本發(fā)明涉及微生物技術領域，更具體地，涉及一種韋司梅擬盤多毛孢camt66351及其應用。

背景技術：

螻蛄蟲草是一種生長方式與冬蟲夏草相似的菌體蟲體復合體，即真菌感染螻蛄蟲體，分解蟲體體內(nèi)組織以及利用其營養(yǎng)物質(zhì)以獲得能量來源，進而形成螻蛄蟲草。螻蛄蟲草雖極為少見，但蟲草中所含的有效活性物質(zhì)具有醫(yī)療保健的功效。野生蟲草生長于高海拔地區(qū)，蟲草中含氨基酸、核苷、糖類、醇類和維生素及有機酸等15種微量元素。《本草綱目拾遺》提到，蟲草“功與人參同”，此外，其藥理功能包含治療哮喘，支氣管和炎癥，對腎臟有利，治療腎炎，免疫調(diào)節(jié)，治療老人和病后的一般性衰弱。此外，前人通過建立動物模型，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草提取物可降低淋巴結變，緩解蛋白尿和提高腎功能的作用。故蟲草一直被視為珍貴的滋補品，與鹿茸、人參并稱為“中藥三大寶”。但隨著近些年生態(tài)環(huán)境被破壞，蟲草資源越來越貧乏，價格一路彪升，從上世紀九十年代中期的每斤六七百元猛漲到現(xiàn)在的十六七萬。所幸，人們發(fā)現(xiàn)通過人工種植獲得大量無性狀菌株，單獨培養(yǎng)后提取其中的活性物質(zhì)，應用于食用藥用行業(yè)可成為新型產(chǎn)品。

蟲草內(nèi)生菌種類繁多，與蟲草菌共生、伴生或異生，同時分離產(chǎn)生代謝物，天然蟲草及其微環(huán)境中含多種內(nèi)生菌，有些內(nèi)生菌的營養(yǎng)價值甚至高于蟲草菌本身，成為蟲草研究的一大方向，開發(fā)與冬蟲夏草、蛹蟲草具有相似營養(yǎng)價值的蟲草新品種。可見，對蟲草菌株形態(tài)研究是極其重要的。目前，關于蟲草菌的文章報道較多，但是，關于螻蛄蟲草，特別是從中分離無性菌株的文章較少見。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，提供一種從螻蛄蟲草中分離獲得的韋司梅擬盤多毛孢camt66351。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述韋司梅擬盤多毛孢camt66351的應用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：

一種韋司梅擬盤多毛孢camt66351(拉丁文名為pestalotiopsisvismiaecamt66351)，該真菌于2016年12月26日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmccno：60135。

優(yōu)選地，該真菌的菌落不規(guī)則生長，表面干燥，乳白色，有孢子散落；有菌絲，無隔膜，孢子呈顆粒狀。

優(yōu)選地，該真菌的its序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明還提供含有所述韋司梅擬盤多毛孢camt66351的微生物制劑。

本發(fā)明還提供所述韋司梅擬盤多毛孢camt66351在產(chǎn)核苷中的應用；優(yōu)選地，所述核苷為腺苷、鳥甘、尿苷和肌苷。

本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)核苷的方法，將所述韋司梅擬盤多毛孢camt66351接種于液體培養(yǎng)基中20℃恒培養(yǎng)一段時間即可。

更優(yōu)選地，是將所述韋司梅擬盤多毛孢camt66351接種于大米液體培養(yǎng)基中，于20℃，無光照條件下培養(yǎng)7天左右即可。

具體地，所述液體培養(yǎng)基為大米培養(yǎng)基，所述大米培養(yǎng)基的組成為：大米45g，葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母浸粉10g、kh2po42g、mgso42g，加水至1000ml，ph值調(diào)至5.5。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種通過對蟲草內(nèi)生真菌的分離及性狀變化分析，利用不同培養(yǎng)基對螻蛄蟲體、爪子進行培養(yǎng)分離、純化，分離篩選出一種韋司梅擬盤多毛孢camt66351，該真菌于2016年12月26日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmccno：60135。該菌在大米培養(yǎng)基、20℃、無光照的條件下，生長狀況最好，且能產(chǎn)含量較高的核苷，該真菌的發(fā)現(xiàn)有望實現(xiàn)體外核苷的大量發(fā)酵和生產(chǎn)，具有廣泛的應用價值。

附圖說明

圖1為標準品的hplc圖譜。

圖2為camt66351的hplc圖譜。

圖3為camt66351的發(fā)育樹。

圖4為camt66351的鏡檢圖(400倍)。

圖5為camt66351的菌落形態(tài)圖。

具體實施方式

下面將結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制；不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領域技術人員所熟知的常規(guī)方法和技術，試劑或材料均為通過商業(yè)途徑得到。

