本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)潔、高效的丙谷二肽微生物合成方法，尤其涉及應(yīng)用重組基因工程酵母菌生物轉(zhuǎn)化合成丙谷二肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

丙谷二肽(L-Ala-Gln)在醫(yī)療保健等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，其更高的溶解度以及良好的熱穩(wěn)定性，已逐漸替代谷氨酰胺(L-Gln)成為主要的腸外營(yíng)養(yǎng)用藥。然而，已知的丙谷二肽合成方法主要有化學(xué)合成法和化學(xué)加生物酶催化法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)丙谷二肽的過(guò)程中一般需要引入和去除保護(hù)基團(tuán)，存在反應(yīng)步驟多、副產(chǎn)物多、試劑毒性大且非環(huán)境友好等問(wèn)題[中國(guó)專利,含L-谷氨酰胺二肽的合成方法,CN1651456；唐果.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的合成與反應(yīng)研究.廈門大學(xué),2004；中國(guó)專利,丙－谷二肽合成方法,CN1164611C]。由于化學(xué)合成法的不足，國(guó)內(nèi)外研究者嘗試在化學(xué)法基礎(chǔ)上添加生物酶如木瓜蛋白酶和青霉素G合成丙谷二肽(于清新.丙谷二肽的酶促合成研究.天津大學(xué)，2010.)。以L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽為起始物，通過(guò)引入保護(hù)基、催化合成肽鍵、脫保護(hù)基三步合成L-Ala-Gln。具體操作中利用木瓜蛋白酶的?；D(zhuǎn)移作用催化Phac-L-Ala-OMe和L-Gln合成肽鍵，再利用青霉素G酰化酶將保護(hù)基脫除得到目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-Ala-Gln。雖然其合成步驟有所簡(jiǎn)化、污染較少，但也存在用酶量大，肽生產(chǎn)率低且僅能催化部分較高疏水性氨基酸等弊端。

近年來(lái)，國(guó)外研究人員從枯草桿菌中獲得了一種氨基酸連接酶(Lal)，能夠以無(wú)保護(hù)的氨基酸作為底物合成二肽[Tabata K,Ikeda H,Hashimoto S.ywfE in Bacillus subtilis codes for a novel enzyme,l-amino acid ligase[J].Journal of bacteriology,2005,187(15):5195-5202.新的生成肽的酶、生成該酶的微生物和利用它們合成二肽的方法，CN1671840A，日本，2005.DIPEPTIDE PRODUCTION METHOD，United States Patent,2006]。但該連接酶屬于ATP依賴酶，需要外源提供ATP，使得二肽的生產(chǎn)成本仍然較高，無(wú)法在市場(chǎng)大范圍推廣使用[Tabata K,Hashimoto S.Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strain expressing L-amino acidα-ligase.Applied and environmental microbiology,2007,73(20):6378-6385.]。

CN105274174A和CN104480075A公開(kāi)了兩種利用生物酶催化生成丙谷二肽的方法，其分別采用生物酶緩沖液或生物酶凍干粉催化底物轉(zhuǎn)化為丙谷二肽，但存在酶分離純化成本高，酶活低，且難于回收利用，因此限制了其工業(yè)化應(yīng)用的可能。

CN104480172A公開(kāi)了一種利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其利用重組大腸桿菌實(shí)現(xiàn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產(chǎn)，省去了酶分離純化的成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。但由于表達(dá)的轉(zhuǎn)酯酶位于大腸桿菌胞內(nèi)，存在較大的底物和產(chǎn)物的跨膜阻力，導(dǎo)致丙谷二肽的產(chǎn)量極低，僅為0.49g/L，且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足工業(yè)化需求。為減少底物進(jìn)入細(xì)胞及產(chǎn)物擴(kuò)散到胞外的阻力，有文獻(xiàn)報(bào)道使用化學(xué)試劑對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行處理，一定程度上降低了底物的跨膜阻力(Appl.Environ.Microbiol.2007:6378–6385)，或者增加催化反應(yīng)體系中的細(xì)胞密度來(lái)提高反應(yīng)速率，但反應(yīng)時(shí)間仍然較長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低(Biosci,Biotechnol,Biochem.2013,77:618-628)。同時(shí)，丙谷二肽主要在醫(yī)療保健等領(lǐng)域，使用大腸桿菌進(jìn)行丙谷二肽的合成，可能帶來(lái)內(nèi)毒素污染等生物安全性方面問(wèn)題，難以在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一套完整的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丙谷二肽的技術(shù)方案。從尋找優(yōu)異的編碼丙谷二肽合成酶的外源性基因開(kāi)始，并期望通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建重組工程菌，并據(jù)其設(shè)計(jì)合理的生物發(fā)酵工程方案，以實(shí)現(xiàn)丙谷二肽綠色、高效、低成本的工業(yè)化生產(chǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種重組釀酒酵母，該重組釀酒酵母中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因。

