本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的嗜熱擬青霉菌株固態(tài)發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，簡(jiǎn)稱god)，能高度專一性地催化β-d-葡萄糖與空氣中的氧反應(yīng)，使葡萄糖氧化成為1,5-葡萄糖酸內(nèi)酯和過(guò)氧化氫，而后葡萄糖酸內(nèi)酯又自發(fā)和水結(jié)合產(chǎn)生葡萄糖酸。由于該酶具有的獨(dú)特性質(zhì)和安全性，使其在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)展示了較高的應(yīng)用價(jià)值。在食品方面，葡萄糖氧化酶可以作為面粉改良劑，改善面筋的組織結(jié)構(gòu)，提高面團(tuán)的持氣性、彈性、持水性；由于葡萄糖氧化酶有氧情況下可以從系統(tǒng)中除去葡萄糖，在葡萄糖的存在下可除去氧氣，因此廣泛應(yīng)用于各類(lèi)食品制造、器械除氧防銹等方面，如可用于蛋粉加工中脫糖、護(hù)色，同時(shí)還可用于葡萄酒、啤酒、果汁等的除氧保鮮；用于防止蝦肉、干鮮食品的氧化。另外葡萄糖氧化酶還可以用于葡萄糖酸和葡萄糖酸鹽的工業(yè)化生產(chǎn)。由于god作用的高度專一性,它還被用于葡萄糖的定量測(cè)定，如用于血糖含量的測(cè)定和口腔疾病的防治。在飼料方面，葡萄糖氧化酶葡可以解除飼料中真菌素的危害，提高動(dòng)物免疫能力，替代藥物促生長(zhǎng)劑使用。

目前，把葡萄糖氧化酶作為面粉及飼料添加劑已應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，但仍然存在阻礙其廣泛應(yīng)用的技術(shù)難題。例如飼料加工中為防止沙門(mén)氏菌的污染，需要采用高溫滅菌；同時(shí)顆粒飼料的制粒工藝也要經(jīng)過(guò)一個(gè)短暫的高溫(73℃-95℃)過(guò)程，一般葡萄糖氧化酶的活性在此溫度下不可避免地失活，因此耐熱是葡萄糖氧化酶作為飼用添加劑應(yīng)用的關(guān)鍵性問(wèn)題。因此耐熱性是葡萄糖氧化酶工業(yè)應(yīng)用中最主要的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種生產(chǎn)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，并且所制備得到的葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性強(qiáng)和活性強(qiáng)的一種嗜熱擬青霉固態(tài)發(fā)酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法。

本發(fā)明提供一種嗜熱擬青霉固態(tài)發(fā)酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步驟：

步驟1，菌種制備：首先，在無(wú)菌條件下挑取兩環(huán)保藏的嗜熱擬青霉菌種試管孢子接種于活化斜面培養(yǎng)基上活化，將活化斜面培養(yǎng)基置于30-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天；然后，向活化好的嗜熱擬青霉斜面培養(yǎng)基中注入1ml無(wú)菌生理鹽水，移液槍反復(fù)吹打斜面培養(yǎng)基上的孢子，進(jìn)一步將孢子濃度稀釋至10⁷個(gè)/ml，再取2ml稀釋后的孢子接種到裝有50g固態(tài)孢子培養(yǎng)基的三角瓶中，充分搖動(dòng)三角瓶使孢子同培養(yǎng)基充分混勻，將三角瓶置于30-40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，每天翻動(dòng)一次固態(tài)孢子培養(yǎng)基；最后，在三角瓶中裝液體種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻，然后再制備成嗜熱擬青霉孢子懸液，再接種2ml的嗜熱擬青霉孢子懸液，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上30-40℃培養(yǎng)1-2天，搖床轉(zhuǎn)速160-250r/min；

步驟2，嗜熱擬青霉三角瓶固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶中加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基100-180g，固體培養(yǎng)基原料初始含水率為50％，拌料水的ph為5；121℃滅菌后接入步驟1制得的嗜熱擬青霉孢子懸液2ml，32-42℃條件下培養(yǎng)48h，晃動(dòng)三角瓶，使三角瓶培養(yǎng)基松散不結(jié)塊。再將溫度降低至28-37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至96h，中間翻料2次，無(wú)菌條件下向三角瓶中添加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液10-20ml，將三角瓶搖晃均勻，繼續(xù)培養(yǎng)至110-120h；

