本發(fā)明涉及一種多肽制備方法，具體涉及一種蚯蚓多肽提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
活性肽廣泛存在于自然界中，生物體很多活性物質(zhì)都以肽的形式存在，沒有肽，就沒有活性，沒有生命?？茖W(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)了具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)、抗病毒、降血壓和降血脂等功能性肽。由于功能性肽的特殊功能，使得人們對它需求增加，現(xiàn)在已提取出多種功能性肽多用于醫(yī)用和保健，如功能性大豆蛋白肽已經(jīng)用于降血脂。
蚯蚓為環(huán)節(jié)動物門寡毛綱動物，可改量土壤，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)，在物質(zhì)循環(huán)、生物多樣性、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著特殊作用。此外，蚯蚓還是我國常用中藥，名為地龍。研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓具有治療心血管疾病、癌癥、哮喘等多種藥理作用，同時還具有增強免疫力，促進(jìn)傷口愈合等作用。蚯蚓中含有豐富的人體所需營養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸、微量元素、維生素等。其中蛋白質(zhì)總量約占干質(zhì)量的45.9％～68.11％。蚯蚓經(jīng)酶水解可獲得小分子多肽和氨基酸，不僅可以提供均衡的、易于吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，而且蚯蚓肽還具有抗氧化、增強免疫、抗菌等生理活性，在保健食品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。
目前，蚯蚓活性多肽的制備主要由以下幾種方法：(1)通過蚯蚓自身含有的自溶酶進(jìn)行酶解來制備蚯蚓活性小分子多肽；(2)通過加入外源酶，然后再結(jié)合內(nèi)源酶進(jìn)行水解，得到蚯蚓多肽提取物；但是采用上述制備方法對pH值、溫度要求嚴(yán)格，并且所得到的多肽提取率低、顏色差、有腥味和苦味。因此，針對上述問題，有必要建立一種蚯蚓活性多肽制備的新方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種蚯蚓多肽提取物的制備方法，該方法能提高多肽的提取率、而且顏色好、無腥味和苦味。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種蚯蚓多肽提取物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：
(1)預(yù)處理：取新鮮蚯蚓清洗干凈，然后在0.5～1mg/L的蔗糖溶液中浸泡,撈出后再將蚯蚓置于生理鹽水中浸泡15～30min，待生理鹽水中無泥沙污物時將蚯蚓撈出瀝干，然后按照料液比1:10～20的比例加入0.15～0.3mol/L的氯化鉀溶液，勻漿，超聲浸提，得到固液混合體；
(2)發(fā)酵處理：取步驟(1)中的固液混合體，加入固液混合體重量0.05～0.15倍的混合菌種，調(diào)pH3～6,溫度控制在30～37℃發(fā)酵12～24h，得到發(fā)酵混合物；
(3)一次酶解：取步驟(2)中的發(fā)酵混合物，加入發(fā)酵混合物重量0.02～0.1倍的菠蘿蛋白酶，調(diào)pH5～7.5，溫度控制在50～60℃進(jìn)行酶解15～30min，滅酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步驟(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.02～0.05倍的胃蛋白酶，在維持胃蛋白酶活性條件下進(jìn)行酶解處理，將所得酶解物離心去渣，收集的上清液為多肽粗提液；
(5)超濾處理：取步驟(4)中的多肽粗提液經(jīng)過超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)過納濾膜截留，將所得截留液冷凍干燥得到蚯蚓多肽提取物。
作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(1)中超聲浸提條件：超聲功率80～200w，超聲時間10～25min，超聲溫度30～45℃。
作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(2)中混合菌種為乳酸菌、酵母菌和曲霉菌，且所述乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的質(zhì)量比為0.1～0.5:0.15～0.35:0.12～0.3。
