本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種用于氯吡格雷個(gè)體戶(hù)用藥相關(guān)基因snp位點(diǎn)檢測(cè)的技術(shù)，具體而言是利用多重pcr技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)與氯吡格雷相關(guān)的6個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的產(chǎn)品和用途。
背景技術(shù)：
：氯吡格雷(clopidogel)是一種新型噻吩吡啶類(lèi)的抗血小板藥物，能和阿司匹林聯(lián)合使用是預(yù)防和治療急性冠脈綜合征(acs)缺血事件反復(fù)發(fā)作、接受金屬支架或藥物釋放支架植入手術(shù)的經(jīng)皮冠脈介入治療(pci)患者以及急性心肌梗死的標(biāo)準(zhǔn)療法。氯吡格雷為藥物前體(prodrug)，本身無(wú)活性，氯吡格雷約50％經(jīng)胃腸道吸收后在肝臟內(nèi)迅速代謝，血漿中原形藥物濃度極低。氯吡格雷在小腸的吸收受到abcb1基因編碼的質(zhì)子泵p糖蛋白(p‐glycoprtein,p‐gp)調(diào)控，大部分藥物前體通過(guò)酯酶代謝為無(wú)活性物質(zhì)(主要是sr‐26334)，進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)肝臟藥物代謝酶(主要是cyp3a4、cyp3a5、cyp2c19)氧化產(chǎn)生具有活性的代謝物(主要是sr‐6334)，該活性代謝產(chǎn)物不可逆的阻斷血小板膜上的二磷酸腺苷(adp)受體，從而阻止了血小板聚集，即發(fā)揮抗血小板作用。然而，在服用包括氯吡格雷在內(nèi)的血小板抑制劑的患者中，心血管事件反復(fù)發(fā)作的絕對(duì)危險(xiǎn)性仍然相對(duì)較高。在氯吡格雷的臨床治療存在個(gè)體差異，表現(xiàn)為氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，cr)，甚至表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)。其中部分原因由于患者對(duì)于氯吡格雷代謝酶基因存在基因多態(tài)性(snp)而導(dǎo)致代謝酶的活性降低或完全喪失，從而影響了氯吡格雷的療效。陳勁松等(氯吡格雷反應(yīng)性差異的分子機(jī)制研究進(jìn)展，《醫(yī)學(xué)綜述》，2011年第3期)報(bào)道了參與氯吡格雷代謝的主要藥物代謝酶包括:cyp1a2、cyp2b6、cyp2c9、cyp2c19、cyp3a等，其中cyp1a2、cyp2b6、cyp2c19參與氯吡格雷第一階段轉(zhuǎn)化，cyp2c9、cyp2c19、cyp2b6、cyp3a參與第二階段轉(zhuǎn)化。其中，cyp2c19酶蛋白在氯吡格雷的代謝活化中起重要作用，編碼該酶蛋白的基因cyp2c19在人體內(nèi)呈多態(tài)性表達(dá)。雖然cyp2c19的突變體有cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*4、cyp2c19*5，但其中與氯吡格雷代謝相關(guān)的最主要突變體為cyp2c19*2，其次是cyp2c19*3。隨著對(duì)cyp2c19的多態(tài)性位點(diǎn)與氯吡格雷代謝的相關(guān)性的研究深入，祝錦等(氯吡格雷藥物基因組學(xué)研究進(jìn)展，《中國(guó)新藥雜志》，2013年第15期)報(bào)道了中國(guó)人群的氯吡格雷抵抗主要受cyp2c19*2、cyp2c19*3的位點(diǎn)多態(tài)性影響。通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基因檢測(cè)以及通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)膫€(gè)性化治療方案可以幫助攜帶cyp2c19*2、cyp2c19*3等位基因的患者減少危險(xiǎn)，增加氯吡格雷的有效性和安全性。但對(duì)于其他snp位點(diǎn)(如abcb1、cyp2b6)是否影響氯吡格雷的代謝還有待研究。蔡泓敏等(cyp2c19基因多態(tài)性與氯吡格雷抗凝作用的相關(guān)性研究，《中國(guó)藥物應(yīng)用于監(jiān)測(cè)》，2013年第5期)、張園等(氯吡格雷低反應(yīng)性與cyp2c19基因多態(tài)性分布的研究，《內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志》，2014年第2期)分別報(bào)道了在我國(guó)人群中服用氯吡格雷的患者檢測(cè)cyp2c19*2和*3、cyp2c19*1和*2具有臨床指導(dǎo)意義。此外，有研究表明，abcb1基因也與氯吡格雷抵抗的機(jī)制有關(guān)。abcb1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(atpbindingcassettetransporterfamily)是一類(lèi)跨膜蛋白，其主要功能是利用atp水解產(chǎn)生的能量將與其結(jié)合的底物等主動(dòng)轉(zhuǎn)出質(zhì)膜，abcb1基因在人類(lèi)多藥耐藥基因族中起主導(dǎo)作用，其表達(dá)受各種因素的影響，屬于可調(diào)控基因。劉俊等(基因型檢測(cè)在氯吡格雷個(gè)體化抗血小板治療中的應(yīng)用價(jià)值，《中國(guó)藥房》，2014年第12期)報(bào)道了cyp2c19和abcb1基因多態(tài)性與氯吡格雷療效存在明顯關(guān)聯(lián)性，尤其是cyp2c19基因多態(tài)性是導(dǎo)致氯吡格雷療效差異的重要影響因素。這說(shuō)明在我國(guó)人群中服用氯吡格雷的患者檢測(cè)cyp2c19*2和*3以及abcb1基因型具有臨床指導(dǎo)意義。目前，氯吡格雷藥物代謝基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法為pcr‐熒光探針?lè)ê蚿cr毛細(xì)電泳片段分析法等，這些技術(shù)不同程度地存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、單位實(shí)驗(yàn)通量成本較高、多個(gè)子平臺(tái)(子系統(tǒng))之間銜接的兼容性差、結(jié)果判定的主觀(guān)性較大等缺點(diǎn)。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201410067924、“焦磷酸測(cè)序氯吡格雷個(gè)體化用藥基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法”公開(kāi)了一種通過(guò)焦磷酸測(cè)序法來(lái)檢測(cè)氯吡格雷個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的方法，包括針對(duì)cyp2c19*2、cyp2c19*3的多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)多重pcr擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，通過(guò)對(duì)用藥者的上述位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到指導(dǎo)心腦血管疾病需要長(zhǎng)期抗凝者根據(jù)個(gè)體基因類(lèi)型合理選擇氯吡格雷及其劑量進(jìn)行治療。然而，該方法仍然屬于傳統(tǒng)的pcr測(cè)序檢測(cè)方法，該方法耗時(shí)耗力，且針對(duì)的檢測(cè)位點(diǎn)過(guò)少，難以滿(mǎn)足臨床需要。近年來(lái)基于多重pcr反應(yīng)的核酸質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，并正扮演著越來(lái)越重要的作用。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201610123251、“用于檢測(cè)與氯吡格雷藥物抵抗反應(yīng)相關(guān)的基因位點(diǎn)高效分型的試劑盒”公開(kāi)了一種多重?zé)晒鈖cr技術(shù)來(lái)檢測(cè)與氯吡格雷藥物抵抗反應(yīng)相關(guān)的基因位點(diǎn)的方法，方法包括針對(duì)cyp2c19*2、cyp2c19*3的多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，能夠測(cè)試受試者的基因是否變異，從而為受試者合理用藥提供依據(jù)。然而，該方法所針對(duì)的位點(diǎn)過(guò)少，且不涉及abcb1基因的多態(tài)性位點(diǎn)，因此檢測(cè)結(jié)果存在一定的遺漏。作為最接近的現(xiàn)有技術(shù)，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201210196926.3、發(fā)明名稱(chēng)“用于檢測(cè)華法林用藥劑量相關(guān)的基因snp的引物系統(tǒng)及其用途”，基于該引物系統(tǒng)所制備的產(chǎn)品，能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)與華法林用藥劑量相關(guān)的7處基因多態(tài)位點(diǎn)(即cyp2c9*2、cyp2c9*3、cyp2c9*6、vkorc1基因、cyp4f2基因、ggcx基因、calu基因)進(jìn)行檢測(cè)。使用該產(chǎn)品，對(duì)華法林服用者在7處基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果結(jié)合其他臨床指標(biāo)，可為臨床醫(yī)師合理制定華法林劑量提供參考，避免藥物不良反應(yīng)。