實施例1菌株分離、篩選與鑒定

一、樣品處理

螻蛄蟲草樣品用尼龍-聚乙烯袋(7×10cm透明食品真空袋)包裝完好，置于低溫下保存，待用。先用自來水沖洗15min，再用無菌生理鹽水淋洗3次，然后用75％的乙醇進行消毒，最后用無菌生理鹽水沖洗干凈即可。于無菌操作臺上用已高溫干燥滅菌的鑷子和剪刀，把蟲體跟爪子分開，并剪碎；稱取蟲體樣品、爪子樣品各5.0g，分別置于盛有45ml生理鹽水的錐形瓶內(nèi)，制成1：10的樣品勻液，即蟲體樣品液、爪子樣品液。

準備好盛有9ml生理鹽水的無菌試管，用1ml無菌移液槍吸取1：10樣品液1ml，沿著試管壁緩慢注入，充分震蕩試管使樣品液與生理鹽水混合均勻，制成1：100的樣品勻液，按同樣方法制成1：1000樣品勻液。

蟲體樣液：分別稀釋至10^-1、10^-2、10^-3三個梯度；密封置于冰箱中待用。

爪子樣液：分別稀釋至10^-1、10^-2、10^-3三個梯度；密封置于冰箱中待用。

二、培養(yǎng)基配方

(1)大米培養(yǎng)基：大米稱取45g，用蒸餾水浸泡至軟化，放入研缽中研磨，至碾磨成小顆粒狀或完全磨碎，用紗布過濾后，得渾濁大米水，加入葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母浸粉10g、kh2po42g、mgso42g，固態(tài)培養(yǎng)基加瓊脂粉15g，加水至1000ml，ph值調(diào)至5.5。

(2)馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮后，稱取45g，煮至完全軟化，用紗布過濾除渣，得濾液；加葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母浸粉10g、kh2po42g、mgso42g，固態(tài)培養(yǎng)基加瓊脂粉15g，同時加水至1000ml，將ph值調(diào)至5.5。

(3)pda培養(yǎng)基：按培養(yǎng)基說明書配制。

三種培養(yǎng)基煮至沸騰數(shù)分鐘，待冷卻至50℃，分裝入三角瓶，用牛皮紙包扎完好放入立式壓力蒸汽滅菌器中，調(diào)至121℃，20min進行滅菌，冷卻50℃后倒平板備用。具體培養(yǎng)基配方見表1。

三、菌株分離及培養(yǎng)

(1)涂布平板法：將已滅菌培養(yǎng)基冷卻至50℃倒入無菌平皿內(nèi)，制成無菌平板，冷卻凝固后，用1ml無菌移液槍分別取各個梯度的稀釋液1ml，滴加在平板表面，用無菌涂布棒把樣品液均勻地涂布開。

(2)稀釋平板法：用1ml無菌移液槍分別取各個梯度的稀釋液1ml，滴加在平皿上，將冷卻至50℃的培養(yǎng)基倒入無菌平皿內(nèi)，緩慢旋轉，使樣品液與培養(yǎng)基充分混合。

(3)平板劃線法：將溫度為50℃的培養(yǎng)基倒入無菌平皿內(nèi)，制成無菌平板，冷卻凝固后，用接種環(huán)蘸取各個梯度的稀釋液，在無菌平板進行連續(xù)劃線；待平板表面的菌液被吸收，翻轉平板，置20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察記錄菌落生長情況。

實驗結果顯示，馬鈴薯培養(yǎng)基與大米培養(yǎng)基所表現(xiàn)出的菌落形狀無明顯區(qū)別，但與pda培養(yǎng)基中的菌落差異明顯，主要表現(xiàn)為菌落數(shù)量少，甚至不生長現(xiàn)象。其中大米培養(yǎng)基菌落數(shù)為12種，包含爪子與蟲體分離所得菌落，馬鈴薯培養(yǎng)基為9種，pda培養(yǎng)基1種。

四、菌株純化及傳代培養(yǎng)

從培養(yǎng)基中選擇具有典型蟲草菌形態(tài)特征的菌落，進行純化培養(yǎng)，即在相同的培養(yǎng)條件下，根據(jù)培養(yǎng)時間的變化，觀察菌落形態(tài)的改變。由初次分離、純化第二代、純化第三代、純化第四代至純化第五代，直至菌落形態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)。

統(tǒng)計菌落數(shù)，選取最具代表性的菌落進行傳代培養(yǎng)。蟲體樣液、爪子樣液中初步分離出的菌落有12種。初步分離出的菌落較雜亂，共有12種，分別命名為4#，5#，6#，7#，8#，9#，10#，11#，將初分所得的菌落進行純化第一代培養(yǎng)，7天后顯微鏡觀察，獲悉，菌落4#、5#、6#為同種，菌落7#、8#、9#、10#、11#為同種，故純化第二代所得菌落數(shù)為2種。培養(yǎng)至第三代，進行第四、第五代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌落的形態(tài)無明顯變化，趨于穩(wěn)定態(tài)，菌落形態(tài)變化見表2。

