本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)血清培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體以及功能蛋白的新興產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展壯大。絕大多數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)需要?jiǎng)游飦?lái)源的血清，血清可以為離體培養(yǎng)的細(xì)胞提供豐富的生長(zhǎng)因子、激素和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。然而，由于血清中蛋白種類(lèi)較多、成分復(fù)雜，增加了下游提取工作的負(fù)擔(dān)和成本。同時(shí)，血清價(jià)格昂貴、批次間質(zhì)量不穩(wěn)定、易引入動(dòng)物源的病毒和支原體，給細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)了諸多不便。

無(wú)血清培養(yǎng)基是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵，由于無(wú)血清培養(yǎng)基蛋白含量低、質(zhì)量穩(wěn)定、無(wú)病毒等潛在危險(xiǎn)引入，大大降低了細(xì)胞培養(yǎng)和產(chǎn)物提取的成本，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用有利于動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模、產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)。

目前國(guó)外已有生物企業(yè)研發(fā)的無(wú)血清培養(yǎng)基產(chǎn)品成功上市，如Gibco、Hyclone、Lonza等，但價(jià)格昂貴；國(guó)內(nèi)無(wú)血清培養(yǎng)基的研發(fā)尚處于起步階段，目前鮮有上市品牌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種無(wú)血清培養(yǎng)基及其制備方法，能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的生殖環(huán)境，且易于細(xì)胞提取。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：發(fā)明一種無(wú)血清培養(yǎng)基，其特征在于：各原料在無(wú)血清培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)如下：

優(yōu)選的，各原料在無(wú)血清培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)如下：

優(yōu)選的，所述水為超純水。

本發(fā)明還提供了一種上述無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)制備儲(chǔ)液：

將甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸鹽酸鹽、L-天冬酰胺一水、L-天門(mén)冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水、L-胱氨酸二鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽一水、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和L-纈氨酸分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得氨基酸儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷凍保存；

將L-谷氨酰胺溶于水，制得谷氨酰胺儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷凍保存；

將L-色氨酸和L-酪氨酸二鈉鹽分別或者混合溶解在0.1mol/L的鹽酸中，制得色氨酸和酪氨酸二鈉鹽儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷凍保存；

將抗壞血酸、生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、尼克酰胺、鹽酸吡哆素、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12和肌醇分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得維生素儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

將氯化鈣、硫酸鎂和一水磷酸二氫鈉分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得無(wú)機(jī)鹽儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

將D-葡萄糖、硫辛酸、酚紅、丙酮酸鈉、酵母蛋白水解物、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺二鹽酸、血藍(lán)蛋白、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸磷酸酯、氫化可的松、層黏連蛋白、玻連蛋白、聚-L-賴(lài)氨酸、地塞米松、甲狀腺激素、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、甘油三脂、磷脂、膽固醇和乙醇胺分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得微量元素儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

將胰島素溶于質(zhì)量百分濃度為1％的冰乙酸溶液中；制得胰島素儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

上述原料在各自?xún)?chǔ)液中的濃度(mg/L)如下：

(2)將適量氯化鉀、氯化鈉、步驟(1)中制得的氨基酸儲(chǔ)液、色氨酸和酪氨酸二鈉鹽儲(chǔ)液、維生素儲(chǔ)液、無(wú)機(jī)鹽儲(chǔ)液、微量元素儲(chǔ)液和胰島素儲(chǔ)液加入超純水中，然后再加入碳酸氫鈉，混合溶解制得混合液，使用之前向混合液中加入經(jīng)37℃水浴解凍的谷氨酰胺儲(chǔ)液，制得無(wú)血清培養(yǎng)基，各原料在無(wú)血清培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)如下：

各原料在無(wú)血清培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)如下：

優(yōu)選的，用0.1μm的過(guò)濾器對(duì)混合液和谷氨酰胺儲(chǔ)液進(jìn)行過(guò)濾除菌。

優(yōu)選的，無(wú)血清培養(yǎng)基的儲(chǔ)存溫度為4℃。

優(yōu)選的，步驟(1)中的冷凍溫度為-20℃，冷藏溫度為2～8℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、細(xì)胞增殖：本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基細(xì)胞增殖正常、活力穩(wěn)定，與含10％小牛血清成品培養(yǎng)基相比無(wú)顯著差異；

