本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類化合物及其合成方法。

背景技術(shù)：

腫瘤已嚴(yán)重威脅到人類的健康，尋找有效安全、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤藥物研發(fā)工作者孜孜以求的目標(biāo)。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展，以吡唑環(huán)為結(jié)構(gòu)母核的化合物在腫瘤治療中的作用引起廣泛關(guān)注。

甘草查爾酮A被視為脹果甘草的種屬特異性成分，其結(jié)構(gòu)如下。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降脂、解痙和抗瘧抗寄生蟲等多種生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有很大的開發(fā)價值。甘草查爾酮A是平面性強的分子，水溶性差，因而通過合理、安全的結(jié)構(gòu)修飾增強甘草查爾酮A的水溶性，開發(fā)天然產(chǎn)物甘草查爾酮A的更多生物活性，成為亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類化合物及其合成方法。

本發(fā)明的實現(xiàn)過程如下：

結(jié)構(gòu)通式（I）所示的化合物，

其中：R為氫基，C1-C4的烷基，鹵素取代或未取代的苯基，氨基。

結(jié)構(gòu)通式（I）所示的化合物的合成方法，其特征在于：由甘草查爾酮A、氨基脲類化合物為原料，以有機堿為催化劑進行合成；

。

具體包含如下步驟：

（1）向反應(yīng)器中按摩爾比為1:1~1:1.5加入甘草查爾酮A和氨基脲類化合物，加入有機溶劑混合均勻，加入有機堿催化劑，80℃~120℃回流反應(yīng)3~8小時；

（2）將步驟（1）反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，柱層析分離提純，干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟（1）中所述的甘草查爾酮A：氨基脲類化合物的摩爾比范圍為1:1 ~1:1.3；有機溶劑為甲苯或DMF；反應(yīng)溫度為105℃~115℃；有機堿催化劑為三乙胺。

吡唑環(huán)是很多天然化合物和合成藥物中的核心結(jié)構(gòu)單元，作為雜環(huán)化合物中的一個重要分支，吡唑類化合物因其具有高效、低毒，以及其環(huán)上取代基可以多方位的變換而在藥物領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。將吡唑環(huán)引入甘草查爾酮A的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，可以增強其生物活性，提高選擇性，具有重要的理論價值和實際應(yīng)用價值。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：原料環(huán)保，生產(chǎn)成本低，操作安全性高，反應(yīng)條件溫和，可實現(xiàn)反應(yīng)原料的充分利用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低的問題，同時將吡唑環(huán)引入到甘草查爾酮A的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，對探究該類化合物的生物活性與總結(jié)構(gòu)效關(guān)系具有重要的理論價值和應(yīng)用價值。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。這些實施例僅是出于解釋說明的目的，而不限制本發(fā)明的范圍和實質(zhì)。

一種具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類化合物的合成方法具體包含如下步驟：

（1）向反應(yīng)器中按摩爾比為1:1~1:1.5加入甘草查爾酮A、氨基脲類化合物，加甲苯或DMF混合均勻，其中溶劑體積小于反應(yīng)器容積的2/3，加入有機堿催化劑三乙胺，置于磁力攪拌器上攪拌，加熱到80℃~120℃，回流反應(yīng)3~8小時；

（2）反應(yīng)過程中使用薄層色譜追蹤，及時監(jiān)測反應(yīng)的進行程度，待原料反應(yīng)完全后停止加熱，撤去冷凝裝置；

（3）將步驟（2）反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，濃縮液過柱層析，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，加有機溶劑重結(jié)晶，過濾，干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。

本發(fā)明部分優(yōu)選實施方案中的化合物結(jié)構(gòu)式如下所示：

實施例1

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-吡唑-1-甲酰胺（1）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和57.68mg(1.3mmol) 氨基脲，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到100℃，磁力攪拌回流反應(yīng)6小時。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（113.41mg），總收率48.65%。

棕色結(jié)晶性粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 9.68 (2H, s),7.74 (2H, t),7.30 (1H, s), 6.82 (2H, t), 6.45 (1H, s), 6.20 (3H, m), 5.00-4.90 (3H, m), 3.69-3.94 (5H, m), 1.46 (6H, s); ¹³C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 160.8, 155.3, 155.1, 154.7, 153.9, 148.8, 129.1, 128.3, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 62.4, 56.1, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 340.18, found: 340.29.

實施例2

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-N-苯基-4,5-二氫-1H-吡唑-1甲酰胺（2）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和116.15mg(1.3mmol) N-苯基肼甲酰胺，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到80℃，磁力攪拌回流反應(yīng)3小時。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（143.58mg），總收率51.52%。

棕黃色粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K): d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.50 ( 2H, m), 7.37 (3H, m), 7.07 ( 1H, t), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 3.96 (2H, m), 3.72 (3H, s),1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.9, 151.9, 148.8, 139.4, 129.1, 128.9, 128.3, 128.0, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 62.4, 56.1, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 472.45, found: 472.38.