步驟3，嗜熱擬青霉曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行曲盤(pán)放大試驗(yàn)；將步驟2制得的嗜熱擬青霉孢子接種到裝有固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤(pán)中，所述曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵分兩階段進(jìn)行，發(fā)酵第一階段，35-45℃下培養(yǎng)48-72h，期間翻曲1-3次；發(fā)酵第二階段，培養(yǎng)至72h時(shí)，向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料液體營(yíng)養(yǎng)液30-60ml，同時(shí)培養(yǎng)溫度降至32-37℃，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，再次向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液40-80ml，培養(yǎng)溫度不變，培養(yǎng)至120-144h，結(jié)束發(fā)酵，得到粗酶液；

步驟4，葡萄糖氧化酶酶制劑制備：將步驟3所得粗酶液依次經(jīng)過(guò)浸提、超濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得粗酶濃縮液，最后再將制得的粗酶濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到葡萄糖氧化粗酶劑。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟1中，所述活化斜面培養(yǎng)基的配方為：土豆浸出液100ml，麩皮浸出液100ml，無(wú)機(jī)鹽液1ml，蔗糖1g，瓊脂粉3g，ph5.0-6.0；固態(tài)孢子培養(yǎng)基配方為：麩皮5g，玉米粉1g，谷糠1g，豆餅粉2g，無(wú)機(jī)鹽溶液1ml，土豆浸出液8ml。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟1中，所述嗜熱擬青霉孢子懸液的制備步驟如下：在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌生理鹽水倒入成熟的嗜熱擬青霉麩曲中，使生理鹽水完全覆蓋固體培養(yǎng)基，然后將三角瓶置于磁力攪拌機(jī)上中速攪拌30min，使得充分打碎菌絲體，從而釋放孢子，然后將制備好的孢子懸液取樣在雪球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度至1.2-1.6×10⁸cfu/ml。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟3中，所述曲盤(pán)大小為：40cm×25cm×10cm，裝有500-1000克的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，表面用四層無(wú)菌濕紗布覆蓋。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，在步驟2和步驟3中，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方均為：固體基質(zhì)麩皮10-20g，稻殼粉5-10g、花生殼粉5-10g、玉米粉10-20g、豆粕粉5-10g、酵母粉5-8g，食用菌栽培菌渣5-6g，無(wú)機(jī)鹽液10ml，無(wú)機(jī)鹽液的起始ph為5.0，按照固液比1:1.5-1:1.1加入ph為5.5-7.0的去離子水，混合均勻。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，無(wú)機(jī)鹽液的制備方法如下為：取(nh4)2so4：5-10g，kh2po4：5-10g，mgso4·7h20：1-2g，nano3：1-5g，cacl2：1-5g，fecl3：1-2g，吐溫80：5-10ml，加水至1000ml；補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液制備方法如下：取蔗糖10-20g，酵母粉5-8g，玉米漿5-20ml，土豆浸出液200ml，麩皮浸出液200ml，尿素5-10g，硫酸銨5-10g，加去離子水至1000ml；其中土豆浸出液的制備方法為：100g土豆切成1cm³方塊，煮沸30min，4層紗布過(guò)濾后，補(bǔ)充水至100ml；其中麩皮浸出液的制備方法為：麩皮15g，加水100ml，煮沸30min，過(guò)濾得濾液，補(bǔ)充水至100ml。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，浸提脫色的方法為：取出步驟3中發(fā)酵96h的培養(yǎng)基，在盛有培養(yǎng)基的容器中加入4-5倍體積的ph6.0的磷酸緩沖溶液，加有緩沖液后攪拌均勻，10-20℃條件下、浸提4-6h，每1小時(shí)攪拌一次；將浸提后的培養(yǎng)基過(guò)濾，收集濾液8000r/min離心10-20min，取上清液保存?zhèn)溆茫幌蛏锨逡褐邪?0-20g/l的量加入顆粒狀活性炭，35-45℃脫色30-60min，然后用硅藻土作為助濾劑過(guò)濾除去活性炭渣滓；

超濾的方法為：分為兩次超濾，先利用截留分子量為100kda的平板式超濾膜對(duì)脫色后的粗酶液超濾分離，超濾截留液的體積減少至原體積的6～10％時(shí)，添加去離子水至原體積的1/2，繼續(xù)超濾至截留液為原體積的3-5％。收集兩次的濾出液；再利用截留分子量為40kda的平板式超濾膜對(duì)之前獲得的濾出液進(jìn)行超濾濃縮，當(dāng)超濾截留液為原體積的20％時(shí)，停止超濾，收集截留液。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，第一次超濾條件為：進(jìn)口壓力0.3mpa，出口壓力0.2mpa，流速1.4l/h；第二次超濾條件為：進(jìn)口壓力0.4mpa，出口壓力0.5mpa，流速1.1l/h。

