本發(fā)明是關(guān)于一種從動物肺組織中分離純化II型固有淋巴細胞的方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著人們對固有免疫細胞的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一群新的細胞亞群。這類亞群不表達抗原特異性識別受體(TCR或BCR)，在發(fā)育和形態(tài)上屬于淋巴細胞譜系，與過去人們發(fā)現(xiàn)的自然殺傷(NK)細胞和淋巴組織誘導(dǎo)(LTi)細胞一起被稱為固有淋巴細胞(ILC)。按照輔助性T(Th)細胞的分類方法，根據(jù)細胞因子分泌和轉(zhuǎn)錄因子表達的不同，ILC家族又可被分成三大類：ILC1、ILC2和ILC3。

Ⅱ型固有淋巴細胞(Type II innate lymphoid cells,ILC2)是上述的其中一種新近發(fā)現(xiàn)的固有淋巴細胞群體，主要分布于肺臟、腸道、皮膚等黏膜組織，在IL-25和IL-33的刺激下能夠產(chǎn)生IL-5和IL-13等Th2型細胞因子。ILC2在呼吸道抗感染免疫以及過敏性疾病中發(fā)揮重要作用，因而備受關(guān)注。已有研究表明，在呼吸道過敏性疾病發(fā)病早期，ILC2是Th2型細胞因子的重要來源，可以調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答；同時在抗寄生蟲、病毒感染以及組織修復(fù)過程中，ILC2也發(fā)揮重要功能。因此，ILC2的生物學(xué)研究具有重大的現(xiàn)實意義。盡管目前在ILC2相關(guān)領(lǐng)域的研究取得了重大的突破，但是由于ILC2細胞數(shù)量少、細胞表面缺少高度特異的標志分子，因而在獲取該細胞用于研究方面仍然面臨重大的技術(shù)挑戰(zhàn)。其中，肺臟是ILC2細胞最早被發(fā)現(xiàn)的器官之一，肺臟ILC2介導(dǎo)呼吸道過敏反應(yīng)等疾病早期的II型免疫應(yīng)答，從小鼠肺臟中準確分離ILC2細胞是通過小鼠模型研究ILC2生物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)，然而，目前尚無對小鼠肺臟ILC2細胞分離方法的詳盡描述。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一種從動物肺臟中準確分離ILC2細胞的方法。

本發(fā)明提供了一種從動物肺組織中分離純化II型固有淋巴細胞的方法，該方法包括：

取動物肺臟組織，破碎，加入I型膠原酶消化，得到肺組織消化溶液；

將肺組織消化溶液過濾；

通過Percoll法分離得到肺組織淋巴細胞；

用Ⅱ型固有淋巴細胞特異性抗體標記所得到的肺組織淋巴細胞，經(jīng)細胞流式技術(shù)分選得到Ⅱ型固有淋巴細胞。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，所述動物為小鼠。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，是將動物肺臟組織剪成1～2mm³大小再加入I型膠原酶消化。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，對應(yīng)每只小鼠的肺臟，加入3～20ml濃度為0.03～0.5％(m/v)的I型膠原酶消化。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，加入I型膠原酶后在30～42℃的環(huán)境中消化10～90分鐘。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，肺組織消化溶液是200目的篩網(wǎng)過濾。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，Percoll法分離得到肺組織淋巴細胞的具體操作為：

用42％Percoll 3ml重懸沉淀，然后將該細胞懸液緩慢加到3ml 70％Percoll表面，離心1260g 30分鐘。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，通過四種抗體從肝臟單個核細胞中進行流式細胞術(shù)分選純化Ⅱ型固有淋巴細胞。優(yōu)選地，所述抗體為FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R。這些抗體可商購獲得，例如可購自Biolegend公司。

在本發(fā)明的一具體實施方案中，本發(fā)明的從動物肺組織中分離純化II型固有淋巴細胞的方法包括：

將動物肺組織剪成1～2mm³左右小塊將組織塊放入離心管中加5ml不含血清的具有生理滲透壓的溶液(如不完全DMEM或生理鹽水等)配制的0.1％膠原酶I溶液，置于37℃震蕩箱中220rpm消化30分鐘；置于冰上終止消化，用200目篩網(wǎng)過濾，將停留在網(wǎng)上的肺組織輕輕研磨后再過濾；

4℃1060g離心10分鐘，棄上清；

密度梯度離心：用42％Percoll 3ml重懸沉淀，然后將該細胞懸液緩慢加到3ml70％Percoll(GE Healthcare)表面，離心1260g 30分鐘；

取中間層細胞到新的15毫升離心管，PBS加滿，1060g離心10分鐘后棄去上清液；

細胞懸液加入大鼠血清封閉Fc受體并標記熒光抗體：FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R，4℃避光孵育15min；

