本發(fā)明涉及表達(dá)載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備膜蛋白CD14抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

CD14有mCD14和sCD14兩種類型，是細(xì)胞表面的糖蛋白，其生物學(xué)功能主要是識(shí)別、結(jié)合LPS或LPS/LBP復(fù)合物，介導(dǎo)LPS所致的細(xì)胞反應(yīng)，在LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中起重要作用。篩選出能識(shí)別CD14分子的抗體，對(duì)研究CD14分子的功能及整個(gè)通路都具有重要作用。若能夠完全封閉CD14的功能，特異性的阻斷CD14與LPS及LPS/LBP復(fù)合物結(jié)合，就能夠防止或中止LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)于臨床治療內(nèi)毒素血癥、內(nèi)毒素休克等也將會(huì)較好的應(yīng)用前景。

膜蛋白表達(dá)成本較高，常規(guī)的抗體制備方法，無(wú)論是單克隆抗體還是多克隆抗體，均需要制備大量的膜蛋白用于免疫和檢測(cè)。用噬菌體展示的抗體庫(kù)的篩選方法，只需要少量的抗原就可以完成篩選和檢測(cè)。同時(shí)，由于膜蛋白本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，外源表達(dá)的膜蛋白在構(gòu)象上并不能完全模擬細(xì)胞表面的膜蛋白，導(dǎo)致用外源蛋白免疫的方法制備的抗體不能很好識(shí)別細(xì)胞表達(dá)的膜蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種制備膜蛋白CD14抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，該方法構(gòu)建的表達(dá)載體能夠進(jìn)行高效表達(dá)，以解決CD14抗體表達(dá)量低，不能很好識(shí)別細(xì)胞表達(dá)的膜蛋白的問(wèn)題。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種制備膜蛋白CD14抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟(1)：以人外周血單核細(xì)胞(PBMC)為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后，提取脾臟總RNA，在兩端序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)核苷酸序列表，分別以引物VH對(duì)和引物VL對(duì)擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；

步驟(2)：將助表達(dá)序列的基因、組氨酸標(biāo)簽基因和β2微球蛋白基因分別連接到重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)得到目的片段，所述助表達(dá)序列的基因序列見(jiàn)序列表1；

步驟(3)：在重鏈可變區(qū)的上游和輕鏈可變區(qū)下游分別引入雙酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR技術(shù)將目的片段克隆到載體pFUSEss-CHIg-hG1上，即獲得膜蛋白CD14表達(dá)載體。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(2)中，通過(guò)SOE-PCR方法或平端連接方法將助表達(dá)序列的基因連接到重鏈可變區(qū)的上游，將組氨酸標(biāo)簽基因和β2微球蛋白基因連接到輕鏈可變區(qū)下游。

作為進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(3)中，通過(guò)PCR技術(shù)將目的片段克隆到載體pFUSEss-CHIg-hG1上，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行菌落PCR，篩選陽(yáng)性單克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重鏈表達(dá)質(zhì)粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達(dá)質(zhì)粒。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體能夠在系統(tǒng)中進(jìn)行高效表達(dá)，通過(guò)重組抗體技術(shù)制備表達(dá)量高的CD14抗體，能更好地識(shí)別膜蛋白。

附圖說(shuō)明

圖1為以實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)載體制備的膜蛋白CD14抗體的WB驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖2為以實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)載體制備的膜蛋白CD14抗體的IF驗(yàn)證結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅是范例性的，僅用以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做更進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍內(nèi)，對(duì)技術(shù)方案進(jìn)行的修改或者替換均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明的一種制備膜蛋白CD14抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟(1)：以人外周血單核細(xì)胞(PBMC)為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后，提取脾臟總RNA，在兩端序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)核苷酸序列表，分別以引物VH對(duì)和引物VL對(duì)擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；

步驟(2)：將助表達(dá)序列的基因、組氨酸標(biāo)簽基因和β2微球蛋白基因分別連接到重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)得到目的片段，所述助表達(dá)序列的基因序列見(jiàn)序列表1；

步驟(3)：在重鏈可變區(qū)的上游和輕鏈可變區(qū)下游分別引入雙酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR技術(shù)將目的片段克隆到載體pFUSEss-CHIg-hG1上，即獲得膜蛋白CD14表達(dá)載體。

步驟(2)中，通過(guò)SOE-PCR方法或平端連接方法將助表達(dá)序列的基因連接到重鏈可變區(qū)的上游，將組氨酸標(biāo)簽基因和β2微球蛋白基因連接到輕鏈可變區(qū)下游。β2微球蛋白基因能將不易表達(dá)的外源蛋白連接在β2m基因下游，能使外源蛋白高效表達(dá)。