對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，將超濾得到的截留液進(jìn)行噴霧干燥，選用麥芽糊精作為噴霧干燥時(shí)葡萄糖氧化酶的保護(hù)劑，噴霧條件為進(jìn)風(fēng)溫度90-110℃、進(jìn)料速度150-175ml/h、固形物含量7-12％，在此條件下，最大葡萄糖氧化酶回收率為79.8％。

上述方案所述的一種嗜熱擬青霉固態(tài)發(fā)酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法所制得的酶制劑添加到肉雞日糧中，提高飼料轉(zhuǎn)化率。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明采用固態(tài)發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶，發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)菌體的生長(zhǎng)特點(diǎn)和產(chǎn)酶特性，進(jìn)行階段性的補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和酶的合成，延長(zhǎng)菌體產(chǎn)酶時(shí)間，有效防止菌體過(guò)早衰老；發(fā)酵過(guò)程采用分階段發(fā)酵參數(shù)控制，這種精細(xì)的控制技術(shù)促進(jìn)了酶的大量產(chǎn)生，因此此方法生產(chǎn)制得的葡萄糖氧化酶活性提高了45％。

(2)發(fā)酵采用的菌株是嗜熱擬青霉，該菌株固態(tài)發(fā)酵得到的葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性增強(qiáng)，半年時(shí)間內(nèi)，4℃下葡萄糖氧化酶酶活性保存率都在90％以上，室溫條件下酶活性也在80％以上。本發(fā)明生產(chǎn)的葡萄糖氧化酶耐熱性好，在75℃下，保溫3小時(shí)，殘余酶活性達(dá)85％；另外，酶的耐酸性強(qiáng)，在ph2.0-8.0范圍內(nèi)24h葡萄糖氧化酶酶活性基本不發(fā)生變化，活性穩(wěn)定，相對(duì)酶活性均在80％以上，另外，本發(fā)明所制備的葡萄糖氧化酶的穩(wěn)定性強(qiáng)，半年時(shí)間內(nèi)，4℃下葡萄糖氧化酶酶活性保存率都在90％以上，室溫條件下酶活性也在80％以上。

(3)本發(fā)明所采用的活化斜面培養(yǎng)基、固體發(fā)酵培養(yǎng)基以及補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)基原料低廉，主要為普通農(nóng)副產(chǎn)物麩皮、玉米秸稈粉、玉米粉、豆粕、蛹蟲(chóng)草栽培后廢棄培養(yǎng)基等，這樣會(huì)使所述嗜熱擬青霉的培養(yǎng)成本降低，同時(shí)所用原料不僅提供基本的碳源氮源，還能提供豐富的生長(zhǎng)因子及酶的促進(jìn)劑。

(4)本發(fā)明較為詳細(xì)的闡述了耐熱性葡萄糖氧化酶制劑生產(chǎn)方法，與采用普通固態(tài)發(fā)酵法相比，本發(fā)明利用三角瓶和圓盤(pán)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，其中，三角瓶固態(tài)發(fā)酵有效防止污染，圓盤(pán)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量大，操作方便；固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備要求簡(jiǎn)單；另外在生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行了浸提脫色和超濾，浸提脫色可去除葡萄糖氧化酶外的多余的色素，顏色更加好看；超濾的作用是去除葡萄糖氧化酶中多余的蛋白質(zhì)，使制得的葡萄糖氧化酶的純度更高。

(5)本發(fā)明將得到葡萄糖氧化酶酶制劑添加到肉雞日糧中可以顯著提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率，明顯提高肉雞的生產(chǎn)性能。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明實(shí)施例1所制備的葡萄糖氧化酶的活性隨溫度變化而變化的示意圖。

圖2本發(fā)明實(shí)施例1所制備的葡萄糖氧化酶的活性隨溫度和保溫時(shí)間變化而變化的示意圖。

圖3本發(fā)明實(shí)施例2所制備的葡萄糖氧化酶的活性隨ph變化而變化的示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1