加滿PBS，4℃1060g×10min，洗兩遍；

用流式細胞儀分選Lineage-IL33R+CD90.2+KLRG1+細胞，即為ILC2細胞。

本發(fā)明的方法，運用膠原酶I從組織中釋放淋巴細胞而最大限度維持淋巴細胞活性；通過密度梯度離心，將淋巴細胞與肝臟組織細胞分離開，從而富集肺臟II型固有淋巴細胞。該方法經(jīng)過大量實踐證明能從正?；蚓哂蟹闻K炎癥的C57BL/6小鼠中分離并純化出高純度、高活性的II型固有淋巴細胞。

附圖說明

圖1表示Ⅱ型固有淋巴細胞在分選過程中的Gate步驟。

圖2顯示ILC2細胞的流式細胞術(shù)分選實驗結(jié)果。

圖3顯示分選所得的ILC2細胞的功能/活性鑒定結(jié)果。

圖4A與圖4B顯示不同條件下經(jīng)本方法所能獲取的ILC2細胞數(shù)量。

具體實施方式

為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實施例及附圖進一步描述本發(fā)明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中未注明具體條件的實驗方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。

實施例1

以下實驗均需無菌操作。

(1)正?；蚓哂蟹闻K炎癥的小鼠肺組織，放入無菌PBS中置于冰上。

(2)將組織剪成1～2mm3左右小塊將組織塊放入離心管中加5ml不完全DM EM配制的膠原酶I溶液(0.1％，即1mg/ml，sigma)，旋緊蓋子置于37℃震蕩箱中220rpm消化30分鐘(可見組織塊已分散而失去塊的形狀，即消化成功)。

(3)第3步完成后，置于冰上終止消化，用200目篩網(wǎng)過濾，將停留在網(wǎng)上的肺組織輕輕研磨后再過濾。

(4)4℃1060g離心10分鐘，棄上清。(以下離心除了密度梯度離心的步驟是常溫外均是4℃)。

(5)密度梯度離心：用42％Percoll 3ml重懸沉淀，緩慢加到3ml 70％Percoll(GE Healthcare)表面，離心1260g 30分鐘。

20ml 70％Percoll配方：12.6ml Percoll原液(GE Healthcare)+

1.4ml 10×PBS+6ml 1×PBS

20ml 42％Percoll配方：7.56ml Percoll原液(GE Healthcare)+

840ul 10×PBS+11.6ml 1×PBS

(6)取中間層細胞到新的15毫升離心管，PBS加滿，1060g離心10分鐘后棄去上清液，然后用1毫升PBS重懸細胞。

(7)取出少量細胞用臺盼藍染色后進行計數(shù)。

(8)根據(jù)計數(shù)結(jié)果，取包含有100萬個細胞的細胞懸液加入10％懸液體積的大鼠血清封閉Fc受體并標記熒光抗體：FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R(抗體均來自Biolegend)，4℃避光孵育15min。

(9)加滿PBS，4℃1060g×10min，洗兩遍。

(10)用流式細胞儀分選Lineage^-IL33R⁺CD90.2⁺KLRG1⁺細胞，即為ILC2細胞。

圖1表示Ⅱ型固有淋巴細胞在分選過程中的Gate步驟：

肺單個核細胞→CD45⁺→KLRG1⁺CD90⁺→Lineage^-IL-33R⁺

圖2顯示實驗結(jié)果，依據(jù)本方法分離肺臟淋巴細胞后能清晰檢測到ILC2細胞的存在，其在流式細胞儀上所展示的位置如圖2所示。經(jīng)該檢測策略進行流式分選，每只成年的正常小鼠能獲得4000-10000個II型固有淋巴細胞，小鼠處于肺臟炎癥狀態(tài)下，能獲得更大數(shù)量的細胞，具體數(shù)量依炎癥嚴重程度而定。分選所得的該細胞，在體外以50000/mL密度培養(yǎng)時，以mIL-33(比如50ng/mL mIL-33)刺激2天后能產(chǎn)生大量的Th2型細胞因子如IL-5和IL-13，但不能產(chǎn)生Th1型細胞因子如IFN-γ(圖3)，表示該細胞具有較好的活性。

實施例2

正常小鼠的肺臟經(jīng)本發(fā)明的方法，用生理鹽水配制的幾種不同濃度的膠原酶I溶液消化，其他操作同實施例1，結(jié)果表明能分離并純化出高活性的II型固有淋巴細胞，所能獲得的II型固有淋巴細胞數(shù)量參見圖4A。

正常小鼠經(jīng)過80微克博萊美素滴鼻誘導(dǎo)肺臟炎癥一周后，參照實施例1的方法分離II型固有淋巴細胞，結(jié)果表明能分離并純化出高活性的II型固有淋巴細胞，所得的II型固有淋巴細胞數(shù)量參見圖4B。