由于以上位點(diǎn)并不包括abcb1(3435c>t)，同時(shí)沒(méi)有針對(duì)于氯吡格雷相關(guān)的所有cyp2c19位點(diǎn)進(jìn)行研究，同時(shí)在核酸質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，多重?cái)U(kuò)增過(guò)程的干擾作用，對(duì)于最終獲得的延伸產(chǎn)物也存在影響，因此發(fā)明人為之試圖尋找新的cyp2c19位點(diǎn)與abcb1位點(diǎn)組合，并重新設(shè)計(jì)新的引物系統(tǒng)。綜合所述，目前存在的技術(shù)問(wèn)題是：缺乏一次能同時(shí)有效檢測(cè)氯吡格雷抵抗相關(guān)的多個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)的方法和產(chǎn)品，常見(jiàn)的檢測(cè)技術(shù)，如測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量pcr等，均需對(duì)位點(diǎn)逐一進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)位點(diǎn)較多時(shí)操作復(fù)雜，費(fèi)用較高；又如，已知的核酸質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，又未能公開(kāi)以上聯(lián)合位點(diǎn)以及具體引物系統(tǒng)，同時(shí)又因?yàn)橥缓怂豳|(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，多重pcr對(duì)于延伸產(chǎn)物的干擾。因此目前需要一種不同于以往的檢測(cè)技術(shù)，能在同一體系中針對(duì)同一個(gè)體的cyp2c19與abcb1的多個(gè)snp進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)該技術(shù)的檢測(cè)信息，為合理用藥提供參考依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明原理在于，針對(duì)現(xiàn)有同時(shí)有效檢測(cè)氯吡格雷抵抗相關(guān)的多個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)(cyp2c19*2、*3)的需要，提出檢測(cè)snp位點(diǎn)擴(kuò)展到*4、*5尤其是*17位點(diǎn)以及abcb1的snp位點(diǎn)，以便合理選擇抗血小板治療方案。其中，*4、*5可保證檢測(cè)覆蓋中國(guó)境內(nèi)所有人群，abcb1(3435c>t)的snp位點(diǎn)可協(xié)同檢測(cè)cyp2c19*2、*3位點(diǎn)的準(zhǔn)確率，而檢測(cè)cyp2c19*17則可避免氯吡格雷過(guò)度用藥所帶來(lái)的副作用。因此，本發(fā)明人通過(guò)優(yōu)化摸索，排除多重引物的干擾，從而成功獲得用于核酸質(zhì)譜檢測(cè)的引物系統(tǒng)。具體而言，提供了一種聯(lián)合多重pcr技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，在多重pcr中同時(shí)擴(kuò)增多達(dá)5‐6個(gè)含snp的dna片段；在單堿基延伸過(guò)程中，對(duì)多重pcr的純化產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸，延伸引物在6個(gè)snp處分別延伸一個(gè)核苷酸，使得所延伸的核苷酸類(lèi)型，分別與snp處的基因型相關(guān)；單堿基延伸產(chǎn)生由延伸引物和延伸產(chǎn)物組成的待檢混合物，以質(zhì)譜對(duì)待檢混合物進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)質(zhì)譜峰確定待檢混合物中各物質(zhì)分子量，并與預(yù)先計(jì)算的各延伸引物和延伸產(chǎn)物的理論分子量進(jìn)行比對(duì)，從而確定待檢混合物是否包含特定的物質(zhì)，進(jìn)而確定各snp處的基因型。因此，本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)與氯吡格雷抵抗相關(guān)的6種snp位點(diǎn)的引物系統(tǒng)或引物組，其序列包括如表1所示。表1.引物系統(tǒng)編號(hào)序列(5'→3')針對(duì)位點(diǎn)用途seqidno：1actgcagcattgctgagaacabcb1‐3435(rs1045642)pcr引物seqidno：2aaggcatgtatgttggcctcabcb1‐3435(rs1045642)pcr引物seqidno：3agtgcaagctcacggttgtccyp2c19*4(rs28399504)pcr引物seqidno：4gagcacaaggaccacaaaagcyp2c19*4(rs28399504)pcr引物seqidno：5catgaggagtaacttctccccyp2c19*5(rs56337013)pcr引物seqidno：6taaaaacagctccatgcgggcyp2c19*5(rs56337013)pcr引物seqidno：7gactgtaagtggtttctcagcyp2c19*3(rs4986893)pcr引物seqidno：8aacatcaggattgtaagcaccyp2c19*3(rs4986893)pcr引物seqidno：9aggtcttctgatgcccatcgcyp2c19*17(rs12248560)pcr引物seqidno：10aacaaagttttagcaaacgcyp2c19*17(rs12248560)pcr引物seqidno：11gcaataattttcccactatccyp2c19*2(rs4244285)pcr引物seqidno：12tccatcgattcttggtgttccyp2c19*2(rs4244285)pcr引物seqidno：13ctttgctgccctcacabcb13435c>t(rs1045642)延伸引物seqidno：14accacaaaaggatccacyp2c19*4(rs28399504)延伸引物seqidno：15ctctcccacacaaatcccyp2c19*5(rs56337013)延伸引物seqidno：16attgtaagcaccccctgcyp2c19*3(rs4986893)延伸引物seqidno：17gtgtcttctgttctcaaagcyp2c19*17(rs12248560)延伸引物seqidno：18agtaatttgttatgggttcccyp2c19*2(rs4244285)延伸引物其中，所述6個(gè)與氯吡格雷抗性相關(guān)的snp分別是：abcb1基因rs1045642位點(diǎn)(abcb13435c>t)、cyp2c19基因rs28399504位點(diǎn)(cyp2c19*4)、cyp2c19基因rs56337013位點(diǎn)(cyp2c19*5)、cyp2c19基因rs4986893位點(diǎn)(cyp2c19*3)、cyp2c19基因rs12248560位點(diǎn)(cyp2c19*17)、cyp2c19基因rs4244285位點(diǎn)(cyp2c19*2)。其中，各位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的延伸引物及延伸產(chǎn)物分子量如表2所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述pcr引物序列為核心序列，其在5'端可包括保護(hù)堿基序列，優(yōu)選5‐15個(gè)堿基。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，保護(hù)堿基序列選自在5'端加入10bp的tag(acgttggatg)，保護(hù)堿基的序列使得pcr引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反應(yīng)剩余的pcr引物一并進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，以避免干擾檢測(cè)效果。另外，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，延伸引物的5'端也可以適量增加堿基序列(如上述保護(hù)堿基序列)。增加堿基序列的目的是當(dāng)兩個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的延伸引物及產(chǎn)物的分子量接近時(shí)，通過(guò)給其中一個(gè)延伸引物或兩個(gè)延伸引物都增加堿基，改變引物及其產(chǎn)物的分子量，與其他延伸引物及產(chǎn)物的分子量之間拉大差距，提高檢測(cè)效果。而且，增加后的引物及產(chǎn)物分子量，一定不超出檢測(cè)窗口。表2.延伸引物及延伸產(chǎn)物分子量例如，pcr引物seqidno:1為5'‐actgcagcattgctgagaac‐3’。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作為接頭的堿基序列。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供了由上述引物系統(tǒng)所制備的用于檢測(cè)氯吡格雷抵抗相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，該產(chǎn)品為檢測(cè)試劑盒，包括：(1)用于pcr的反應(yīng)試劑，包括：特異性pcr引物，耐高溫的dna聚合酶，dntps，pcr反應(yīng)緩沖液；(2)用于pcr產(chǎn)物純化的試劑；(3)用于單堿基延伸反應(yīng)的試劑，包括：延伸引物，耐高溫的單堿基延伸酶，ddntps，延伸反應(yīng)緩沖液。