步驟1，菌種制備：首先，在無(wú)菌條件下挑取兩環(huán)保藏的嗜熱擬青霉菌種試管孢子接種于活化斜面培養(yǎng)基(土豆浸出液(100g土豆切成1cm³方塊，煮沸30min，4層紗布過(guò)濾后，補(bǔ)充水至100ml)100ml，麩皮浸出液(麩皮15g，加水100ml，煮沸30min，過(guò)濾得濾液，補(bǔ)充水至100ml)100ml，無(wú)機(jī)鹽液(取(nh4)2so4：5g，kh2po4：5g，mgso4·7h20：1g，nano3：1g，cacl2：1g，fecl3：1g，吐溫80：5ml)1ml，蔗糖1g，瓊脂粉3g，ph5.0，加水至1000ml)上活化；將活化斜面培養(yǎng)基置于30-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天；然后，向活化好的嗜熱擬青霉斜面培養(yǎng)基中注入1ml無(wú)菌生理鹽水，移液槍反復(fù)吹打斜面培養(yǎng)基上的孢子，進(jìn)一步將孢子濃度稀釋至10⁷個(gè)/ml，再取2ml稀釋后的孢子接種到裝有50g固態(tài)孢子培養(yǎng)基(麩皮5g，玉米粉1g，谷糠1g，豆餅粉2g，無(wú)機(jī)鹽溶液1ml，土豆浸出液8ml)的三角瓶中，充分搖動(dòng)三角瓶使孢子同培養(yǎng)基充分混勻，將三角瓶置于3℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)天，每天翻動(dòng)一次固態(tài)孢子培養(yǎng)基；最后，在三角瓶中裝液體種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻，在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌生理鹽水倒入成熟的嗜熱擬青霉麩曲中，使生理鹽水完全覆蓋固體培養(yǎng)基，然后將三角瓶置于磁力攪拌機(jī)上中速攪拌30min，使得充分打碎菌絲體，從而釋放孢子，然后將制備好的孢子懸液取樣在雪球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度至1.2×10⁸cfu/ml。再接種2ml的嗜熱擬青霉孢子懸液，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上30℃培養(yǎng)1-2天，搖床轉(zhuǎn)速160r/min；

步驟2，嗜熱擬青霉三角瓶固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶中加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(固體基質(zhì)麩皮10g，稻殼粉5g、花生殼粉5g、玉米粉10g、豆粕粉5g、酵母粉5g，食用菌栽培菌渣5g，無(wú)機(jī)鹽液10ml，無(wú)機(jī)鹽液的起始ph為5.0，按照固液比1:1.5加入ph為5.5的去離子水，混合均勻)100g，固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料初始含水率為50％，拌料水的ph為5；121℃滅菌后接入步驟1制得的嗜熱擬青霉孢子懸液2ml，32℃條件下培養(yǎng)48h，晃動(dòng)三角瓶，使三角瓶培養(yǎng)基松散不結(jié)塊。再將溫度降低至28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至96h，中間翻料2次，無(wú)菌條件下向三角瓶中添加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液(取蔗糖10g，酵母粉5g，玉米漿5ml，土豆浸出液200ml，麩皮浸出液200ml，尿素5g，硫酸銨5g，加去離子水至1000ml)10ml，將三角瓶搖晃均勻，繼續(xù)培養(yǎng)至110h；

步驟3，嗜熱擬青霉曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行曲盤(pán)放大試驗(yàn)；所述曲盤(pán)大小為：40cm×25cm×10cm，裝有500克的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，表面用四層無(wú)菌濕紗布覆蓋，將步驟2制得的嗜熱擬青霉孢子接種到裝有固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤(pán)中，所述曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵分兩階段進(jìn)行，發(fā)酵第一階段，35℃下培養(yǎng)48h，期間翻曲1次；發(fā)酵第二階段，培養(yǎng)至72h時(shí)，向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料液體營(yíng)養(yǎng)液30ml，同時(shí)培養(yǎng)溫度降至32℃，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，再次向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液40ml，培養(yǎng)溫度不變，培養(yǎng)至120h，結(jié)束發(fā)酵，得到粗酶液；

步驟4，葡萄糖氧化酶酶制劑制備：將步驟3所得粗酶液依次經(jīng)過(guò)取出步驟3中發(fā)酵的培養(yǎng)基，在盛有培養(yǎng)基的容器中加入4-5倍體積的ph6.0的磷酸緩沖溶液，加有緩沖液后攪拌均勻，10℃條件下、浸提4h，每1小時(shí)攪拌一次；將浸提后的培養(yǎng)基過(guò)濾，收集濾液8000r/min離心10min，取上清液保存?zhèn)溆?；向上清液中?0g/l的量加入顆粒狀活性炭，35℃脫色30min，然后用硅藻土作為助濾劑過(guò)濾除去活性炭渣滓；然后在進(jìn)口壓力0.3mpa，出口壓力0.2mpa，流速1.4l/h的條件下，先利用截留分子量為100kda的平板式超濾膜對(duì)脫色后的粗酶液超濾分離，超濾截留液的體積減少至原體積的6～10％時(shí)，添加去離子水至原體積的1/2，繼續(xù)超濾至截留液為原體積的3-5％。收集兩次的濾出液；然后在進(jìn)口壓力0.4mpa，出口壓力0.5mpa，流速1.1l/h的條件下，利用截留分子量為40kda的平板式超濾膜對(duì)之前獲得的濾出液進(jìn)行超濾濃縮，當(dāng)超濾截留液為原體積的20％時(shí)，停止超濾，收集截留液；最后選用麥芽糊精作為噴霧干燥時(shí)葡萄糖氧化酶的保護(hù)劑，噴霧條件為進(jìn)風(fēng)溫度90℃、進(jìn)料速度150ml/h、固形物含量7-12％，制得葡萄糖氧化酶劑。