另一方面，本發(fā)明也旨在提供上述重組釀酒酵母的制備方法，所述方法是將來(lái)源于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的外源性基因克隆后連接至表達(dá)載體，然后將所構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)入作為表達(dá)宿主的釀酒酵母細(xì)胞。

上述方法所制備的重組釀酒酵母可以作為全細(xì)胞催化劑高效、快速地將底物轉(zhuǎn)化為丙谷二肽，并且不需要酶的分離純化的步驟?；诖?，本發(fā)明再一方面的目的還在于提供一種丙谷二肽的生物合成方法，該方法中包括使用上述本發(fā)明的重組釀酒酵母對(duì)底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的步驟。

本發(fā)明基于新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)酯酶基因，成功構(gòu)建重組釀酒酵母細(xì)胞，使其作為全細(xì)胞催化劑將底物轉(zhuǎn)化為丙谷二肽，省去了酶的分離純化，避免了內(nèi)毒素的隱患及抗生素的使用，具有摩爾轉(zhuǎn)化率高、生產(chǎn)速率快、菌體可多次循環(huán)利用等特點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)高效、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)化生產(chǎn)丙谷二肽的良好選擇。并且可以通過(guò)循環(huán)利用的工藝過(guò)程，有望降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，解決酶回收難、利用率低且酶活不穩(wěn)定等問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明附圖6幅，其中：

圖1為酵母重組表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為重組酵母細(xì)胞表面展示生物酶的熒光和激光共聚焦驗(yàn)證圖。

圖3為不同底物濃度對(duì)酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的影響。

圖4為酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的相對(duì)酶活性隨反應(yīng)溫度變化圖。

圖5為酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的相對(duì)酶活性隨反應(yīng)pH變化圖。

圖6為酵母全細(xì)胞的相對(duì)酶活性隨循環(huán)利用次數(shù)變化圖。

具體實(shí)施方式

在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明首先確認(rèn)獲得了一段編碼丙谷二肽生物合成酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該基因的供體為鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)。

SEQ ID NO.1的基因序列編碼的一段氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。該氨基酸序列由619個(gè)氨基酸組成。與據(jù)所知最為接近的現(xiàn)有技術(shù)(ZL03817916.4)相比，有3個(gè)氨基酸發(fā)生改變：188位氨基酸由Y(酪氨酸)變?yōu)镕(苯丙氨酸)，兩者均屬于芳香族氨基酸，由不帶電荷的極性R基氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱朔菢O性R基氨基酸；546/547位氨基酸：由AP(丙氨酸/脯氨酸)變?yōu)镻S(脯氨酸/絲氨酸)，是由中性氨基酸/雜環(huán)氨基酸向雜環(huán)氨基酸/含羥基氨基酸的轉(zhuǎn)變，同時(shí)也由非極性R基氨基酸變?yōu)榱瞬粠щ姾傻臉O性R基氨基酸。進(jìn)一步酶功能域分析結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)酯酶主要有兩個(gè)功能域，分別為：Peptidase S15(44-331)和PepX_C(382-613)。其中，Peptidase S15(44-331)域，屬于X-Pro dipeptidyl-peptidase(S15family)，是潛在的轉(zhuǎn)酯酶關(guān)鍵催化中心域；而PepX_C(382-613)域，則屬于C端非催化域，但與二肽基肽酶(S9B蛋白家族的絲氨酸肽鏈外切酶)存在許多相似的結(jié)構(gòu)。雖然對(duì)其生理功能的研究需進(jìn)一步深入，但從現(xiàn)有技術(shù)中可以獲得兩個(gè)信息：蛋白質(zhì)二聚化是酶具有催化活性所必需的；酶的糖基化可影響其生理功能。本發(fā)明中SEQ ID NO.2氨基酸序列中188位氨基酸突變可能改變了酶的催化功能域；而546/547位氨基酸突變可能對(duì)蛋白質(zhì)二聚化產(chǎn)生改變，并且通過(guò)以上兩點(diǎn)，大大改變了所述酶的催化活性。

在確定上述生物酶基因的信息之后，本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)增和保存質(zhì)粒。具體地，使用大腸桿菌E.coli DH5α擴(kuò)增和保存質(zhì)粒。