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該試劑盒還可包括：陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品，純化用樹(shù)脂，點(diǎn)樣及質(zhì)譜檢測(cè)用靶片，外切酶，人基因組dna提取試劑等試劑。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于pcr產(chǎn)物純化的試劑：堿性磷酸酶，或堿性磷酸酶和外切酶exoi，或電泳凝膠回收試劑，或pcr產(chǎn)物純化柱。其中當(dāng)包括堿性磷酸酶和外切酶exoi的純化試劑時(shí)，所使用的pcr引物無(wú)需包括保護(hù)堿基。本發(fā)明第三個(gè)目的是使用上述引物、產(chǎn)品或試劑盒來(lái)檢測(cè)氯吡格雷抵抗相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)的方法，包括如下步驟：(1)多重pcr：使用特異性的pcr引物，在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)6處與氯吡格雷抵抗相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)所在dna區(qū)域同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，得到含6處基因多態(tài)位點(diǎn)所在dna區(qū)域的pcr產(chǎn)物；(2)pcr產(chǎn)物純化：對(duì)步驟(1)得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，以減少對(duì)后續(xù)反應(yīng)的干擾；(3)單堿基延伸：使用7條特異性的延伸引物，在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的純化后pcr產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸，延伸引物在對(duì)應(yīng)的snp位點(diǎn)處延伸一個(gè)核苷酸，該核苷酸與snp位點(diǎn)處的基因型互補(bǔ)配對(duì)；(4)延伸產(chǎn)物純化：對(duì)步驟(3)得到的延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化，以獲得高純的延伸產(chǎn)物，避免鹽離子等雜質(zhì)對(duì)后續(xù)檢測(cè)的影響；(5)質(zhì)譜儀檢測(cè)：將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，放入質(zhì)譜儀進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)；在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟2的純化過(guò)程可以選自堿性磷酸酶消化、堿性磷酸酶和外切酶exoi消化、切膠純化、pcr純化柱過(guò)柱等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)使用堿性磷酸酶消化、或堿性磷酸酶和外切酶exoi消化進(jìn)行純化后，進(jìn)行高溫酶失活處理。本發(fā)明第四個(gè)目的是提供前述試劑盒在檢測(cè)6個(gè)氯吡格雷抵抗相關(guān)的snp的用途。在上述任意一個(gè)方案中，所述引物系統(tǒng)或引物組、檢測(cè)產(chǎn)品、檢測(cè)氯吡格雷抵抗相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)的方法，其中所述snp位點(diǎn)選自cyp2c19*2、*3、*4、*5和abcb1(3435c>t)的5個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，所述snp位點(diǎn)還包括cyp2c19*17，該位點(diǎn)通過(guò)涉及與減少氯吡格雷用藥副作用以及合理選擇抗血小板治療方案，從而屬于氯吡格雷抵抗相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)。技術(shù)效果1、敏感：本發(fā)明綜合了多重pcr、單堿基延伸、質(zhì)譜檢測(cè)等技術(shù)為一體，既可通過(guò)pcr技術(shù)放大檢測(cè)模板，又可通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)微量樣本，綜合了兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單獨(dú)使用pcr檢測(cè)多態(tài)性snp，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。2、特異：?jiǎn)螇A基延伸又稱(chēng)為“微測(cè)序”，使用特異性探針對(duì)dna分子進(jìn)行識(shí)別，具有測(cè)序技術(shù)的高準(zhǔn)確性，特異性好、假陽(yáng)性低等特點(diǎn)；特別的，不同于測(cè)序技術(shù)延伸數(shù)百個(gè)堿基，該技術(shù)僅延伸單個(gè)堿基，出錯(cuò)概率更低；3、本發(fā)明首次提出可以利用核酸飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)2種不同類(lèi)別的氯吡格雷抵抗的snp位點(diǎn)，具體是首次將cyp2c19與abcb1位點(diǎn)置于同一檢測(cè)體系中。4、中國(guó)是多民族人口大國(guó)，少數(shù)民族中除了蒙古人種(即黃色人種)之外，在邊疆地區(qū)還分布少量的高加索人種(即白色人種，如俄羅斯族、塔吉克族等)、棕色人種等；而隨著對(duì)外交流日益頻繁，世界各國(guó)往來(lái)中國(guó)的人們也日益增多。因此僅僅以中國(guó)黃色人種為主體進(jìn)行研究，已經(jīng)不能適應(yīng)對(duì)患者的氯吡格雷抵抗的用藥診斷需要。因此，本發(fā)明還在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，豐富了已有文獻(xiàn)中關(guān)于氯吡格雷抵抗的多態(tài)性位點(diǎn)主要為cyp2c19*2、cyp2c19*3的信息，本發(fā)明增添了cyp2c19*4、cyp2c19*5、cyp2c19*17以及abcb1的多態(tài)性位點(diǎn)，能夠較全面覆蓋中國(guó)境內(nèi)所有類(lèi)型的位點(diǎn)檢測(cè)。5、由于本發(fā)明涉及對(duì)多個(gè)基因的多種snp位點(diǎn)的檢測(cè)，可以分別得到具有不同snp位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，因此患者可以是單個(gè)snp位點(diǎn)發(fā)生變異，也可以是多個(gè)snp位點(diǎn)發(fā)生變異。這表示患者可以攜帶一個(gè)或多個(gè)snp變異，從而為選擇合適劑量提供參考信息。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，pcr測(cè)序法或熒光定量pcr法，每增加一個(gè)檢測(cè)snp位點(diǎn)的反應(yīng)，就要增加相應(yīng)的費(fèi)用和時(shí)間。相比之下，質(zhì)譜法檢測(cè)優(yōu)勢(shì)在于無(wú)論多少個(gè)待檢位點(diǎn)，只要能在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)，則花費(fèi)的試劑和時(shí)間是不變的，這也是本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)多個(gè)snp位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)。6、本發(fā)明克服了在同一體系中多重pcr體系中存在的干擾延伸產(chǎn)物的影響，從而克服了以往技術(shù)一次檢測(cè)snp位點(diǎn)過(guò)少的缺陷。7、本發(fā)明還具有成本低廉，簡(jiǎn)便安全，檢測(cè)速度快，可在5‐6小時(shí)內(nèi)完成數(shù)百個(gè)樣本的高通量檢測(cè)。原理與定義本發(fā)明提供了一種聯(lián)合pcr、單堿基延伸和質(zhì)譜檢測(cè)等技術(shù)，檢測(cè)患者氯吡格雷抵抗基因多態(tài)性的檢測(cè)方案。其原理在于：使用特異性pcr引物，對(duì)待測(cè)模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到含待檢snp位點(diǎn)的pcr產(chǎn)物；pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化處理后，進(jìn)行單堿基延伸，在延伸引物后延伸一個(gè)核苷酸，該核苷酸與模板互補(bǔ)配對(duì)(如模板為核苷酸a，將在對(duì)應(yīng)的延伸引物上延伸t)；在單堿基延伸步驟中，采用ddntp代替dntp，因此，在延伸一個(gè)堿基后，延伸引物將終止延伸；在質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，單堿基延伸產(chǎn)物在脫鹽純化后，點(diǎn)至含基質(zhì)的靶片上，并在真空環(huán)境中被激光激發(fā)，通過(guò)飛行管至檢測(cè)器。不同物質(zhì)通過(guò)飛行管的時(shí)間與其分子量呈負(fù)相關(guān)，即分子量越大，飛行時(shí)間越慢，到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間越晚。術(shù)語(yǔ)“保護(hù)堿基”，指在pcr引物的5’端額外增加的堿基。