將上述方法制得的葡萄糖氧化酶制劑制成葡萄糖氧化酶液，分別在不同的溫度下，35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，測(cè)定其葡萄糖氧化酶酶的活力(ph5.0)，并將最高的酶活力定義為100％，計(jì)算不同溫度條件下葡萄糖氧化酶的活力。結(jié)果如圖1所示，葡萄糖氧化酶從35℃到65℃，隨著溫度升高酶活性逐漸增加，溫度達(dá)到65℃時(shí)，酶活達(dá)到最大值。以后隨著溫度升高，酶活逐漸降低，故酶的葡萄糖氧化酶最適作用溫度為65℃。整體看葡萄糖氧化酶是高溫酶，在50℃-70℃之間酶的酶活都在80％以上，故在這個(gè)溫度范圍內(nèi)酶制劑都會(huì)發(fā)揮高效的酶解作用，本發(fā)明所制備的葡萄糖氧化酶的耐熱性比較好。

然后再將葡萄糖氧化酶酶制劑制成將葡萄糖氧化酶酶液，分別置于不同的溫度條件下(60℃、65℃、67℃、70℃)保溫不同的時(shí)間(ph＝4.5)，然后立即放置于4℃的環(huán)境中復(fù)性2h以上，再按標(biāo)準(zhǔn)的酶活測(cè)定方法測(cè)定其剩余酶活力。以未經(jīng)保溫失活處理的酶活力為100％，分別計(jì)算不同溫度條件下葡萄糖氧化酶的相對(duì)剩余酶活。結(jié)果見(jiàn)圖2所示，酶基本隨溫度的上升以及熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力逐漸降低，在溫度高于75℃時(shí)，葡萄糖氧化酶酶活性下降顯著。酶在75℃以下，保溫時(shí)間3小時(shí)以內(nèi)酶活保存率都在80％以上；65℃以下，熱處理3小時(shí)剩余酶活都在90％以上。因此酶制劑的耐熱性非常好，進(jìn)一步說(shuō)明了本方法制得的葡萄糖氧化酶劑屬于是耐高溫型。

實(shí)施例2

步驟1，菌種制備：首先，在無(wú)菌條件下挑取兩環(huán)保藏的嗜熱擬青霉菌種試管孢子接種于活化斜面培養(yǎng)基(土豆浸出液(100g土豆切成1cm³方塊，煮沸30min，4層紗布過(guò)濾后，補(bǔ)充水至100ml)100ml，麩皮浸出液(麩皮15g，加水100ml，煮沸30min，過(guò)濾得濾液，補(bǔ)充水至100ml)100ml，無(wú)機(jī)鹽液(取(nh4)2so4：8g，kh2po4：8g，mgso4·7h20：1.5g，nano3：3g，cacl2：3g，fecl3：1.5g，吐溫80：8ml)1ml，蔗糖1g，瓊脂粉3g，ph5.5，加水至1000ml)上活化；將活化斜面培養(yǎng)基置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天；然后，向活化好的嗜熱擬青霉斜面培養(yǎng)基中注入1ml無(wú)菌生理鹽水，移液槍反復(fù)吹打斜面培養(yǎng)基上的孢子，進(jìn)一步將孢子濃度稀釋至10⁷個(gè)/ml，再取2ml稀釋后的孢子接種到裝有50g固態(tài)孢子培養(yǎng)基(麩皮5g，玉米粉1g，谷糠1g，豆餅粉2g，無(wú)機(jī)鹽溶液1ml，土豆浸出液8ml)的三角瓶中，充分搖動(dòng)三角瓶使孢子同培養(yǎng)基充分混勻，將三角瓶置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，每天翻動(dòng)一次固態(tài)孢子培養(yǎng)基；最后，在三角瓶中裝液體種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻，在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌生理鹽水倒入成熟的嗜熱擬青霉麩曲中，使生理鹽水完全覆蓋固體培養(yǎng)基，然后將三角瓶置于磁力攪拌機(jī)上中速攪拌30min，使得充分打碎菌絲體，從而釋放孢子，然后將制備好的孢子懸液取樣在雪球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度至1.4×10⁸cfu/ml。再接種2ml的嗜熱擬青霉孢子懸液，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上35℃培養(yǎng)1-2天，搖床轉(zhuǎn)速200r/min；