表2菌落形態(tài)變化圖

五、菌落的顯微形態(tài)觀察

選擇生長良好的菌株進行顯微鏡觀察，無菌操作臺上進行，把接種環(huán)在酒精燈下燒紅滅菌后，從固體培養(yǎng)基中選擇生長良好的菌落，輕輕挑取或刮取菌絲，放在滴有染色液的載玻片上，輕輕將菌絲展開，染色液分別為棉酚藍、結晶紫、75％酒精，用濾紙吸取多余的水分，蓋上蓋玻片，放于顯微鏡下觀察。

鏡檢結果，4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、11#為同種菌落，命名為camt66351，用電子顯微鏡進行觀察時，以結晶紫為染色劑，添加背景色便于觀看，用油鏡觀察，所得結果見表2。

營養(yǎng)菌絲，氣生菌絲，繁殖菌絲中，以氣生菌絲較易觀察，而營養(yǎng)菌絲生長在培養(yǎng)基的基質(zhì)中，可于顯微鏡下觀察其形態(tài)。前期采用了多種染色劑為背景，以結晶紫為染色劑觀察到的菌絲最優(yōu)。顯微鏡下可觀察到明顯的菌絲，有隔膜，局部菌絲有點狀至透明現(xiàn)象。菌絲的產(chǎn)生過程是絲狀真菌孢子落在適宜的培養(yǎng)基質(zhì)上后，發(fā)生萌芽生長。pda培養(yǎng)基中未出現(xiàn)長菌絲得菌落，表明該培養(yǎng)基不適宜螻蛄蟲草內(nèi)生真菌的生長。

表3菌落形態(tài)

六、菌株的分子鑒定

確定其its序列如seqidno：1所示，因此，該菌屬于真菌門、真子囊菌亞綱、鹿角菌目、麥角菌科、蟲草屬，螻蛄蟲草種，無性型韋司梅擬盤多毛孢，拉丁文名為pestalotiopsisvismiaecamt66351(簡稱pv-51)。

將分離篩選得到的菌株camt66351保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏地址是廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年12月26日，保藏編號為gdmccno：60135。

實施例2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

將經(jīng)過純化的，并且形態(tài)穩(wěn)定的菌株進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。采用馬鈴薯液態(tài)培養(yǎng)基、大米液態(tài)培養(yǎng)基兩種進行培養(yǎng)。先將純菌種接種到試管液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7天，將整支試管中的培養(yǎng)基及菌落倒入液態(tài)三角瓶培養(yǎng)基，于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以獲得高產(chǎn)量的菌絲，便于后期的營養(yǎng)素含量測定。

蟲草菌內(nèi)生真菌分離株在三種培養(yǎng)基中生長效果由好至差依次是：大米培養(yǎng)基，馬鈴薯培養(yǎng)基，pda培養(yǎng)基，可根據(jù)大米培養(yǎng)基配方的營養(yǎng)素含量設計更可觀的培養(yǎng)基質(zhì)，其中大米培養(yǎng)基與馬鈴薯培養(yǎng)基的生長效果相似，菌落形態(tài)無明顯變異，表明天然氮源的培養(yǎng)基較好。

一、hplc測定營養(yǎng)素含量

樣品制備：于研缽中將螻蛄蟲草內(nèi)生菌磨碎，過60目篩，用分析天平精確稱取0.500g樣品，加水10ml，超聲30min后離心，吸取出上清液后再加10ml提取試劑，超聲30min，離心，合并上清液，用水定容至25ml，經(jīng)0.45ul微孔膜過濾備用。

標準溶液制備：精密稱取適量肌苷、腺苷、尿苷和鳥苷標準品，溶解于少量甲醇中，用水定容配制成0.3mg/ml的標準儲備液。并逐級稀釋成0.1，0.05，0.02，0.001，0.0005mg/ml的標準溶液備用。

測定條件：色譜柱：vp-ods(5um，φ4.6×250mm)，柱溫：30℃，進樣體積：10ul，流動相：甲醇：水＝75：25，流量：1ml/min，檢測波長：260nm。

將camt66351進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后，采用高效液相色譜技術檢測核苷含量。由色譜圖圖1至圖2可知，在大米培養(yǎng)基的條件下，菌株camt66351四種核苷均有一定含量，即說明具有蟲草菌的活性成分，可能是蟲草菌的無性狀菌株。

表4待測菌株hplc檢測四種核苷的含量

sequencelisting

<110>廣東海洋大學

<120>一種韋司梅擬盤多毛孢camt66351及其應用

<130>

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>camt66351的its序列

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