保護(hù)堿基的序列使得pcr引物的分子量增大，可以避免反應(yīng)剩余的pcr引物進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)窗口，以避免干擾檢測(cè)效果。此外，延伸引物的5’端也可以適量增加堿基序列，但其作用并非如同pcr引物的保護(hù)堿基，使其超出檢測(cè)窗口，而是適當(dāng)調(diào)整延伸引物的分子量，使延伸引物及其產(chǎn)物在檢測(cè)窗口內(nèi)處于一個(gè)合理的位置。例如，當(dāng)兩個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的延伸引物及產(chǎn)物的分子量接近時(shí)，通過(guò)給其中一個(gè)延伸引物增加堿基，改變引物及其產(chǎn)物的分子量，與其他延伸引物及產(chǎn)物的分子量之間拉大差距，以避免局部區(qū)域質(zhì)譜峰過(guò)于集中而產(chǎn)生干擾和分辨不清，從而提高檢測(cè)效果。因此，增加堿基后的延伸引物及產(chǎn)物的分子量，一定不會(huì)超出檢測(cè)窗口。上述延伸引物的額外堿基可稱(chēng)為引物接頭。術(shù)語(yǔ)“堿性磷酸酶消化”，其作用是降解pcr反應(yīng)后體系中殘余dntp，其原理是使dntp的5’-p末端轉(zhuǎn)換成5’-oh末端，從而失去與引物結(jié)合使引物延伸的能力，避免了對(duì)下一步單堿基延伸的影響。術(shù)語(yǔ)“外切酶exoi消化”，其作用是從單鏈dna的一端開(kāi)始按序催化水解組成dna的dntp之間的3,5-磷酸二酯鍵，使單鏈dna最終水解為dntp。在本技術(shù)方案中用于降解pcr反應(yīng)后剩余的pcr引物。由于外切酶可以將單鏈的pcr引物切除，并不會(huì)再檢測(cè)窗口中出現(xiàn)，因此在使用該外切酶時(shí)，所使用的pcr引物無(wú)需包括保護(hù)堿基。術(shù)語(yǔ)“單堿基延伸”，又被稱(chēng)之為微測(cè)序(minisequence)，指在體系中加入延伸引物和ddntp，ddntp與延伸引物的3’連接形成延伸產(chǎn)物，即引物延伸了一個(gè)堿基。ddntp與普通dntp不同的是，在脫氧核糖的3’位置缺少了一個(gè)羥基，不能與后續(xù)的ddntp形成磷酸二酯鍵，因而，延伸引物僅可連接一個(gè)ddntp，故而稱(chēng)之為單堿基延伸。單堿基延伸與測(cè)序過(guò)程非常相似，測(cè)序體系中加入的是dntp和ddntp的混合物，測(cè)序引物連接dntp后將繼續(xù)延伸，只有連接ddntp后方可終止延伸，因此測(cè)序產(chǎn)生的是長(zhǎng)短不一的核苷酸片段的混合物；單堿基延伸體系中只加入ddntp，延伸引物只能連接一個(gè)ddntp，并終止延伸，因此，單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)生的是延伸引物僅延伸一個(gè)堿基的核苷酸片段。術(shù)語(yǔ)“ddntp”是一種特殊的核苷酸，本技術(shù)方案共采用四種，它們之間存在分子量差異，如ddctp，ddatp，ddgtp，ddttp的分子量分布是247.2、271.2、287.2、327.1da，其中ddttp為修飾后的分子量。當(dāng)延伸引物根據(jù)snp位點(diǎn)的基因型而延伸不同的核苷酸時(shí)，將形成分子量差異?？梢酝ㄟ^(guò)質(zhì)譜檢測(cè)，分辨出這種差異(質(zhì)譜檢測(cè)核酸的最小靈敏度約為9da)。例如，某snp位點(diǎn)若為g/a多態(tài)，對(duì)應(yīng)的延伸引物長(zhǎng)度為22個(gè)堿基(分子量為6153da)，當(dāng)該snp位點(diǎn)是g基因型時(shí)，延伸引物將延伸一個(gè)c核苷酸并終止延伸，形成23個(gè)堿基長(zhǎng)、分子量為6400.2da的延伸產(chǎn)物；當(dāng)該snp位點(diǎn)處為a基因型，延伸引物將延伸一個(gè)t核苷酸并終止延伸，形成23個(gè)堿基長(zhǎng)、分子量為6480.1da的延伸產(chǎn)物，兩種產(chǎn)物間存在80.1da的分子量差異。即對(duì)該snp位點(diǎn)而言，使用此6153da的延伸引物，g基因型將對(duì)應(yīng)6400.2da的質(zhì)譜峰，a基因型將對(duì)應(yīng)6480.1da的質(zhì)譜峰。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，使用者可通過(guò)軟件對(duì)6153da、6400.2da、6480.1da三處進(jìn)行觀(guān)察：若6153da處出現(xiàn)質(zhì)譜峰，則表明有部分或全部延伸引物未與ddntp結(jié)合；不論6153da處是否有質(zhì)譜峰，若6400.2da與6480.1da處僅出現(xiàn)一處質(zhì)譜峰，則該snp位點(diǎn)的基因型為純合型，并與質(zhì)譜峰的位置對(duì)應(yīng)，如前所述，6400.2da的質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)g基因型，6480.1da的質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)a基因型；若6400.2da與6480.1da兩處均出現(xiàn)質(zhì)譜峰，則該snp位點(diǎn)的基因型為雜合型；若6400.2da與6480.1da兩處均未出現(xiàn)質(zhì)譜峰，則實(shí)驗(yàn)失敗。術(shù)語(yǔ)“純化”，指用于減少待檢體系內(nèi)其他物質(zhì)對(duì)后續(xù)反應(yīng)的影響的處理步驟。本發(fā)明的pcr產(chǎn)物純化有兩種方式：一是分離雜質(zhì)并丟棄，而是使雜質(zhì)失去活性。其中，切膠純化、過(guò)純化柱等都是通過(guò)電泳、純化柱等分離介質(zhì)，并回收相對(duì)較純的pcr產(chǎn)物，屬于第一種純化方式，該方式一般耗時(shí)較長(zhǎng)、操作復(fù)雜，尤其是樣本量大時(shí)，更難以提高批量處理能力；堿性磷酸酶的作用是降解(亦稱(chēng)消化)dntp，使之不能繼續(xù)作為dna聚合酶或單堿基延伸酶的底物參與pcr或單堿基延伸反應(yīng)，從而不干擾后續(xù)反應(yīng)，屬于第二種純化方式。應(yīng)當(dāng)指出的是，單獨(dú)的外切酶exoⅰ不起純化作用，當(dāng)它與堿性磷酸酶混合使用時(shí)，其作用是預(yù)先將單鏈dna(在反應(yīng)完成的pcr產(chǎn)物體系中，主要是剩余的pcr引物)降解成dntp，再由堿性磷酸酶令dntp繼續(xù)降解。由于pcr引物被降解，不會(huì)進(jìn)入最后的質(zhì)譜檢測(cè)步驟，因此，如果計(jì)劃純化步驟中增加外切酶exoⅰ處理，則無(wú)需使用具有保護(hù)堿基的pcr引物。此外，在單堿基延伸步驟之前，由于外切酶和堿性磷酸酶都通過(guò)高溫滅活，其不降解在單堿基延伸步驟中加入的單鏈的延伸引物、ddntp等，因此對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)不會(huì)產(chǎn)生影響。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)窗口”，指可用于質(zhì)譜檢測(cè)核苷酸分子量的范圍，通常涉及引物的設(shè)計(jì)參考范圍。為避免不同延伸引物與產(chǎn)物間由于分子量接近而存在干擾，從而可在一個(gè)相對(duì)較寬的檢測(cè)窗口，如4000-9000da，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“snp”基因型，表示物種基因組中單核苷酸多態(tài)性的類(lèi)型。其中，在實(shí)際檢查中，作為對(duì)照的用于檢測(cè)的基因型既可來(lái)自于對(duì)于物種的基因組中，也可來(lái)自克隆入質(zhì)粒的載體工具，而后者具有可復(fù)制和保存便捷、來(lái)源穩(wěn)定易得而受到實(shí)際使用者的歡迎。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)產(chǎn)品”，指用于檢測(cè)snp位點(diǎn)基因型的任何常規(guī)產(chǎn)品，包括：檢測(cè)試劑、檢測(cè)芯片(如基因芯片、液體芯片等)、檢測(cè)載體，以及檢測(cè)試劑盒等。術(shù)語(yǔ)“snp變異頻率”，指snp位點(diǎn)發(fā)生變異的概率。理論上，本發(fā)明能同時(shí)檢測(cè)單個(gè)個(gè)體中同時(shí)存在6個(gè)snp位點(diǎn)。但實(shí)踐中研究者發(fā)現(xiàn)，不同snp位點(diǎn)在不同種族或不同個(gè)體中存在一定的變異頻率。比如cyp2c19基因多態(tài)性存在種族性差異，中國(guó)人群cyp2c19失去功能型基因型主要是cyp2c9*2和cyp2c9*3型，snp變異頻率分別為24％-25％和2％-3％，cyp2c19*17頻率僅為1.2％-3％，其中cyp2c19*2頻率與非裔美國(guó)人近似，而比歐裔美國(guó)人高(chenl，etal.pharmacogenomics，2008，9(6)；zhouqetal.pharmacogenomicsj，2009，9(6))。cyp2c19*4等位基因主要在高加索人群中被發(fā)現(xiàn)，也是抗痙攣藥物弱代謝的等位基因之一，可解釋高加索人群3％的弱代謝(fregusonr.j.etal.anewgeneticdefectinhumancyp2c19:mutationoftheinitiationcodonisresponsibleforpoormetabolismofs-mephenytoin.jpharmacolexpther,1998,284(1):356-361)。