步驟2，嗜熱擬青霉三角瓶固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶中加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(固體基質(zhì)麩皮15g，稻殼粉8g、花生殼粉8g、玉米粉15g、豆粕粉8g、酵母粉6g，食用菌栽培菌渣5g，無(wú)機(jī)鹽液10ml，無(wú)機(jī)鹽液的起始ph為5.0，按照固液比1:1.3加入ph為6的去離子水，混合均勻)100-180g，固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料初始含水率為50％，拌料水的ph為5；121℃滅菌后接入步驟1制得的嗜熱擬青霉孢子懸液2ml，38℃條件下培養(yǎng)48h，晃動(dòng)三角瓶，使三角瓶培養(yǎng)基松散不結(jié)塊。再將溫度降低至33℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至96h，中間翻料2次，無(wú)菌條件下向三角瓶中添加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液(取蔗糖15g，酵母粉6g，玉米漿16ml，土豆浸出液200ml，麩皮浸出液200ml，尿素8g，硫酸銨8g，加去離子水至1000ml)15ml，將三角瓶搖晃均勻，繼續(xù)培養(yǎng)至115h；

步驟3，嗜熱擬青霉曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行曲盤(pán)放大試驗(yàn)；所述曲盤(pán)大小為：40cm×25cm×10cm，裝有800克的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，表面用四層無(wú)菌濕紗布覆蓋，將步驟2制得的嗜熱擬青霉孢子接種到裝有固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤(pán)中，所述曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵分兩階段進(jìn)行，發(fā)酵第一階段，40℃下培養(yǎng)64h，期間翻曲2次；發(fā)酵第二階段，培養(yǎng)至72h時(shí)，向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料液體營(yíng)養(yǎng)液45ml，同時(shí)培養(yǎng)溫度降至35℃，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，再次向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液60ml，培養(yǎng)溫度不變，培養(yǎng)至130h，結(jié)束發(fā)酵，得到粗酶液；

步驟4，葡萄糖氧化酶酶制劑制備：將步驟3所得粗酶液依次經(jīng)過(guò)取出步驟3中發(fā)酵的培養(yǎng)基，在盛有培養(yǎng)基的容器中加入4-5倍體積的ph6.0的磷酸緩沖溶液，加有緩沖液后攪拌均勻，10-20℃條件下、浸提5h，每1小時(shí)攪拌一次；將浸提后的培養(yǎng)基過(guò)濾，收集濾液8000r/min離心15min，取上清液保存?zhèn)溆茫幌蛏锨逡褐邪?5g/l的量加入顆粒狀活性炭，40℃脫色45min，然后用硅藻土作為助濾劑過(guò)濾除去活性炭渣滓；然后在進(jìn)口壓力0.3mpa，出口壓力0.2mpa，流速1.4l/h的條件下，先利用截留分子量為100kda的平板式超濾膜對(duì)脫色后的粗酶液超濾分離，超濾截留液的體積減少至原體積的6～10％時(shí)，添加去離子水至原體積的1/2，繼續(xù)超濾至截留液為原體積的3-5％。收集兩次的濾出液；然后在進(jìn)口壓力0.4mpa，出口壓力0.5mpa，流速1.1l/h的條件下，利用截留分子量為40kda的平板式超濾膜對(duì)之前獲得的濾出液進(jìn)行超濾濃縮，當(dāng)超濾截留液為原體積的20％時(shí)，停止超濾，收集截留液；最后選用麥芽糊精作為噴霧干燥時(shí)葡萄糖氧化酶的保護(hù)劑，噴霧條件為進(jìn)風(fēng)溫度100℃、進(jìn)料速度160ml/h、固形物含量7-12％，制得葡萄糖氧化酶劑。