在此基礎(chǔ)上，將目的基因和表達(dá)載體酶切后，經(jīng)重組構(gòu)建重組載體，優(yōu)選的載體是pYD1。然后，將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，具體方法可舉例但不限于熱擊法。繼而利用氨芐青霉素抗性基因篩選、PCR及酶切驗(yàn)證上述步驟所獲得的轉(zhuǎn)化子，保存于斜面培養(yǎng)基。為了獲得所需的重組酵母細(xì)胞，需繼續(xù)提取重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中，利用缺陷型篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子活化后接種到種子培養(yǎng)基，待菌體生長(zhǎng)至OD₆₂₀＝0.5～5.0時(shí)，轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得重組酵母細(xì)胞。原則來(lái)講，上述釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞包括所有根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可作為轉(zhuǎn)化宿主的釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述的表達(dá)宿主是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100。選擇該宿主的突出原因之一，是可以利用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)，使轉(zhuǎn)酯酶蛋白與酵母細(xì)胞壁蛋白融合，以天然構(gòu)象的形式錨定在細(xì)胞表面，相當(dāng)于酶的固定化。同其余的宿主表達(dá)相比，展示酶制備簡(jiǎn)單，省去了酶的分離純化以及固定化等步驟，有助于降低酶制劑生產(chǎn)成本。與胞內(nèi)酶相比，展示酶無(wú)底物及產(chǎn)物的跨膜阻力，并且不存在胞內(nèi)水解酶對(duì)催化產(chǎn)物丙谷二肽的降解作用。

如無(wú)特殊說(shuō)明，本發(fā)明中所述及的斜面培養(yǎng)基照此制備：酵母浸粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，瓊脂粉20.0g/L，121℃滅菌15min，冷卻后加入終濃度為10～100μg/mL的氨芐青霉素。

所述的種子培養(yǎng)基照此制備：在82mL超純水中，加入無(wú)氨基酵母氮源0.67g，如為制備固體培養(yǎng)基加入3.0g/L的瓊脂粉，121℃滅菌15min；滅菌后補(bǔ)加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，組氨酸(2.0g/L)1mL，蘇氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％葡萄糖5mL；

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基照此制備：在82mL超純水中，加入無(wú)氨基酵母氮源0.67g，121℃滅菌15min；滅菌后補(bǔ)加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，組氨酸(2.0g/L)1mL，蘇氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％半乳糖5mL；

上述種子及誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備中所述及的氨基酸混合液中含有如下組分：精氨酸0.2g/L、天冬氨酸1.0g/L、谷氨酸1.0g/L、異亮氨酸0.3g/L、賴氨酸0.3g/L、纈氨酸1.5g/L、蛋氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、絲氨酸3.75g/L、酪氨酸0.3g/L和腺嘌呤0.4g/L。

在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種丙谷二肽的生物合成方法，該方法在于使用上述本發(fā)明的重組釀酒酵母對(duì)底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的步驟。

丙谷二肽的生物合成是一項(xiàng)相對(duì)成熟的技術(shù)，其底物按照現(xiàn)有技術(shù)可描述為包括羧基組分和胺組分的底物，本發(fā)明中，所述的羧基組分選自氨基酸酯和氨基酸酰氨，最優(yōu)選L-丙氨酸甲酯氫氯化物；所述的胺組分選自氨基酸、C-保護(hù)的氨基酸和胺，優(yōu)選L-谷氨酰胺。反應(yīng)體系中的底物濃度按照反應(yīng)物的比例反應(yīng)關(guān)系設(shè)置最有利于生產(chǎn)。反應(yīng)底物濃度無(wú)上下限設(shè)置。但最高反應(yīng)物濃度在一定程度上決定于反應(yīng)底物在體系中的溶解度，并且隨著反應(yīng)底物濃度的增加，對(duì)轉(zhuǎn)化存在一定程度的抑制。本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，谷氨酰胺的溶解度最高約250mM，但我們?cè)谏a(chǎn)中可以按照高于此的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定反應(yīng)物投料量，比如用到的600mM，此時(shí)原始的反應(yīng)體系中已經(jīng)有部分是不溶的固體狀態(tài)，但隨反應(yīng)進(jìn)行，可逐步溶解，并不影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。因此，該投料方法一方面保證反應(yīng)的順利進(jìn)行，另一方面降低操作成本。作為可實(shí)施的操作方式，本發(fā)明中，所述的羧基組分和胺組分在初始反應(yīng)體系中的濃度可設(shè)置為100～600mM。

另一方面，本發(fā)明所述的合成丙谷二肽的方法中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系pH是6.0～10.0，優(yōu)選8.0～9.0。所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的溫度是10～40℃，優(yōu)選18～25℃，最優(yōu)選20～25℃。

再一方面，本發(fā)明所述的合成丙谷二肽的方法中，所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中重組釀酒酵母用量是OD₆₂₀＝0.5～5.0。

根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，上述本發(fā)明的丙谷二肽的生物合成方法的較為具體的實(shí)施方式之一，可以描述為包括下述操作步驟的方法：