cyp2c19*5是罕見(jiàn)的突變基因，在高加索人群和中國(guó)白族人群中被發(fā)現(xiàn)，發(fā)生頻率非常低(白族人0.25％，高加索人低于0.9％)，但也可以引起弱代謝(ibeanug.c.etal.anadditionaldefectiveallele,cyp2c19*5,contributestothes-mephenytoinpoormetabolizerphenotypeincaucasians.pharmacogenetics,1998,8(2):129-135)。但未有關(guān)于利用*4、*5等位基因用于檢測(cè)尤其是中國(guó)人群中氯吡格雷抵抗相關(guān)基因多態(tài)位點(diǎn)(snp)的報(bào)道。關(guān)于cyp2c19*17，cyp2c19*17為上游‐806c>t多態(tài)性形成的等位基因，它起促進(jìn)藥物代謝作用，因?yàn)楹\806c>t的調(diào)控元件可結(jié)合肝核蛋白，可加快cyp2c19的轉(zhuǎn)錄速率，從而提高cyp2c19對(duì)藥物的代謝效率。根據(jù)dirksibbing(cytochrome2c19*17allelicvariant,plateletaggregation,bleedingevents,andstentthrombosisinclopidogrel‐treatedpatientswithcoronarystentplacement.circulation,2010,121(4):512)等人的研究結(jié)果顯示，白人的cyp2c19*17等位基因頻率為22.9％，顯著高于國(guó)人7.98％。雖然，通常認(rèn)為cyp2c19*17與氯吡格雷抵抗無(wú)關(guān)(tantryus，etal.circcardiovascgenet，2012，3)，但該影響是確實(shí)存在的，對(duì)于攜帶cyp2c19*17的患者應(yīng)用阿司匹林加氯吡格雷雙聯(lián)抗栓導(dǎo)致的出血事件正受到密切關(guān)注。根據(jù)一項(xiàng)關(guān)于腸溶阿司匹林致cahd患者上消化道出血的研究(accf/acg/aha2008expertconsensusdocumentonreducingthegastrointestinalrisksofantiplatelettherapyandnsaiduse:areportoftheamericancollegeofgardiologyfoundationtaskforceonclinicalexpertconsensusdocuments.j.amcollcardiol.2008,52(18):1502‐17)顯示，導(dǎo)致患者上消化道出血的發(fā)生與阿司匹林聯(lián)用劑量存在效應(yīng)關(guān)系，患者即使服用較低劑量阿司匹林也會(huì)引起上消化道出血；另一原因與其雙聯(lián)抗血小板有關(guān)，血小板對(duì)傷口的愈合起著關(guān)鍵作用，氯吡格雷為adp受體拮抗劑，抑制血小板聚集的同時(shí)，還可抑制血小板釋放血管前生長(zhǎng)因子。雖然氯吡格雷或許不是上消化道出血事件的直接原因，但其抗血管生長(zhǎng)作用可能抑制了胃糜爛和其他藥物或者幽門(mén)螺桿菌感染所致的小潰瘍的愈合，在酸存在的情況下，這可能會(huì)導(dǎo)致一些沒(méi)有臨床癥狀的輕微胃黏膜損傷延遲愈合，甚至加劇為有明顯臨床癥狀的潰瘍和出血。因此，在氯吡格雷給藥中，如果忽視了cyp2c19*17導(dǎo)致消化道過(guò)度出血的影響，那么在發(fā)揮氯吡格雷抗血小板作用、預(yù)防心血管事件的過(guò)程中，有可能伴隨消化道或其他器官的抗血小板而導(dǎo)致出現(xiàn)過(guò)度出血事件。因此，針對(duì)氯吡格雷用藥的患者，本發(fā)明除了檢測(cè)cyp2c19*2、*3位點(diǎn)之外，首次提出聯(lián)合檢測(cè)*4、*5尤其是*17位點(diǎn)以及abcb1的snp位點(diǎn)，以便合理選擇抗血小板治療方案。其中，*4、*5可保證補(bǔ)充檢測(cè)中國(guó)境內(nèi)所有人群，abcb1的snp位點(diǎn)可協(xié)同檢測(cè)cyp2c19*2、*3位點(diǎn)的準(zhǔn)確率，而cyp2c19*17則可避免氯吡格雷過(guò)度用藥所帶來(lái)的副作用。由于cyp2c19*17位點(diǎn)通過(guò)涉及與減少氯吡格雷用藥副作用以及合理選擇抗血小板治療方案，從而也屬于氯吡格雷抵抗相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“氯吡格雷抵抗相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)”包括抑制氯吡格雷活性的多態(tài)性位點(diǎn)，也包括強(qiáng)化氯吡格雷活性的多態(tài)性位點(diǎn)(如cyp2c19*17)，由于這些位點(diǎn)都與抗血小板治療方案相關(guān)，因此該術(shù)語(yǔ)也可稱(chēng)為“抗血小板治療方案相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)”。應(yīng)當(dāng)指出的是，鑒于以上核酸質(zhì)譜的特殊性，例如，其需先通過(guò)pcr反應(yīng)擴(kuò)增出含snp位點(diǎn)的片段，然后通過(guò)延伸引物延伸出snp位點(diǎn)的堿基；各snp的pcr反應(yīng)、延伸反應(yīng)間無(wú)明顯干擾；各snp的延伸引物、產(chǎn)物間分子量要有足夠大的差異以便實(shí)現(xiàn)區(qū)分等，因此，并非所有的已知snp均可以用來(lái)進(jìn)行核酸質(zhì)譜的檢測(cè)，也并不是所有針對(duì)snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物均可用以進(jìn)行多重pcr反應(yīng)和多重單堿基延伸反應(yīng)。例如，cláudiam.b等人(optimizationofamultiplexminisequencingprotocolforpopulationstudiesandmedicalgenetics,genet.mol.res4(2005)115-125)指出，在進(jìn)行多重pcr反應(yīng)前需首先對(duì)單重pcr的反應(yīng)效果進(jìn)行驗(yàn)證，如果單重pcr擴(kuò)增效率低則需要放棄，另外，若pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度偏長(zhǎng)，多重pcr效果會(huì)比較差，也需要放棄。nissumm等人(high-throughputgeneticscreeningusingmatrix-assistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometry,psychiatrgenets12(2002)109-117)也報(bào)道了通過(guò)maldi-tofms高通量檢測(cè)snp的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)只能獲得90％的準(zhǔn)確率，其中在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，竟然有5％的情況不能實(shí)施pcr擴(kuò)增過(guò)程，而在單堿基延伸過(guò)程中，由于自身引物自身配對(duì)、引物二聚體的形成以及擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)低等因素，也導(dǎo)致有5％的情況難以實(shí)現(xiàn)單堿基延伸過(guò)程，因此必須進(jìn)一步優(yōu)化核酸質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件(如擴(kuò)增引物、實(shí)驗(yàn)參數(shù)等)，否則將影響maldi-tofms在核酸質(zhì)譜檢測(cè)snp的應(yīng)用。此外，在核酸質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中，多重?cái)U(kuò)增過(guò)程的干擾作用，對(duì)于最終獲得的延伸產(chǎn)物也存在影響。saschasauer等人(typingofsinglenucleotidepolymorphismsbymaldimassspectrometry:principlesanddiagnosticapplications，clinicachimicaacta363(2006)95-105)和heyiyang等人(multiplexsingle-nucleotidepolymorphismgenotypingbymatrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，analyticalbiochemistry314(2003)54–62)在利用maldi質(zhì)譜技術(shù)研究核酸質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中提出，所設(shè)計(jì)的多重引物應(yīng)具有相近的熔解溫度(tm值)并彼此間的相互作用力較弱。如果引物之間的相互作用力過(guò)于強(qiáng)烈(δg的最小值為-10kcal/mol)，那么必須放棄該理論設(shè)計(jì)的引物而重新進(jìn)行設(shè)計(jì)；當(dāng)同一反應(yīng)體系中存在多重反應(yīng)引物，那么多重?cái)U(kuò)增的規(guī)模主要受限于引物之間的相互作用程度，從而影響核酸質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程；此外，為了準(zhǔn)確區(qū)分不同堿基之間的差異，特別是腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)(4種堿基中這二者分子量之間差值最小，為9da)，要求的寡核苷酸長(zhǎng)度一般不超過(guò)40個(gè)堿基，實(shí)際應(yīng)用中，質(zhì)譜檢測(cè)窗口的分子量范圍一般為4000～9000da，即要求所涉及的延伸引物和產(chǎn)物的分子量盡量分布在4000～9000范圍之內(nèi)。