步驟(3)中，在重鏈可變區(qū)的上游和輕鏈可變區(qū)下游分別用內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切引入雙酶切位點(diǎn)，載體pFUSEss-CHIg-hG1用同樣的內(nèi)切酶雙酶切，然后用T4DNA連接酶將載體和目的片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行菌落PCR，篩選陽(yáng)性單克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重鏈表達(dá)質(zhì)粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達(dá)質(zhì)粒。

實(shí)施例1

本發(fā)明的一種制備膜蛋白CD14抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟(1)：以人外周血單核細(xì)胞(PBMC)為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，在取小鼠脾臟前3d加強(qiáng)免疫一次，測(cè)定抗血清效價(jià)，取效價(jià)高的小鼠，提取脾臟總RNA，在兩端序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)核苷酸序列表，分別以引物VH對(duì)和引物VL對(duì)擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性5min，94℃45s，58℃1min，72℃45s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

步驟(2)：通過(guò)SOE-PCR方法或平端連接方法將助表達(dá)序列的基因連接到重鏈可變區(qū)的上游，將組氨酸標(biāo)簽基因和β2微球蛋白基因連接到輕鏈可變區(qū)下游得到目的片段，所述助表達(dá)序列的基因序列見(jiàn)序列表1；PCR反應(yīng)如下:首先在常規(guī)PCR反應(yīng)體系(50μL)中加入等摩爾VL、VH基因,94℃預(yù)變性5min，94℃45s，68℃1min，72℃45s，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

步驟(3)：在重鏈可變區(qū)的上游和輕鏈可變區(qū)下游分別用內(nèi)切酶AgeI和NcoI進(jìn)行雙酶切引入酶切位點(diǎn)SfiⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，37℃過(guò)夜，載體pFUSEss-CHIg-hG1用同樣的內(nèi)切酶雙酶切，然后用T4DNA連接酶將載體和目的片段進(jìn)行連接，16℃下過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日隨機(jī)挑取8個(gè)平板上單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選陽(yáng)性單克隆菌落，擴(kuò)增提取得到pFUSEss_CHIg重鏈表達(dá)質(zhì)粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達(dá)質(zhì)粒。

表1核苷酸序列表

實(shí)施例2

通過(guò)實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)載體制備膜蛋白CD14抗體的方法如下：將獲得的pFUSEss_CHIg重鏈表達(dá)質(zhì)粒和pFUSE2ss_CLIg輕鏈表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)?；旌希ㄟ^(guò)PEI緩釋液轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染前將293T細(xì)胞傳代，保證細(xì)胞匯合度達(dá)到80％～85％，將DNA稀釋液和PEI稀釋液混合，靜置5min后加入293T細(xì)胞中，放于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h取樣檢測(cè)抗體是否表達(dá)，根據(jù)檢測(cè)情況確定收樣時(shí)間；用抗性篩選含有兩種質(zhì)粒的細(xì)胞株293T細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞株后得到CD14抗體。

1、通過(guò)ELISA檢測(cè)293T細(xì)胞株

以抗人KAPPA鏈抗體用包被酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜，5％牛奶封閉液封閉2h；，分別加入正常未轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清(-)和人IgG標(biāo)準(zhǔn)品(100ng/mL---+)和293T細(xì)胞表達(dá)上清，各100μL，37℃孵育30min，用ELISA洗滌液洗5次，3min/次；將HRP標(biāo)記的羊抗人IgG Fcγ特異性抗體用ELISA稀釋液稀釋后，分別加入孔中，37℃孵育30min，用ELISA洗滌液洗5次，3min/次；加入顯色液100μL/孔，37℃避光顯色10min，最后加入50μL/孔2mol/L硫酸終止，用酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果確定抗生素雙篩選的293T細(xì)胞株的抗體分泌能力。

2、用Western blot方法檢測(cè)實(shí)施例2篩選出來(lái)的CD14抗體

WB選取HepG2細(xì)胞，A549細(xì)胞，HEK293細(xì)胞，Jurkat細(xì)胞和K562細(xì)胞，裂解后，使用制得的重組抗體作為一抗，進(jìn)行WB試驗(yàn)。結(jié)果如圖1所示。

3、用免疫熒光檢測(cè)實(shí)施例2篩選出來(lái)的CD14抗體

采用石蠟切片和SABC法進(jìn)行，結(jié)果如圖2所示。

<110> 武漢華美生物工程有限公司

華, 權(quán)高

<120> 一種制備膜蛋白CD14抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建方法

<130> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr

20 25