(1)將底物L(fēng)-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(L-Ala-OMe)和L-谷氨酰胺(L-Gln)溶于溶劑體系中，并調(diào)節(jié)pH為8.0～9.0；

(2)將重組釀酒酵母加入步驟(1)所得的體系中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度10～40℃，反應(yīng)體系pH值為8.0～9.0；

(3)以pH值不再降低作為反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)的標(biāo)志，收集反應(yīng)液分離菌體以終止反應(yīng)。

該具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的丙谷二肽的生物合成路徑可簡(jiǎn)單描述為：

上述方法描述中，一方面，步驟(1)中所述的緩沖溶液可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)確定，該溶劑體系可以是水、磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。步驟(1)中優(yōu)選使用堿液調(diào)節(jié)體系pH為8.0～9.0。另一方面，步驟(2)中所述及的反應(yīng)溫度優(yōu)選18～25℃，最優(yōu)選20～25℃。當(dāng)然，允許的測(cè)量或控制誤差所導(dǎo)致的一定范圍內(nèi)的溫度波動(dòng)也是可以接受的；該步驟反應(yīng)體系的pH值仍然優(yōu)選8.0～9.0。

基于上文所描述的丙谷二肽的生物合成方法，由于在催化反應(yīng)合成的體系中使用的全細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，反應(yīng)進(jìn)行到適當(dāng)程度可以通過(guò)物理分離重組釀酒酵母終止反應(yīng)，并且分離出來(lái)的重組釀酒酵母可以作為工程菌繼續(xù)添加到生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系中使用，實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用，因此，該方法最為重要的一個(gè)實(shí)施方式中，還包括菌體循環(huán)利用的步驟。亦即將上述步驟(3)反應(yīng)終止后分離所得的菌體加入至新的反應(yīng)體系中，循環(huán)使用。

具體實(shí)施方式中，由于釀酒酵母發(fā)酵在發(fā)酵體系中自沉降的特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，體系靜置，重組釀酒酵母細(xì)胞自沉降后可以蠕動(dòng)泵移出反應(yīng)清液；分離所得重組釀酒酵母用于新的反應(yīng)體系。

下述實(shí)施方式，將更加完整具體地闡述本發(fā)明的內(nèi)容及優(yōu)選模式，該具體實(shí)施方式中，所述的丙谷二肽的生物合成方法包括如下步驟:

(1)構(gòu)建重組釀酒酵母；

克隆核苷酸序列如SEQ ID NO.1的目標(biāo)基因，使用表達(dá)載體pYD1構(gòu)建包括該基因的重組載體，并采用熱擊法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中；

(2)利用氨芐青霉素抗性基因篩選、PCR及酶切驗(yàn)證步驟(1)所獲得的轉(zhuǎn)化子，保存于斜面培養(yǎng)基；

所述的斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，瓊脂粉20.0g/L，121℃滅菌15min，冷卻后加入終濃度為10～100μg/mL的氨芐青霉素；

(3)從步驟(2)所得轉(zhuǎn)化子中提取重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至釀酒酵母EBY100感受態(tài)細(xì)胞中，利用缺陷型篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子活化后接種到種子培養(yǎng)基，待菌體生長(zhǎng)至OD₆₂₀＝0.5～5.0時(shí)，轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得重組酵母細(xì)胞；

所述的種子培養(yǎng)基：在82mL超純水中，加入無(wú)氨基酵母氮源0.67g，如為制備固體培養(yǎng)基加入3.0g/L的瓊脂粉，121℃滅菌15min；滅菌后補(bǔ)加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，組氨酸(2.0g/L)1mL，蘇氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％葡萄糖5mL；

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在82mL超純水中，加入無(wú)氨基酵母氮源0.67g，121℃滅菌15min；滅菌后補(bǔ)加氨基酸混合液10mL，亮氨酸(6.0g/L)1mL，組氨酸(2.0g/L)1mL，蘇氨酸(20.0g/L)1mL，以及40wt％半乳糖5mL；

上述種子及誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備中所述及的氨基酸混合液中含有如下組分：精氨酸0.2g/L、天冬氨酸1.0g/L、谷氨酸1.0g/L、異亮氨酸0.3g/L、賴氨酸0.3g/L、纈氨酸1.5g/L、蛋氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、絲氨酸3.75g/L、酪氨酸0.3g/L和腺嘌呤0.4g/L。

(4)丙谷二肽的生物合成：將底物L(fēng)-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(L-Ala-OMe)和L-谷氨酰胺(L-Gln)溶于溶劑體系中，并加入步驟(3)的培養(yǎng)物，調(diào)節(jié)pH為8.0～9.0，體系在20±5℃條件下反應(yīng)，至pH值不再降低作為反應(yīng)終點(diǎn)，收集反應(yīng)液分離菌體；

