102，117，128等對甜瓜果斑病菌的ⅲ型分泌系統(tǒng)具有強烈的抑制作用。

10mg/l時，表1中化合物13，17，19，33，49，128，102等對甜瓜果斑病菌的ⅲ型分泌系統(tǒng)具有強烈的抑制作用。

實施例9對植物細菌病害防治效果的測定

用本發(fā)明的化合物對多種植物細菌性病害進行了防效測定，針對不同的細菌性病害，試驗程序如下：

甜瓜果斑病和番茄青枯病，將待測通式(ⅰ)的化合物用少量n，n二甲基甲酰胺溶解，用水稀釋至所需要的濃度。將培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期的病原細菌與定量化合物溶液混合均勻，將經(jīng)過催芽的甜瓜種子放入菌液與化合物的混合液中浸泡半小時，再將種子播種于蚯蚓土培養(yǎng)杯中，放入溫室中保濕培養(yǎng)，一般培養(yǎng)兩周時間，待對照充分發(fā)病后進行防效調(diào)查。

大白菜軟腐病，切取2厘米見方的白菜葉片，放入墊有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中。將用n，n二甲基甲酰胺溶解，并用水稀釋至所需濃度的化合物噴霧于白菜葉片表面，于通風櫥內(nèi)晾干白菜葉片表面藥液后，使用接種針在白菜葉片表面針刺造成傷口，將培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期的大白菜軟腐病菌取5微升加入傷口內(nèi)，進行接種。最后將試材放入培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48小時，待對照充分發(fā)病后進行防效調(diào)查。

黃瓜細菌性角斑病、番茄細菌性葉斑病、水稻細菌性條斑病、水稻白葉枯病，將待測化合物用少量n，n二甲基甲酰胺溶解，用水稀釋至所需要的濃度，同時將實施例4、5、6中29號、56號、75號化合物制成的制劑用水稀釋至需要的濃度。將化合物水溶液噴霧于植物試材表面，于陰涼處風干表面藥液后，將培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期的病原細菌菌液噴霧接種于植物試材表面，然后將植物試材放入溫室中保濕培養(yǎng)。通常培養(yǎng)十天左右，待對照充分發(fā)病后，進行防效調(diào)查。

部分測試結(jié)果如下：

600mg/l時，表1中化合物13，16，17，19，21，22，25，29，31，32，33，49，56，60，64，68，71，75，76，84，89，101，102，117，128，實施例4、5、6中的29號、56號、75號化合物制劑對甜瓜果斑病和番茄青枯病的防效為100％。

400mg/l時，表1中化合物13，16，17，19，21，22，25，29，31，32，33，49，56，60，64，71，75，101，117，128等對黃瓜細菌性角斑病、水稻細菌性條斑病、水稻白葉枯病的防效為100％。

200mg/l時，表1中化合物13，17，19，31，32，33，49，56，64，71，102，128等對大白菜軟腐病和番茄細菌性葉斑病的防效為100％。

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<110>沈陽中化農(nóng)藥化工研發(fā)有限公司

<120>一種應用于植物病原細菌ⅲ型分泌系統(tǒng)的報告系統(tǒng)及其應用

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