將上述方法制備的葡萄糖氧化酶酶劑制備成葡萄糖氧化酶液，分別在不同的ph下，ph2.0、ph3.0、ph4.0、ph5.0、ph6.0、ph7.0、ph8.0、ph9.0，下測(cè)定其葡萄糖氧化酶酶活力。將最高的酶活力定義為100％，分別計(jì)算不同ph值條件下葡萄糖氧化酶的相對(duì)酶活性。所用緩沖液為：ph2.0～3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，ph3.0～4.0檸檬酸磷酸緩沖液，ph4.0～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph5.0～7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，ph7.0～9.0tris-hcl緩沖溶液。以酶在最適ph值下所測(cè)酶活為100％，其它ph值下所測(cè)為對(duì)其相對(duì)酶活。酶制劑在以上不同ph緩沖體系中，在65℃下測(cè)定葡萄糖氧化酶酶活性，結(jié)果如圖3所示，葡萄糖氧化酶在ph3.0～7.0之間酶活性在80％以上，最適作用ph為5.0。整體看酶制劑適合在酸性條件下酶解反應(yīng)。所述本發(fā)明制備的葡萄糖氧化酶的耐酸性好。

實(shí)施例3

步驟1，菌種制備：首先，在無(wú)菌條件下挑取兩環(huán)保藏的嗜熱擬青霉菌種試管孢子接種于活化斜面培養(yǎng)基(土豆浸出液(100g土豆切成1cm³方塊，煮沸30min，4層紗布過(guò)濾后，補(bǔ)充水至100ml)100ml，麩皮浸出液(麩皮15g，加水100ml，煮沸30min，過(guò)濾得濾液，補(bǔ)充水至100ml)100ml，無(wú)機(jī)鹽液(取(nh4)2so4：10g，kh2po4：10g，mgso4·7h20：2g，nano3：5g，cacl2：5g，fecl3：2g，吐溫80：10ml)1ml，蔗糖1g，瓊脂粉3g，ph6.0，加水至1000ml)上活化；將活化斜面培養(yǎng)基置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天；然后，向活化好的嗜熱擬青霉斜面培養(yǎng)基中注入1ml無(wú)菌生理鹽水，移液槍反復(fù)吹打斜面培養(yǎng)基上的孢子，進(jìn)一步將孢子濃度稀釋至10⁷個(gè)/ml，再取2ml稀釋后的孢子接種到裝有50g固態(tài)孢子培養(yǎng)基(麩皮5g，玉米粉1g，谷糠1g，豆餅粉2g，無(wú)機(jī)鹽溶液1ml，土豆浸出液8ml)的三角瓶中，充分搖動(dòng)三角瓶使孢子同培養(yǎng)基充分混勻，將三角瓶置于40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，每天翻動(dòng)一次固態(tài)孢子培養(yǎng)基；最后，在三角瓶中裝液體種子培養(yǎng)基，滅菌冷卻，在無(wú)菌條件下，將無(wú)菌生理鹽水倒入成熟的嗜熱擬青霉麩曲中，使生理鹽水完全覆蓋固體培養(yǎng)基，然后將三角瓶置于磁力攪拌機(jī)上中速攪拌30min，使得充分打碎菌絲體，從而釋放孢子，然后將制備好的孢子懸液取樣在雪球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)孢子濃度至1.6×10⁸cfu/ml。再接種2ml的嗜熱擬青霉孢子懸液，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上40℃培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速250r/min；

步驟2，嗜熱擬青霉三角瓶固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶中加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(固體基質(zhì)麩皮20g，稻殼粉10g、花生殼粉10g、玉米粉20g、豆粕粉10g、酵母粉8g，食用菌栽培菌渣6g，無(wú)機(jī)鹽液10ml，無(wú)機(jī)鹽液的起始ph為5.0，按照固液比1:1.1加入ph為7.0的去離子水，混合均勻)180g，固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料初始含水率為50％，拌料水的ph為5；121℃滅菌后接入步驟1制得的嗜熱擬青霉孢子懸液2ml，42℃條件下培養(yǎng)48h，晃動(dòng)三角瓶，使三角瓶培養(yǎng)基松散不結(jié)塊。再將溫度降低至37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至96h，中間翻料2次，無(wú)菌條件下向三角瓶中添加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液(取蔗糖20g，酵母粉8g，玉米漿20ml，土豆浸出液200ml，麩皮浸出液200ml，尿素10g，硫酸銨10g，加去離子水至1000ml)20ml，將三角瓶搖晃均勻，繼續(xù)培養(yǎng)至120h；