(5)將步驟(4)分離所得菌體加入到新的反應(yīng)體系中，循環(huán)生產(chǎn)丙谷二肽。

下述非限制性實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明任何形式的限定。

實(shí)施例1

重組酵母細(xì)胞的構(gòu)建：

根據(jù)已知的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)，設(shè)計(jì)上下游引物SEQ ID NO.3/4，以來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心的鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacteriumsp.)的菌種泗陽(yáng)鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium siyangensis，CGMCC菌株編號(hào)：1.6855)基因組為模板擴(kuò)增該生物酶基因(SEQ ID NO.1)。

其中，PCR反應(yīng)體系(50μL)：

PCR反應(yīng)條件：

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取2μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(OMEGA，USA)對(duì)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后保存于-20℃冰箱中備用。

將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pYD1酶切純化后過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在LB抗性培養(yǎng)基的平板(培養(yǎng)基組成與斜面培養(yǎng)基相同)上篩選轉(zhuǎn)化子，并對(duì)其分別進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證，以及DNA測(cè)序，驗(yàn)證無(wú)誤后即得到酵母重組表達(dá)載體，如圖1所示。通過(guò)化學(xué)法轉(zhuǎn)化至釀酒酵母EBY100感受態(tài)細(xì)胞中，缺陷型篩選獲得能催化合成丙谷二肽的重組酵母細(xì)胞，并作為本發(fā)明中其余實(shí)施例中所使用的重組酵母細(xì)胞。

實(shí)施例2

重組酵母細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)：

將重組酵母細(xì)胞接種至種子培養(yǎng)基中，30℃，180rpm的條件下活化菌體。之后再轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃，180rpm振蕩培養(yǎng)。待生長(zhǎng)至適宜的生物量，再接種到1.0L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，20℃，150rpm通氣培養(yǎng)細(xì)胞。16～24h后放罐，離心收集細(xì)胞。為本發(fā)明中所使用的重組酵母細(xì)胞。

實(shí)施例3

表面展示生物酶的驗(yàn)證：

a.實(shí)施例2所培養(yǎng)的重組酵母細(xì)胞在3000～5000rpm的條件下離心收集細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液清洗兩遍；

b.棄去上清液，用含有1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和1μg抗體(anti-V5-FITC)的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞；

c.置于冰上30min后，在3000～5000rpm的條件下離心收集細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液清洗兩遍；

d.最后用磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，置于熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察。

當(dāng)生物酶展示于細(xì)胞表面時(shí)，暴露的V5抗原表位能與檢測(cè)方法b中游離的熒光素標(biāo)記抗體發(fā)生特異性結(jié)合，然后用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞洗去多余和非特異性結(jié)合的抗體，最后在493nm激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)到的熒光信號(hào)，即為特異性結(jié)合產(chǎn)生的熒光信號(hào)，證明該生物酶已成功展示于細(xì)胞表面。

本實(shí)施例中所述及的磷酸鹽緩沖液中含137mM氯化鈉；2.7mM氯化鉀；10mM磷酸鹽，緩沖液pH 7.4。

在熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下分別檢測(cè)到的熒光信號(hào)，結(jié)果如圖2所示(A-1/A-2為熒光倒置顯微鏡驗(yàn)證結(jié)果；B-1/B-2為激光共聚焦顯微鏡驗(yàn)證結(jié)果)。其中，圖A-1/B-1為在白光照射下的細(xì)胞位置圖；圖A-2/B-2為在493nm激發(fā)波長(zhǎng)下的細(xì)胞熒光信號(hào)圖，可以發(fā)現(xiàn)在相同位置存在能產(chǎn)生綠色熒光信號(hào)的細(xì)胞，證明該細(xì)胞已將生物酶展示于細(xì)胞表面。

生物酶展示于細(xì)胞表面，實(shí)現(xiàn)了酶的固定化。首先，克服了底物和產(chǎn)物跨膜阻力的影響，提高了反應(yīng)速率；其次，與胞內(nèi)酶相比，一方面避免了胞內(nèi)蛋白酶和肽酶的水解作用，有利于維持酶活力的穩(wěn)定和產(chǎn)物的積累。另一方面，在需要對(duì)酶進(jìn)行富集的工藝中，也省去了破碎細(xì)胞和酶的分離純化等步驟，降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益；最后，伴隨細(xì)胞的重復(fù)利用，可實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用，解決了酶回收難、成本高的問(wèn)題。

實(shí)施例4

100mM底物濃度下酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的研究：

稱取1.396g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(100mM L-Ala-OMe)和1.462g L-谷氨酰胺(100mM L-Gln)，溶解于90mL水中，控制溫度為25℃，并用6M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，取零點(diǎn)樣置于4℃保存。將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液維持pH穩(wěn)定，反應(yīng)結(jié)束后，離心后取上清液置于4℃保存。利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)得反應(yīng)時(shí)間內(nèi)丙谷二肽的最高濃度為7.7g/L，如圖3所示。