作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的質(zhì)量比為0.43:0.3:0.25。
作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(4)中的酶解溫度為30～37℃，酶解時間為10～25min。
作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟(1)中超聲浸提條件為：超聲功率160w，超聲時間15min，超聲溫度40℃。
采用了上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是：
(1)本發(fā)明采用蔗糖溶液和鹽溶液依次對蚯蚓浸泡，可快速清除蚯蚓體內(nèi)的沙土和污物，縮短清洗和浸泡時間；然后加入氯化鉀溶液對蚯蚓進(jìn)行勻漿處理，超聲浸提促進(jìn)了蛋白組分的溶出；
(2)本發(fā)明通過大量實驗，篩選出由乳酸菌、酵母菌和曲霉菌組成的混合菌種，利用混合菌種的協(xié)同作用對蚯蚓勻漿組織液進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶可將蚯蚓組織中蛋白充分發(fā)酵，而且在發(fā)酵過程中，由于微生物的代謝作用會對一些多肽分子進(jìn)行修飾，使小肽之間，小肽與氨基酸之間發(fā)生移接與重排，制得的活性肽無苦味和異味，進(jìn)而改善多肽的質(zhì)量；然后再經(jīng)過菠蘿蛋白酶及胃蛋白酶的酶解，更進(jìn)一步起到對蛋白質(zhì)的降解作用，提高了小分子多肽的提取率；
(3)本發(fā)明采用分子截留技術(shù)對多肽粗提掖進(jìn)行超濾和納濾，得到分子量小于300的小分子多肽提取物，具有較好的抗氧化活性，對DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有較好的清除作用。
綜上所述，本發(fā)明采用發(fā)酵與酶解相互結(jié)合的方法來制備的蚯蚓多肽提取物，顏色好，無異味和苦味，具有較好的抗氧化活性，而且采用此種方法還大大提高了多肽提取物的提取率。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1
一種蚯蚓多肽提取物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：
(1)預(yù)處理：取新鮮蚯蚓1000g清洗干凈，然后在0.5mg/L的蔗糖溶液中浸泡20min后撈出，再將蚯蚓置于生理鹽水中浸泡15min，待生理鹽水中無泥沙污物時將蚯蚓撈出瀝干，然后按照料液比1:10的比例加入0.15mol/L的氯化鉀溶液，勻漿，超聲浸提(超聲功率80w，超聲時間10min，超聲溫度30℃)，得到固液混合體；
(2)發(fā)酵處理：取步驟(1)中的固液混合體，加入固液混合體重量0.05倍的混合菌種(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的質(zhì)量比為0.1:0.15:0.12)，調(diào)pH3.5,溫度控制在30℃發(fā)酵12h，得到發(fā)酵混合物；
(3)一次酶解：取步驟(2)中的發(fā)酵混合物，加入發(fā)酵混合物重量0.03倍的菠蘿蛋白酶，調(diào)pH5，溫度控制在53℃進(jìn)行酶解15min，90℃滅酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步驟(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.02倍的胃蛋白酶，在維持胃蛋白酶活性條件下進(jìn)行酶解處理(酶解溫度為30℃，酶解時間為10min)，將所得酶解產(chǎn)物離心去渣，收集的上清液為蚯蚓多肽粗提液；
(5)超濾處理：取步驟(4)中的多肽粗提液經(jīng)過截留分子量為5000的超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)過截留分子量為300的納濾膜截留，將所得截留液冷凍干燥得到蚯蚓多肽。
此條件下蚯蚓多肽提取物的提取率為9.56％，多肽提取物呈微黃色、帶有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
實施例2
一種蚯蚓多肽提取物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：
(1)預(yù)處理：取新鮮蚯蚓1000g清洗干凈，然后在0.8/L的蔗糖溶液中浸泡25min后撈出，再將蚯蚓置于生理鹽水中浸泡20min，待生理鹽水中無泥沙污物時將蚯蚓撈出瀝干，然后按照料液比1:15的比例加入0.2mol/L的氯化鉀溶液，勻漿，超聲浸提(超聲功率120w，超聲時間15min，超聲溫度35℃)，得到固液混合體；