步驟3，嗜熱擬青霉曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵：在三角瓶固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行曲盤(pán)放大試驗(yàn)；所述曲盤(pán)大小為：40cm×25cm×10cm，裝有1000克的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，表面用四層無(wú)菌濕紗布覆蓋，將步驟2制得的嗜熱擬青霉孢子接種到裝有固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的曲盤(pán)中，所述曲盤(pán)固態(tài)發(fā)酵分兩階段進(jìn)行，發(fā)酵第一階段，45℃下培養(yǎng)72h，期間翻曲3次；發(fā)酵第二階段，培養(yǎng)至72h時(shí)，向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料液體營(yíng)養(yǎng)液60ml，同時(shí)培養(yǎng)溫度降至37℃，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，再次向曲盤(pán)中淋加補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)液80ml，培養(yǎng)溫度不變，培養(yǎng)至144h，結(jié)束發(fā)酵，得到粗酶液；

步驟4，葡萄糖氧化酶酶制劑制備：將步驟3所得粗酶液依次經(jīng)過(guò)取出步驟3中發(fā)酵的培養(yǎng)基，在盛有培養(yǎng)基的容器中加入5倍體積的ph6.0的磷酸緩沖溶液，加有緩沖液后攪拌均勻，20℃條件下、浸提6h，每1小時(shí)攪拌一次；將浸提后的培養(yǎng)基過(guò)濾，收集濾液8000r/min離心20min，取上清液保存?zhèn)溆?；向上清液中?0g/l的量加入顆粒狀活性炭，45℃脫色60min，然后用硅藻土作為助濾劑過(guò)濾除去活性炭渣滓；然后在進(jìn)口壓力0.3mpa，出口壓力0.2mpa，流速1.4l/h的條件下，先利用截留分子量為100kda的平板式超濾膜對(duì)脫色后的粗酶液超濾分離，超濾截留液的體積減少至原體積的6～10％時(shí)，添加去離子水至原體積的1/2，繼續(xù)超濾至截留液為原體積的3-5％。收集兩次的濾出液；然后在進(jìn)口壓力0.4mpa，出口壓力0.5mpa，流速1.1l/h的條件下，利用截留分子量為40kda的平板式超濾膜對(duì)之前獲得的濾出液進(jìn)行超濾濃縮，當(dāng)超濾截留液為原體積的20％時(shí)，停止超濾，收集截留液；最后選用麥芽糊精作為噴霧干燥時(shí)葡萄糖氧化酶的保護(hù)劑，噴霧條件為進(jìn)風(fēng)溫度90-110℃、進(jìn)料速度150-175ml/h、固形物含量7-12％，制得葡萄糖氧化酶劑。

將制備好的葡萄糖氧化酶固態(tài)劑分別在4℃和室溫下保存，每一個(gè)月檢測(cè)一次酶活力，共檢測(cè)6個(gè)月，查看酶活保留情況。結(jié)果如表1所示：

表1

從上表可以看出，在半年時(shí)間內(nèi)，4℃下葡萄糖氧化酶酶活性保存率都在90％以上，室溫條件下酶活也在80％以上，可以看出酶的穩(wěn)定性好。

應(yīng)用例1

實(shí)施例1制得的葡萄糖氧化酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

選取1日齡的商品羅斯308肉雞為試驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分2個(gè)處理組，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)，各有雛雞20只。在肉雞飼料中添加實(shí)施例1制得的葡萄糖氧化酶制成葡萄糖氧化酶制劑。然后將制備的葡萄糖氧化酶制劑以基礎(chǔ)日糧為載體做成1％葡萄糖氧化酶預(yù)混劑，試驗(yàn)組是將基礎(chǔ)日糧同葡萄糖氧化酶預(yù)混劑混勻，使葡萄糖氧還酶酶制劑的含量達(dá)到0.5％。所有雞籠養(yǎng)群飼，粉料，自由采食，乳頭式自動(dòng)飲水器飲水，按常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)管理。按飼養(yǎng)程序進(jìn)行免疫，消毒。在42日齡分別單個(gè)稱重。每天記錄各組各重復(fù)的耗料量和剩料量，計(jì)算每周飼料增重比。每天記錄死亡雞的數(shù)目，計(jì)算死亡率。始重、末重、平均日增重、平均日采食量、飼料增重比。平均日增重＝(末重-初重)/天數(shù)，平均日采食量＝耗料量/天數(shù)，飼料增重比＝耗料量/增重。其中葡萄糖氧化酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響如表2；

表2

由表2可以看出，試驗(yàn)組日糧中添加葡萄糖氧化酶比對(duì)照組日增重增加17.52％，耗料增重比，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組降低20％，從而提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率。由此表明，葡萄糖氧化酶能夠顯著提高肉雞的生產(chǎn)性能。

本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而并非用作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神范圍內(nèi)，對(duì)以上所述實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。