實(shí)施例5

200mM底物濃度下酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的研究：

稱取2.792g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(200mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL水中，控制溫度為25℃，并用6M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，取零點(diǎn)樣置于4℃保存。將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液維持pH穩(wěn)定，反應(yīng)結(jié)束后，離心后取上清液置于4℃保存。利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)得反應(yīng)時(shí)間內(nèi)丙谷二肽的最高濃度為20.4g/L，如圖3所示。

實(shí)施例6

底物濃度為(50mM L-Ala-OMe、100mM L-Gln)下酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的研究：

稱取0.698g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(50mM L-Ala-OMe)和1.462g L-谷氨酰胺(100mM L-Gln)，溶解于90mL 0.2M pH8.7磷酸鹽緩沖液中，控制溫度為20℃，并用6M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，取零點(diǎn)樣置于4℃保存。將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液維持pH穩(wěn)定，反應(yīng)20min，離心后取上清液置于4℃保存。利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)得反應(yīng)時(shí)間內(nèi)丙谷二肽的濃度為5.8g/L。

實(shí)施例7

底物濃度為(100mM L-Ala-OMe、200mM L-Gln)下酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的研究：

稱取1.396g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(100mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL0.2M pH8.7磷酸鹽緩沖液中，控制溫度為20℃，并用6M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，取零點(diǎn)樣置于4℃保存。將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液維持pH穩(wěn)定，反應(yīng)40min，離心以終止反應(yīng)，分別取上清液置于4℃保存。利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)得反應(yīng)時(shí)間內(nèi)丙谷二肽的濃度為14.4g/L。

實(shí)施例8

底物濃度為(200mM L-Ala-OMe、400mM L-Gln)下酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的研究：

稱取2.792g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(200mM L-Ala-OMe)和5.848g L-谷氨酰胺(400mM L-Gln)，溶解于90mL0.2M pH8.7磷酸鹽緩沖液中，控制溫度為20℃，并用6M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，取零點(diǎn)樣置于4℃保存。將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液維持pH穩(wěn)定，反應(yīng)60min，離心以終止反應(yīng)，取上清液置于4℃保存。利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)得反應(yīng)時(shí)間內(nèi)丙谷二肽的最高濃度為24.7g/L。

實(shí)施例9

不同反應(yīng)體系對(duì)酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的影響：

重組酵母細(xì)胞的培養(yǎng)如實(shí)施例2相同，離心收集細(xì)胞進(jìn)行丙谷二肽催化反應(yīng)。研究水、磷酸鹽緩沖液和硼酸鹽緩沖液對(duì)酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的影響。稱取2.792g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(200mM L-Ala-OMe)和5.848g L-谷氨酰胺(400mM L-Gln)，分別溶解于90mL上述三種不同反應(yīng)溶液中，將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液維持pH＝8.5，控制溫度為25℃，進(jìn)行催化合成反應(yīng)，于10/30/60min定點(diǎn)取樣，離心以終止酶反應(yīng)，分別取上清液置于4℃保存。利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)定丙谷二肽的濃度，發(fā)現(xiàn)最適合的反應(yīng)溶液為磷酸鹽緩沖溶液。

實(shí)施例10

不同反應(yīng)溫度對(duì)酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的影響：

重組酵母細(xì)胞的培養(yǎng)如實(shí)施例2相同，離心收集細(xì)胞進(jìn)行丙谷二肽催化反應(yīng)。研究10/15/20/25/30/40℃不同反應(yīng)溫度，對(duì)酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的影響。稱取1.396g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(100mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL0.2M pH8.7磷酸鹽緩沖液溶液中，將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，用6M NaOH溶液維持pH＝8.5，分別在上述不同反應(yīng)溫度下進(jìn)行催化合成反應(yīng)，30min后離心以終止酶反應(yīng)，利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)定丙谷二肽的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶在較寬泛的溫度范圍內(nèi)均具有較高活性，反應(yīng)的最適溫度為20℃，但相比于25℃和30℃差別較小，考慮生產(chǎn)能耗等經(jīng)濟(jì)因素，可直接采用室溫(20～30℃)進(jìn)行酶反應(yīng)，如圖4所示。