(2)發(fā)酵處理：取步驟(1)中的固液混合體，加入固液混合體重量0.1倍的混合菌種(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的質(zhì)量比為0.2:0.27:0.2)，調(diào)pH4.5,溫度控制在32℃發(fā)酵18h，得到發(fā)酵混合物；
(3)一次酶解：取步驟(2)中的發(fā)酵混合物，加入發(fā)酵混合物重量0.05倍的菠蘿蛋白酶，調(diào)pH5.3，溫度控制在57℃進(jìn)行酶解20min，90℃滅酶，得到的酶解物；
(4)二次酶解：取步驟(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.04倍的胃蛋白酶，在維持胃蛋白酶活性條件下進(jìn)行酶解處理(酶解溫度為32℃，酶解時間為15min)，將所得酶解產(chǎn)物離心去渣，收集的上清液為蚯蚓多肽粗提液；
(5)超濾處理：取步驟(4)中的蚯蚓多肽粗提液經(jīng)過截留分子量為4000的超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)過截留分子量為300的納濾膜截留，將所得截留液冷凍干燥得到蚯蚓多肽。
此條件下蚯蚓多肽提取物的提取率為10.56％，多肽提取物呈微黃色、帶有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
實施例3
一種蚯蚓多肽提取物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：
(1)預(yù)處理：取新鮮蚯蚓1000g清洗干凈，然后在1mg/L的蔗糖溶液中浸泡35min后撈出，再將蚯蚓置于生理鹽水中浸泡25min，待生理鹽水中無泥沙污物時將蚯蚓撈出瀝干，然后按照料液比1:18的比例加入0.25mol/L的氯化鉀溶液，勻漿，超聲浸提(超聲功率160w，超聲時間15min，超聲溫度40℃)，得到固液混合體；
(2)發(fā)酵處理：取步驟(1)中的固液混合體，加入固液混合體重量0.1倍的混合菌種(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的質(zhì)量比為0.43:0.3:0.25)，調(diào)pH5.5,溫度控制在35℃發(fā)酵20h，得到發(fā)酵混合物；
(3)一次酶解：取步驟(2)中的發(fā)酵混合物，加入發(fā)酵混合物重量0.08倍的菠蘿蛋白酶，調(diào)pH7，溫度控制在58℃進(jìn)行酶解25min，92℃滅酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步驟(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.04倍的胃蛋白酶，在維持胃蛋白酶活性條件下進(jìn)行酶解處理(酶解溫度為35℃，酶解時間為20min)，將所得酶解產(chǎn)物離心去渣，收集的上清液為蚯蚓多肽粗提液；
(5)超濾處理：取步驟(4)中的蚯蚓多肽粗提液經(jīng)過截留分子量為3000的超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)過分子量為300的納濾膜截留，將所得截留液冷凍干燥得到蚯蚓多肽。
此條件下蚯蚓多肽提取物的提取率為11.35％，多肽提取物呈微黃色、帶有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
實施例4
一種蚯蚓多肽提取物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：
(1)預(yù)處理：取新鮮蚯蚓1000g清洗干凈，然后在1mg/L的蔗糖溶液中浸泡40min后撈出，再將蚯蚓置于生理鹽水中浸泡30min，待生理鹽水中無泥沙污物時將蚯蚓撈出瀝干，然后按照料液比1：20的比例加入0.3mol/L的氯化鉀溶液，勻漿，超聲浸提(超聲功率200w，超聲時間25min，超聲溫度45℃)，得到固液混合體；
(2)發(fā)酵處理：取步驟(1)中的固液混合體，加入固液混合體重量0.15倍的混合菌種(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的質(zhì)量比為0.5:0.35:0.3)，調(diào)pH6,溫度控制在37℃發(fā)酵24h，得到發(fā)酵混合物；