同時(shí)，要避免各延伸引物及其延伸產(chǎn)物之間的疊合。由此可見(jiàn)，并非所有已知的snp均可應(yīng)用于核酸質(zhì)譜尤其是多重核酸質(zhì)譜的檢測(cè)，其實(shí)際效果會(huì)受到多種實(shí)驗(yàn)因素的影響，因此需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證snp的可行性以及篩選不同引物的組合。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例四中，對(duì)c1樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖2為實(shí)施例四中，對(duì)c2樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖3為實(shí)施例四中，對(duì)c3樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖4為實(shí)施例四中，對(duì)c4樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖5為實(shí)施例四中，對(duì)c5樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖6為實(shí)施例四中，對(duì)c6樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖7為實(shí)施例四中，對(duì)c7樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖8為實(shí)施例四中，對(duì)c8樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖9為實(shí)施例四中，對(duì)c9樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖10為實(shí)施例四中，對(duì)c10樣本6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果。圖11為實(shí)施例四中，對(duì)c1樣本abcb1‐3435位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，從左至右三條虛線(xiàn)分別是延伸引物、突變型(t)延伸產(chǎn)物、野生型(c)延伸產(chǎn)物的理論峰值，檢測(cè)結(jié)果顯示該樣本為tc雜合。圖12為實(shí)施例四中，對(duì)c1樣本cyp2c19*17位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，從左至右三條虛線(xiàn)分別是延伸引物、野生型(c)延伸產(chǎn)物、突變型(t)延伸產(chǎn)物、的理論峰值，檢測(cè)結(jié)果顯示該樣本為cc純合。圖13為實(shí)施例四中，對(duì)c1樣本cyp2c19*2位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，從左至右三條虛線(xiàn)分別是延伸引物、野生型(g)延伸產(chǎn)物、突變型(a)延伸產(chǎn)物的理論峰值，檢測(cè)結(jié)果顯示該樣本為ga雜合。圖14為實(shí)施例四中，對(duì)c1樣本cyp2c19*3位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，從左至右三條虛線(xiàn)分別是延伸引物、突變型(a)延伸產(chǎn)物、野生型(g)延伸產(chǎn)物的理論峰值，檢測(cè)結(jié)果顯示該樣本為gg純合。圖15為實(shí)施例四中，對(duì)c1樣本cyp2c19*4位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，從左至右三條虛線(xiàn)分別是延伸引物、突變型(g)延伸產(chǎn)物、野生型(a)延伸產(chǎn)物的理論峰值，檢測(cè)結(jié)果顯示該樣本aa純合。圖16為實(shí)施例四中，對(duì)c1樣本cyp2c19*5位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，從左至右三條虛線(xiàn)分別是延伸引物、突變型(t)延伸產(chǎn)物、野生型(c)延伸產(chǎn)物的理論峰值，檢測(cè)結(jié)果顯示該樣本為cc純合。圖17為對(duì)6個(gè)位點(diǎn)均為野生型的質(zhì)粒a1‐a6的檢測(cè)結(jié)果，其中：峰1(4742.1)表示abcb1‐3435位點(diǎn)野生型(c)，峰2(5179.3)表示cyp2c19*4位點(diǎn)野生型(a)，峰3(5306.5)表示cyp2c19*5位點(diǎn)野生型(c)，峰4(5417.6)表示cyp2c19*3位點(diǎn)野生型(g)，峰5(6032)表示cyp2c19*17位點(diǎn)野生型(c)，峰6(6400.2)表示cyp2c19*2位點(diǎn)野生型(g)，圖18為對(duì)6個(gè)位點(diǎn)均為突變型的質(zhì)粒b1‐b6的檢測(cè)結(jié)果，其中：峰1(4726.1)表示abcb1‐3435位點(diǎn)突變型(t)，峰2(5099.4)表示cyp2c19*4位點(diǎn)突變型(g)，峰3(5290.5)表示cyp2c19*5位點(diǎn)突變型(t)，峰4(5401.6)表示cyp2c19*3位點(diǎn)突變型(a)，峰5(6111.9)表示cyp2c19*17位點(diǎn)突變型(t)，峰6(6480.1)表示cyp2c19*2位點(diǎn)突變型(a)，圖19為對(duì)照實(shí)施例一中，對(duì)c3樣本abcb1‐3435位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，顯示為ag(反向測(cè)序)雜合。圖20為對(duì)照實(shí)施例一中，對(duì)c3樣本cyp2c19*17位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，顯示為ct雜合。圖21為對(duì)照實(shí)施例一中，對(duì)c3樣本cyp2c19*2位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，顯示為tc(反向測(cè)序)雜合。圖22為對(duì)照實(shí)施例一中，對(duì)c3樣本cyp2c19*3位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，顯示為g純合。圖23為對(duì)照實(shí)施例一中，對(duì)c3樣本cyp2c19*4位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，顯示為a純合。圖24為對(duì)照實(shí)施例一中，對(duì)c3樣本cyp2c19*5位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，顯示為c純合。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例一：引物設(shè)計(jì)及合成。針對(duì)cyp2c19基因rs4244285(cyp2c19*2681g>a)、rs4986893(cyp2c19*3636g>a)、rs28399504(cyp2c19*41a>g)、rs56337013(cyp2c19*51297c>t)、rs12248560(cyp2c19*17‐806c＞t)和abcb1基因rs1045642(3435c>t)等6個(gè)與藥物代謝相關(guān)基因多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)特異性pcr引物核心序列(seqidno：1至seqidno：12)和特異性延伸引物核心序列(seqidno：13至seqidno：18)。其中，為了避免pcr引物進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測(cè)窗口而干擾檢測(cè)效果，每條pcr引物的5'端可以在核心序列(seqidno：1至seqidno：12)的基礎(chǔ)上增加一定數(shù)目的堿基，常見(jiàn)如10bp的tag(acgttggatg)，以使pcr引物的分子量增大，從而超出質(zhì)譜儀檢測(cè)窗口。相關(guān)引物在上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。實(shí)施例二：樣本dna提取。收集臨床患者，共10例。其中，樣本采集、dna提取等按照說(shuō)明書(shū)要求，采集人靜脈血，并以edta抗凝管收集。按照說(shuō)明書(shū)要求，采集的血液在2‐8℃保存不應(yīng)超過(guò)一周，‐20℃保存不應(yīng)超過(guò)一個(gè)月，并可采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸，建議盡量采用新鮮血液進(jìn)行基因組dna提取。由于本試劑盒不提供人基因組dna提取試劑，因此采用商業(yè)化的核酸提取試劑盒(如qiagen公司的dneasybloodandtissuekit)，從每位患者的200μl全血中提取人基因組dna，以nanodrop2000(thermo公司)定量，并標(biāo)化至30ng/μl(分別為c1‐c10)。其中，該試劑盒推薦對(duì)濃度為30ng/μl的人基因組dna進(jìn)行檢測(cè)，但對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，本試劑盒對(duì)濃度低至10ng/μl的人基因組dna也能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。