實(shí)施例11

不同反應(yīng)pH對(duì)酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的影響：

重組酵母細(xì)胞的培養(yǎng)如實(shí)施例2相同，離心收集細(xì)胞進(jìn)行丙谷二肽催化反應(yīng)。研究pH4/5/6(乙酸鹽緩沖液)、6/7/7.5/8/8.5/9(磷酸鹽緩沖液)、8/8.5/9/10(硼酸鹽緩沖液)不同反應(yīng)pH對(duì)酵母全細(xì)胞催化合成丙谷二肽的影響。稱取1.396g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(100mM L-Ala-OMe)和2.924g L-谷氨酰胺(200mM L-Gln)，溶解于90mL緩沖溶液中，將重組酵母細(xì)胞加入到反應(yīng)體系中，使反應(yīng)液中生物量OD₆₂₀＝0.5～5.0，控制溫度為20℃，用6M NaOH溶液維持pH在上述不同反應(yīng)pH下進(jìn)行催化合成反應(yīng)，30min后離心以終止酶反應(yīng)，利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)定丙谷二肽的濃度，發(fā)現(xiàn)該酶在較寬泛的pH范圍內(nèi)均具有較高活性，反應(yīng)的最適pH為8.0，再次驗(yàn)證最適反應(yīng)底物溶液為磷酸鹽緩沖溶液，如圖5所示。

實(shí)施例12

酵母細(xì)胞循環(huán)使用高效合成丙谷二肽：

重組酵母細(xì)胞的培養(yǎng)與實(shí)施例2相同，離心收集細(xì)胞進(jìn)行丙谷二肽催化反應(yīng)。反應(yīng)條件為稱取0.698g L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(50mM L-Ala-OMe)和1.462g L-谷氨酰胺(100mM L-Gln)，溶解于90mL緩沖液中，控制溫度為20℃，并用6M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8，于20/30min定點(diǎn)取樣，離心以終止酶反應(yīng)。然后，用蠕動(dòng)泵泵出或離心棄去反應(yīng)上清液后，再次按照上述反應(yīng)條件多次重復(fù)反應(yīng)。最后，利用高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)得丙谷二肽的濃度。將第一反應(yīng)酵母細(xì)胞的相對(duì)酶活性定義為100％，則求出第二次反應(yīng)酵母細(xì)胞的相對(duì)酶活性為94.0％；第三次反應(yīng)酵母細(xì)胞的相對(duì)酶活性為86.7％；第四次反應(yīng)酵母細(xì)胞的相對(duì)酶活性為81.0％；第五次反應(yīng)酵母細(xì)胞的相對(duì)酶活性為76.7％，如圖6所示?；厥站w的過(guò)程中，細(xì)胞存在部分損失，因此多次循環(huán)利用重組酵母細(xì)胞催化合成丙谷二肽的過(guò)程中酶活性是比較穩(wěn)定的，可重復(fù)使用，以降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，解決酶回收難、利用率低等問(wèn)題，更符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