(3)一次酶解：取步驟(2)中的發(fā)酵混合物，加入發(fā)酵混合物重量0.1倍的菠蘿蛋白酶，調(diào)pH6.5，溫度控制在60℃進(jìn)行酶解30min，90℃滅酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步驟(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.05倍的胃蛋白酶，在維持胃蛋白酶活性條件下進(jìn)行酶解處理(酶解溫度為37℃，酶解時間為25min)，將所得酶解物離心去渣，收集的上清液為蚯蚓多肽粗提液；
(5)超濾處理：取步驟(4)中的蚯蚓多肽粗提液經(jīng)過超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)過納濾膜截留，將所得截留液冷凍干燥得到蚯蚓多肽。
此條件下蚯蚓多肽提取物的提取率為10.89％，多肽提取物呈微黃色、帶有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
實施例5
一種蚯蚓多肽提取物的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：
(1)預(yù)處理：取新鮮蚯蚓1000g清洗干凈，然后在1mg/L的蔗糖溶液中浸泡40min后撈出，再將蚯蚓置于生理鹽水中浸泡30min，待生理鹽水中無泥沙污物時將蚯蚓撈出瀝干，然后按照料液比1：20的比例加入0.3mol/L的氯化鉀溶液，勻漿，超聲浸提(超聲功率200w，超聲時間25min，超聲溫度45℃)，得到固液混合體；
(2)發(fā)酵處理：取步驟(1)中的固液混合體，加入固液混合體重量0.15倍的混合菌種(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的質(zhì)量比為0.5:0.35:0.3)，調(diào)pH6,溫度控制在37℃發(fā)酵24h，得到發(fā)酵混合物；
(3)一次酶解：取步驟(2)中的發(fā)酵混合物，加入發(fā)酵混合物重量0.1倍的菠蘿蛋白酶，調(diào)pH6.5，溫度控制在60℃進(jìn)行酶解30min，90℃滅酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步驟(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.05倍的胃蛋白酶，在維持胃蛋白酶活性條件下進(jìn)行酶解處理(酶解溫度為37℃，酶解時間為25min)，滅酶，得酶解物；
(5)三次酶解：取步驟(4)中的酶解物，然后加入酶解物重量0.03倍的無花果蛋白酶，調(diào)pH6.5，溫度控制在48℃，酶解30min，滅酶，酶解物離心去渣，收集的上清液為蚯蚓多肽粗提液；
(6)超濾處理：取步驟(5)中的蚯蚓多肽粗提液經(jīng)過超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)過納濾膜截留，將所得截留液冷凍干燥得到蚯蚓多肽。
此條件下蚯蚓多肽提取物的提取率為11.56％，多肽提取物呈微黃色、帶有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
對比實施例
與實施例3相比，區(qū)別僅在于不進(jìn)行步驟(2)發(fā)酵處理。此工藝條件下多肽提取物的得率為8.45％，多肽提取物顏色差、帶有腥味，所得多肽提取物的分子量小于3000。
實施例5
(1)蚯蚓多肽提取物對有機自由基DPPH的清除作用
取蚯蚓多肽提取物，分別按照表1中的濃度配置多肽提取物樣品溶液，以a-熊果苷作為陽性對照。采用DPPH法檢測蚯蚓多肽提取物對DPPH的清除作用，清除率計算公式:
清除率(％)＝(A對照-A樣品)/A對照×100％
清除率結(jié)果見表1。
表1蚯蚓多肽提取物對超氧陰離子自由基的清除作用
實驗結(jié)果表明各濃度下的蚯蚓多肽提取物對體外有機自由基DPPH都有一定的清除能力，并且在0.05～8mg/ml的范圍內(nèi)，其清除率隨著濃度的增高而增強，當(dāng)濃度為8mg/ml時蚯蚓多肽提取物對DPPH的清除率達(dá)到93.6％。
(2)蚯蚓多肽提取物對超氧陰離子自由基的清除作用
取蚯蚓多肽提取物，分別按照表2中的濃度范圍0.8-25mg/ml配置多肽提取物樣品溶液，以VC作為陽性對照(其中VC對照品溶液配置0.1mg/ml、0.4mg/ml和0.8mg/ml三個濃度)，采用鄰苯三酚法檢測蚯蚓多肽提取物對超氧陰離子自由基的清除作用，清除率結(jié)果見表2。
表2蚯蚓多肽提取物對超氧陰離子自由基的清除作用
實驗結(jié)果表明各濃度下的蚯蚓多肽提取物樣品溶液對體外超氧陰離子自由基都有一定的清除能力，并且在0.8～25mg/ml的范圍內(nèi)，其清除率隨著濃度的增高而增強，當(dāng)濃度為25mg/ml時蚯蚓多肽提取物對超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到70.3％。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。