按照說(shuō)明書(shū)要求，提取后的人基因組dna，在2‐8℃保存不應(yīng)超過(guò)一周，‐20℃保存不應(yīng)超過(guò)兩年，‐80℃可長(zhǎng)期保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，并置于冰盒中進(jìn)行運(yùn)輸。實(shí)施例三：生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。使用abi9700型pcr儀，按說(shuō)明書(shū)對(duì)6個(gè)與氯吡格雷抵抗基因相關(guān)的基因和abcb1基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)。試劑盒中用于pcr、pcr產(chǎn)物純化和單堿基延伸的組分見(jiàn)表3：表3.試劑盒組成序號(hào)組分名稱(chēng)主要成分包裝規(guī)格1反應(yīng)液idntps、tris、mgcl2270μl/管×1管2酶ipcr酶、ung酶22μl/管×1管3擴(kuò)增引物pcr引物100μl/管×1管4反應(yīng)液iitris、mgcl2170μl/管×1管5酶iisap酶30μl/管×1管6反應(yīng)液iiiddntps、tris、mgcl2100μl/管×1管7酶iii延伸酶4μl/管×1管8延伸引物延伸引物100μl/管×1管9陽(yáng)性質(zhì)控品—50μl/管×1管10陰性質(zhì)控品—50μl/管×1管其中各引物對(duì)濃度均為500nmol/l。按說(shuō)明書(shū)，具體操作方法如下：1.pcr擴(kuò)增1.1在pcr配液區(qū)，按照待檢樣本數(shù)，準(zhǔn)備對(duì)應(yīng)數(shù)量的pcr反應(yīng)管/孔，并標(biāo)記樣本編號(hào)。建議在每次pcr反應(yīng)中，陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和空白實(shí)驗(yàn)共同進(jìn)行分析。；1.2從試劑盒中取出pcr引物混合液、pcr反應(yīng)液，使其自然解凍，渦旋振蕩使其充分混勻，瞬時(shí)離心至管底；1.3根據(jù)樣本數(shù)目，按表4的比例取出各組分，置于一個(gè)離心管中混勻后，向每個(gè)pcr反應(yīng)管/孔中加入4μl。建議適當(dāng)放大配制體積，避免因移液器吸頭殘留等因素造成最后不夠分裝的現(xiàn)象。表4.pcr反應(yīng)體系組分名稱(chēng)單反應(yīng)體積反應(yīng)液i2.78μl酶i0.22μl擴(kuò)增引物1.00μl合計(jì)4.00μl1.4在pcr擴(kuò)增區(qū)內(nèi)向每個(gè)已加入pcr混合物的pcr管/孔中加入1μl待測(cè)樣本，混勻后瞬時(shí)離心。此時(shí)每份pcr反應(yīng)體系總體積為5μl。其中，陰，陽(yáng)性質(zhì)控分別加入陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，空白對(duì)照加入純化水。1.5將加入pcr混合物、待測(cè)樣本的pcr管/孔置于pcr擴(kuò)增儀內(nèi)，按表5的程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。表5.pcr反應(yīng)熱循環(huán)程序2.sap酶消化2.1從試劑盒中取出sap反應(yīng)所需的各組分，室溫融化后振蕩混勻，瞬時(shí)離心后使用。2.2在pcr配液區(qū)，根據(jù)樣本數(shù)目，按表6的比例取出各組分，置于一個(gè)離心管中混勻后，向每個(gè)pcr反應(yīng)產(chǎn)物中加入2μlsap混合物。建議適當(dāng)放大配制體積，避免因移液器吸頭殘留等因素造成最后不夠分裝的現(xiàn)象。表6.sap酶消化反應(yīng)體系組分名稱(chēng)單反應(yīng)體積反應(yīng)液ii1.7μl酶ii0.3μl合計(jì)2.0μl2.3將加入sap混合物的pcr管/孔置于pcr擴(kuò)增儀內(nèi)，按下表7的程序進(jìn)行反應(yīng)。表7.sap酶消化反應(yīng)程序溫度(℃)時(shí)間(分)循環(huán)數(shù)3740185514hold3.延伸3.1在pcr配液區(qū)，根據(jù)樣本數(shù)目，按表8的比例取出延伸反應(yīng)各組分，置于一個(gè)離心管中混勻后，向每管sap酶消化產(chǎn)物中加入2μl，混勻后瞬時(shí)離心，此時(shí)每管內(nèi)液體體積為9μl。由于分裝過(guò)程中，移液器吸頭殘留等因素可能造成不足以分裝出所需的份數(shù)，建議適當(dāng)放大配制體積。表8.延伸反應(yīng)體系組分名稱(chēng)單反應(yīng)體積反應(yīng)液iii1.019μl酶iii0.041μl延伸引物0.940μl合計(jì)2.000μl3.2將裝有延伸混合物、sap酶消化產(chǎn)物的pcr管/孔置于pcr擴(kuò)增儀內(nèi)，執(zhí)行下表9程序。表9.延伸反應(yīng)程序4.純化延伸反應(yīng)完畢后，在pcr擴(kuò)增區(qū)向每pcr管/孔延伸產(chǎn)物中加入41μl純水和15mg樹(shù)脂，顛倒混勻30分鐘，13000rpm離心10min。5.點(diǎn)樣將純化后的產(chǎn)物點(diǎn)樣至靶片。實(shí)施例四：上機(jī)檢測(cè)及結(jié)果判讀。使用北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司生產(chǎn)的clin‐tof型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)點(diǎn)樣后的靶片進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判斷。另外，分別設(shè)置以上位點(diǎn)的野生型對(duì)照a1‐a6、突變型對(duì)照b1‐b6。其中，野生型對(duì)照a1‐a6、突變型對(duì)照b1‐b6分別來(lái)自市售或?qū)嶒?yàn)室保藏的人工質(zhì)粒。本發(fā)明中所用的野生型對(duì)照質(zhì)粒a1‐a6和突變型對(duì)照質(zhì)粒b1‐b6，為在商品化質(zhì)粒pmd18‐tvector(takara公司)的基礎(chǔ)上，根據(jù)《分子克隆》記載的常規(guī)方法，用引物和正常人dna進(jìn)行pcr后，將pcr產(chǎn)物插入pmd18‐tvector，即構(gòu)建野生型質(zhì)粒a1‐a6，再分別定點(diǎn)突變，即構(gòu)建6個(gè)突變型質(zhì)粒b1‐b6。所述質(zhì)粒a1‐a6和b1‐b6可長(zhǎng)期保存于‐20℃甘油中，用時(shí)活化并提取質(zhì)粒dna。如前述表2所示，6條延伸引物及它們?cè)?個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)上根據(jù)各自基因型產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物具有不同的分子量，這些分子量對(duì)應(yīng)各自的質(zhì)譜峰，若在某分子量處出現(xiàn)質(zhì)譜峰，則判斷為存在與該分子量對(duì)應(yīng)的物質(zhì)(延伸引物或產(chǎn)物)：判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)若野生型和突變型對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰均未出現(xiàn)，無(wú)論延伸引物對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰是否存在，均判斷為實(shí)驗(yàn)失??；(2)若野生型或突變型對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰僅出現(xiàn)一個(gè)，則判斷為所出現(xiàn)質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)的基因型的純合型；(3)若野生型或突變型對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰均出現(xiàn)，則判斷為雜合型。質(zhì)譜結(jié)果如圖1‐19所示，其中圖18為6個(gè)snp位點(diǎn)均為野生型的質(zhì)粒a1‐a6的質(zhì)譜圖，圖19為6個(gè)snp位點(diǎn)均為突變型的質(zhì)粒b1‐b6的質(zhì)譜圖。以前述表2所示各位點(diǎn)延伸引物及延伸產(chǎn)物的分子量檢查樣本c1‐c10的質(zhì)譜結(jié)果(圖1‐10)，確定各snp位點(diǎn)的基因型，結(jié)果如表10所示：表10.樣本c1‐c10格snp位點(diǎn)基因型c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10abcb1‐3435tctctctttctcccccyp2c19*17ccctcccctccccyp2c19*2gagagaggaagaggacyp2c19*3gagggggggggcyp2c19*4aaaaaaaaaacyp2c9*5cccccccccc即在10例患者中，共檢測(cè)出rs1045642位點(diǎn)tc雜合型5例，tt純合突變型2例，rs12248560位點(diǎn)ct雜合型2例，rs4244285位點(diǎn)ga雜合型5例，aa純合突變2例，rs4986893位點(diǎn)ag雜合型1例。對(duì)照實(shí)施例一、pcr測(cè)序驗(yàn)證一、根據(jù)實(shí)施例1，使用以下如表11所示引物，對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序：表11.各位點(diǎn)測(cè)序引物二、樣本dna來(lái)源為使不同實(shí)驗(yàn)之間產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有可比性，測(cè)序驗(yàn)證采用實(shí)施例二中從10例患者體內(nèi)采集的靜脈血中提取的人基因組dna(c1‐c10)。