2、蛋白含量低：本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基蛋白含量明顯低于常規(guī)培養(yǎng)基，簡(jiǎn)化了提取工藝、降低了生產(chǎn)成本；

3、質(zhì)量穩(wěn)定：由于本產(chǎn)品成分已知、無(wú)動(dòng)物源蛋白，重復(fù)生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定。

4、本發(fā)明適用范圍廣泛，可適用于Vero、BHK-21、A549、CHO等多種常用細(xì)胞系，且從常規(guī)血清培養(yǎng)基過(guò)渡簡(jiǎn)單，適應(yīng)性快；

5、細(xì)胞貼壁速度快，以Vero細(xì)胞為例，采用本品培養(yǎng)6h，可貼壁90％以上；

6、本發(fā)明所有成分均已知，配置工藝簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性較好。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例一

本發(fā)明制備無(wú)血清培養(yǎng)基的步驟如下：

(1)制備儲(chǔ)液：

將甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸鹽酸鹽、L-天冬酰胺一水、L-天門(mén)冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水、L-胱氨酸二鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽一水、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和L-纈氨酸分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得氨基酸儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷凍保存；

將L-谷氨酰胺溶于水，制得谷氨酰胺儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷凍保存；

將L-色氨酸和L-酪氨酸二鈉鹽分別或者混合溶解在0.1mol/L的鹽酸中，制得色氨酸和酪氨酸二鈉鹽儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷凍保存；

將抗壞血酸、生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、尼克酰胺、鹽酸吡哆素、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12和肌醇分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得維生素儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

將氯化鈣、硫酸鎂和一水磷酸二氫鈉分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得無(wú)機(jī)鹽儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

將D-葡萄糖、硫辛酸、酚紅、丙酮酸鈉、酵母蛋白水解物、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺二鹽酸、血藍(lán)蛋白、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸磷酸酯、氫化可的松、層黏連蛋白、玻連蛋白、聚-L-賴(lài)氨酸、地塞米松、甲狀腺激素、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、甘油三脂、磷脂、膽固醇和乙醇胺分別溶于水或者兩種以上混合溶于水，制得微量元素儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

將胰島素溶于質(zhì)量百分濃度為1％的冰乙酸溶液中；制得胰島素儲(chǔ)液，并進(jìn)行冷藏保存；

上述原料在各自?xún)?chǔ)液中的濃度(mg/L)如下：

冷凍保存的溫度為-20℃，冷藏保存的溫度為2℃；

(2)將適量氯化鉀、氯化鈉、步驟(1)中制得的氨基酸儲(chǔ)液、色氨酸和酪氨酸二鈉鹽儲(chǔ)液、維生素儲(chǔ)液、無(wú)機(jī)鹽儲(chǔ)液、微量元素儲(chǔ)液和胰島素儲(chǔ)液加入超純水中，然后再加入碳酸氫鈉，混合溶解制得混合液，并用0.1μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，用37℃水浴解凍的方法對(duì)谷氨酰胺儲(chǔ)液解凍，然后用0.1μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌；

使用之前向混合液中加入經(jīng)上述處理的谷氨酰胺儲(chǔ)液，制得無(wú)血清培養(yǎng)基，各原料在無(wú)血清培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)如下：

該無(wú)血清培養(yǎng)基的儲(chǔ)存溫度為4℃。

實(shí)施例二

本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟(1)中上述原料在各自?xún)?chǔ)液中的濃度(mg/L)如下：

冷藏保存的溫度為6℃；

步驟(2)中各原料在無(wú)血清培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)如下：

實(shí)施例三

本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟(1)中上述原料在各自?xún)?chǔ)液中的濃度(mg/L)如下：

冷藏保存的溫度為8℃；

步驟(2)中各原料在無(wú)血清培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)如下：

以Vero細(xì)胞為例，進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)是在溫度為37℃的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)3天，CO2的通入量5.0％。其中，對(duì)比例一中所用培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基+10％小牛血清，對(duì)比例二中所用培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基+10％小牛血清，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：

從上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培育方面的主要性能完全不遜色于有血清的培養(yǎng)基，甚至還要優(yōu)異些，完全能夠滿(mǎn)足細(xì)胞培育的需求。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以組合、變更或改型均為本發(fā)明的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。