SEQUENCE LISTING

<110> 大連醫(yī)諾生物有限公司

<120> 重組釀酒酵母及其在合成丙谷二肽中的應(yīng)用

<130> N/A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1860

<212> DNA

<213> Sphingobacterium siyangensis

<400> 1

atgaaaaata caatttcgtg cctaacttta gcgcttttaa gcgcaagcca gttacatgct 60

caaacagctg ccgactcggc ttatgttaga gatcattatg aaaagaccga agtagcaatc 120

cccatgcgag atgggaagaa attatttact gcgatctaca gtccaaaaga caaatccaag 180

aaatatccag ttttactcaa tagaacaccc tacacggttt ctccttatgg gcagaacgaa 240

tacaaaaaaa gcttgggaaa ctttccccaa atgatgcgtg aaggttatat tttcgtttat 300

caggatgtcc gtggcaagtg gatgagcgaa ggtgattttg aagatattcg tccgaccacc 360

tacagcaaag ataaaaaagc aatcgatgaa agtacggata cctatgatgc gcttgaatgg 420

ttacagaaaa atctcaaaaa ctataatgac aaagccgggc tctatgggat ttcctatcca 480

ggcttctatt ctaccgtcgg attggtcaaa acacacccga gcttgaaggc agtctcccca 540

caggctcccg taacagactg gtttatcggc gacgacttcc accataatgg cgtattgttt 600

cttcaggatg catttacatt catgtcaacc tttggtgtcc cacgtccaaa acccattaca 660

ccggatcaat ttaagggcaa aattcaaatc aaagaagccg ataaatataa cttttttgca 720

gaagcaggaa cagcgcggga actcaaagaa aagtattttg gtgactccgt acaattttgg 780

aatggcctgt ttaaacatcc cgactatgat gatttttgga aatcgcgtgt gatcaccaat 840

tctttacagg aggtaaaacc agctgtgatg gtggttggtg gtttctttga cgcggaagat 900

gcttatggaa catttaagac ttaccaatcg attgaggata aaagcaaaaa aaacaactcg 960

attttagtcg cgggaccttg gtatcatggc ggctgggttc gtgcagaagg aaactattta 1020

ggtgatatcc aatttgagaa aaaaaccagt attacttatc aggagcaatt tgaacaaccg 1080

tttttcaaat attacctaaa agatgaagga aacttcgccc cttccgaagc taacattttt 1140

gtctcaggca gcaacgaatg gaaacatttc gaacaatggc cgccaaaaaa tgtagagaca 1200

aaaaaactat acttccaacc tcaggggaaa cttggatttg acaaagttca acgtacagat 1260

tcctgggatg aatatgtaac agaccctaat aaacttgttc cgcatcaagg tgggttaatt 1320

caaaaccgaa cacgggagta tatggtagat gatcagcgtt tcgcagctag tcgccctgat 1380

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aacttcctca aagtctcctc aacaggaaca gacgcggact atgttgtcaa actgattgat 1500

gtatacccga acgatgctgc aagttatcaa ggaaaaacaa tggctggata tcaaatgatg 1560

gtacgtggtg agatcatggc ggggaaatac cgaaatggtt ttgataaagc acaggccttg 1620

actccaggta tggtcgaaaa ggttaatttt gaaatgccag acgttgcgca taccttcaaa 1680

aaaggacatc gcattatggt tcaggtacaa aactcatggt ttccgttagc agaacgaaat 1740

ccacaggtat tcttaccgtc ttatacagcc accaaagctg acttccgtaa ggctacccaa 1800

cgtatttttc acgatgtgaa caatgccaca tacatcgaat tttctgtcct caaagattag 1860

<210> 2

<211> 619

<212> PRT

<213> Sphingobacterium siyangensis

<400> 2

Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His

20 25 30

Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu

35 40 45

Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val

50 55 60

Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu

65 70 75 80

Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr

85 90 95

Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp

100 105 110

Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile

115 120 125

Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn

130 135 140

Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys

165 170 175

Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Phe Ile Gly Asp Asp

180 185 190

Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met

195 200 205

Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe

210 215 220

Lys Gly Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala

225 230 235 240

Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser

245 250 255

Val Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe

260 265 270

Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala

275 280 285

Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr

290 295 300

Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser

305 310 315 320

Ile Leu Val Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu

325 330 335

Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr

340 345 350

Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp

355 360 365

Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser

370 375 380

Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr

385 390 395 400

Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val

405 410 415

Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro

420 425 430

Val Pro His Gln Gly Gly Leu Ile Gln Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met

435 440 445

Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr

450 455 460

Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys

465 470 475 480

Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val

485 490 495

Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys

500 505 510

Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly

515 520 525

Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met

530 535 540

Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys

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Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Lys

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<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 5

<211> 1860

<212> DNA

<213> Sphingobacterium sp.

<400> 5

atgaaaaata caatttcgtg cctaacttta gcgcttttaa gcgcaagcca gttacatgct 60

caaacagctg ccgactcggc ttatgttaga gatcattatg aaaagaccga agtagcaatt 120

cccatgcgag atgggaaaaa attatttact gcgatctaca gtccaaaaga caaatccaag 180

aaatatccag ttttgctcaa tagaacgccc tacacggttt ctccttatgg gcagaacgaa 240

tacaaaaaaa gtttgggaaa ctttccccaa atgatgcgtg aaggctatat tttcgtttac 300

caggatgtcc gtggcaagtg gatgagcgaa ggtgattttg aagatatacg tccgaccacg 360

tacagcaaag ataaaaaagc aatcgatgaa agtacggata cctatgatgc gcttgaatgg 420

ttacagaaaa atctcaaaaa ctataatggc aaagccgggc tctatgggat ttcctatcca 480

ggcttctatt ctaccgtcgg attggtcaaa acacacccga gcttgaaggc agtctcccca 540

caggctcccg taacagactg gtatatcggc gacgacttcc accataatgg cgtattgttt 600

cttcaggatg catttacatt catgtcaacc tttggtgtcc ctcgtccaaa acccattaca 660

ccggatcaat ttaagggcaa aattcagatc aaagaagccg ataaatataa cttttttgca 720

gaagcaggaa cagcgcggga actcaaagaa aaatactttg gtgactccgt acaattttgg 780

aatgacctgt ttaagcatcc cgactatgat gatttttgga aatcgcgtgt gatcaccaat 840

tctttacagg aggtaaaacc agctgtgatg gtggttggtg gtttctttga cgcggaagat 900

gcttatggaa catttaagac ctaccaatcg attgaggata aaagcaaaaa aaacaactcg 960

attttagtcg cgggaccttg gtatcatggc ggctgggttc gtgcagaagg aaactattta 1020

ggtgatatcc aatttgagaa aaaaaccagt attacttatc aggaacaatt tgaacaaccg 1080

tttttcaaat attacctaaa agatgaagga aacttcgccc cttccgaagc caacattttt 1140

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