三、測(cè)序鑒定1、pcr反應(yīng)體系為25μl2、反應(yīng)條件：反應(yīng)在abi公司9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72℃延伸7分鐘，4℃保存。1、pcr產(chǎn)物純化和測(cè)序(1)向裝有pcr產(chǎn)物的96孔板中加入50微升洗滌緩沖液，混勻。(2)將其轉(zhuǎn)移到millipore純化板中，放到真空泵上抽濾約3分鐘，看到純化板中沒(méi)有水即可。(3)向純化板中再次加入50微升的洗滌緩沖液，繼續(xù)抽濾，直到純化板中沒(méi)有水為止。(4)將純化板從真空泵上取下，向板中加入20微升的去離子水，靜置15分鐘。(5)再震蕩15分鐘，然后吸到一新96孔板內(nèi)。測(cè)序反應(yīng)所需試劑應(yīng)為新鮮配制，需要經(jīng)高壓滅菌的試劑必須滅菌后方可使用。測(cè)序反應(yīng)所需的器材(如384孔板、tip頭等)同樣應(yīng)為潔凈無(wú)菌的。(6)為了保證測(cè)序樣本及反應(yīng)試劑的新鮮，加樣時(shí)應(yīng)在冰上操作。(7)測(cè)序反應(yīng)體系為5μl，各種試劑加入量如下：pcr產(chǎn)物3‐10ng，bigdyev3.10.25μl，5*bigdyebuffer0.875μl，引物1.6pmol；(8)樣品放于pcr儀上做如下反應(yīng)：步驟：95℃，5分；95℃，10秒；60℃，4分；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；4℃保持直到準(zhǔn)備純化。(9)在每個(gè)孔中加入20μl80％乙醇，4,000rpm離心30min；(10)將樣品板放在折好的紙巾上，在離心機(jī)中倒甩，倒甩時(shí)速率1000rpm；(11)在每孔中加入30μl70％乙醇，4000rpm離心10min，倒甩；(12)重復(fù)第11步的操作2次；(13)將樣品板放于干凈的抽屜中，避光干燥30min；(14)加人5μl甲酰胺，封膜，離心后置于‐20℃冰箱中；(15)測(cè)序儀前95℃變性5分鐘，放置冰上2分鐘，離心后上樣；(16)使用abi3730xl型遺傳分析儀進(jìn)行序列測(cè)定。四、結(jié)果對(duì)c1‐c10樣本，使用上表所述的引物，分別對(duì)rs1045642，rs12248560，rs4244285，rs4986893，rs28399504，rs56337013(分別編號(hào)序列1‐6)進(jìn)行測(cè)序，共計(jì)60次測(cè)序。根據(jù)測(cè)序的附圖19‐24，最終測(cè)序結(jié)果如表12所示：表12.各位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果匯總患者編號(hào)序列1序列2序列3序列4序列5序列6c1tccgagacc2tccgaagacc3tcctgagacc4tcggacc5tcgagacc6tccagacc7tcctggacc8ccagacc9ccggacc10ccgagac經(jīng)過(guò)比較，表10的結(jié)果與表12完全一致，說(shuō)明本發(fā)明檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。對(duì)照實(shí)施例二、大范圍用藥人群的氯吡格雷抵抗測(cè)試1、檢測(cè)樣本對(duì)北京、廣州兩地的醫(yī)院149例需要接受皮冠狀動(dòng)脈介入治療pci的中外患者(如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，等)，收集患者的血樣，按照實(shí)施例一‐四的方法進(jìn)行測(cè)試。其中測(cè)試組a：擴(kuò)增引物僅僅包含seqidno:7‐8和11‐12，延伸引物僅僅包括seqidno:16和18。測(cè)試組b：包含本發(fā)明所有引物系統(tǒng)。2、檢測(cè)結(jié)果對(duì)于測(cè)試組a，cyp2c19*2有72例(48.3％)，cyp2c19*3有23例(15.4％)。在以上兩種snp類(lèi)型中，其中有9例是同時(shí)為cyp2c19*2/*3(6.0％)。另外，經(jīng)計(jì)算，約有31.23％的患者adp(二磷酸腺苷)抑制率小于20％，adp抑制率介于20％‐50％的患者約44.87％。而對(duì)于測(cè)試組b，除了以上cyp2c19*2、*3的檢測(cè)數(shù)據(jù)之外，另有5例為cyp2c19*4，3例為cyp2c19*5，1例為abcb1多態(tài)性。在以上類(lèi)型中，其中有2例同時(shí)為cyp2c19*2/*4，1例同時(shí)為cyp2c19*2/*3/*4，1例同時(shí)為cyp2c19*2/*5。由此，經(jīng)計(jì)算，所述149例患者中，對(duì)adp(二磷酸腺苷)抑制率小于20％的數(shù)量應(yīng)為37.79％，adp抑制率介于20％‐50％的患者約40.54％，即adp抑制率處于正常范圍的患者數(shù)量相比于測(cè)試組a明顯減少。此外，對(duì)于測(cè)試組b中，cyp2c19*17共有18例，其中8例為cyp2c19*2，1例為cyp2c19*3，1例為cyp2c19*2/*4，9例為未含有上述5種基因多態(tài)性的患者。因此，根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于未檢測(cè)出以上位點(diǎn)的患者，在pci術(shù)前常規(guī)服用阿司匹林300mg、波利維(硫酸氫氯吡格雷)300mg，急性心肌梗死pci術(shù)后服用拜阿司匹林300mg/天，服用1個(gè)月后減量為100mg/天，長(zhǎng)期維持；波利維75mg/天，至少口服12個(gè)月。對(duì)于這9例僅含有cyp2c19*17的患者，應(yīng)下調(diào)阿司匹林和波利維劑量，合理應(yīng)用抗血小板藥物，必要時(shí)聯(lián)用ppi和胃黏膜保護(hù)劑可減少出血。對(duì)于所有接受抗血小板治療的患者，都需要進(jìn)行出血監(jiān)測(cè)，盡早發(fā)現(xiàn)患者出血跡象。而對(duì)于含有以上多種多態(tài)性位點(diǎn)的患者，則需要根據(jù)氯吡格雷抵抗和氯吡格雷強(qiáng)反應(yīng)(即cyp2c19*17的強(qiáng)化血小板影響)，合理選擇抗血小板的治療方案。由此可見(jiàn)，相比于僅僅針對(duì)cyp2c19*2/*3兩種等位基因進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明更能全面適應(yīng)中國(guó)境內(nèi)患者對(duì)于氯吡格雷抵抗用藥篩查的需要，有利于合理選擇抗血小板的治療方案。sequencelisting<110>北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司<120>cyp2c19和abcb1基因檢測(cè)試劑盒<130>2016<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>1actgcagcattgctgagaac20<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>2aaggcatgtatgttggcctc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>3agtgcaagctcacggttgtc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>4gagcacaaggaccacaaaag20<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>5catgaggagtaacttctccc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>6taaaaacagctccatgcggg20<210>7<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>7gactgtaagtggtttctcag20<210>8<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>8aacatcaggattgtaagcac20<210>9<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>9aggtcttctgatgcccatcg20<210>10<211>19<212>dna<213>人工合成序列<400>10aacaaagttttagcaaacg19<210>11<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>11gcaataattttcccactatc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>12tccatcgattcttggtgttc20<210>13<211>15<212>dna<213>人工合成序列<400>13ctttgctgccctcac15<210>14<211>16<212>dna<213>人工合成序列<400>14accacaaaaggatcca16<210>15<211>17<212>dna<213>人工合成序列<400>15ctctcccacacaaatcc17<210>16<211>17<212>dna<213>人工合成序列<400>16attgtaagcaccccctg17<210>17<211>19<212>dna<213>人工合成序列<400>17gtgtcttctgttctcaaag19<210>18<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>18agtaatttgttatgggttcc20當(dāng)前第1頁(yè)12