實施例 3

N-（3-氯苯基）-5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫 -1H-吡唑-1-甲酰胺（3）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和142.61mg(1.3mmol) N-（3-氯苯基）肼甲酰胺，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到100℃，磁力攪拌回流反應(yīng)5小時。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（125.89mg），總收率42.01%。

棕黃色結(jié)晶性粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.90 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.46 ( 2H, m), 7.27 (1H, s), 7.16 (1H, d), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 3.96 (2H, m), 3.72 (3H, s),1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 138.4, 134.5, 130.3, 129.1, 125.2, 121.6, 119.7, 116.0, 111.1, 103.8, 62.4, 56.1, 39.8,39.7, 19.8;HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 506.33, found: 506.29.

實施例 4

N-（4-氯苯基）-5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫 -1H-吡唑-1-甲酰胺（4）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和142.61mg(1.3mmol) N-（4-氯苯基）肼甲酰胺，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到120℃，磁力攪拌回流反應(yīng)6小時。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（146.01mg），總收率48.82%。

黃色粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.72( 2H, t), 7.40 ( 2H, m), 7.27 (1H, s), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 3.96 (2H, m), 3.72 (3H, s),1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 137.5, 133.3, 129.1, 129.0, 128.3, 125.2, 121.6, 120.8, 116.0, 111.1, 103.8, 62.7, 56.1, 39.8,39.7, 19.8; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 506.45, found：506.56.

實施例 5

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-吡唑-1-硫代酰肼（5）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和81.55mg(1.3mmol) 肼硫代酰肼，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到115℃，磁力攪拌回流反應(yīng)8小時。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（128.37mg），總收率50.92%。

褐色結(jié)晶固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K): d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.30 (1H, s), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (2H, m), 3.92 (2H, m), 3.72 (3H, s), 3.21(2H, s), 1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 181.5, 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 129.1, 129.0, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 67.5, 56.1, 40.4, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 427.32， found：427. 63.

實施例 6

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-吡唑-1-碳酰肼（6）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和69.21mg(1.3mmol) 肼基酰肼，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到105℃，磁力攪拌回流反應(yīng)6小時。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（117.08mg），總收率48.26%。

褐色結(jié)晶固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K): d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.30 (1H, s), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 4.35(2H, s), 3.92 (2H, m), 3.72 (3H, s), 1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 129.1, 129.0, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 67.5, 56.1, 40.4, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd:411.43, found:411.35.

實施例 7 本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性測試

對本發(fā)明的化合物進行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗,試驗方法采用常規(guī)的MTT法。

細(xì)胞株選用：人前列腺癌(PC-3)，人胃腺癌細(xì)胞(SGC-7901)，人肺癌細(xì)胞(A-549)。培養(yǎng)液為DMEM+15%NBS+雙抗。

樣品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均勻的混懸液，然后用DMSO的PBS(-)稀釋，最終濃度分別為0.1,1,10,20,40,60,80,100 μmol/L。

將抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶 (5-FU) 以同樣的條件配成對照品溶液。

細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁生長腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素（各100萬U/L）的 1640 培養(yǎng)液中，置于 37℃，5% CO2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每 2～3 天傳代 1 次，傳代時首先倒出培養(yǎng)液，PBS洗 2 次，胰酶消化后，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

MTT法檢測細(xì)胞活性及IC₅₀的測定：

實驗原理：活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能將黃色的MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜 (MTT formazan),并沉積在細(xì)胞中，生成的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，而死細(xì)胞沒有這種功能。DMSO能溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，顏色深淺與所含的量成正比，因此用酶標(biāo)儀測定的光吸收值可反映細(xì)胞存活率。

實驗方法：取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計數(shù)，以 3×105/mL 的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。培養(yǎng) 24小時后，將待測化合物以0.1,1,10,20,40,60,80,100 μmol/L濃度處理細(xì)胞。實驗組每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，以含0.4% DMSO的培養(yǎng)液作對照。藥物作用 48小時后，去上清，每孔加入100 μl MTT（2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2H-四唑氫溴酸鹽）(1mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時，棄上清，每孔加入100μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值，采用 IC₅₀ 計算軟件求出半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

試驗結(jié)果詳見表1，其中，樣品是指相應(yīng)實施例中制備的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類衍生物，樣品編號對應(yīng)制備實施例中所得到的化合物的具體編號。

表1 化合物對不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC₅₀（單位：μmol/L）

表1結(jié)果顯示，化合物1-6在所測試的3種細(xì)胞株中均表現(xiàn)出了不同程度的抗腫瘤活性，其中化合物1和5的活性較好，對細(xì)胞呈現(xiàn)較強的抑制效果，在特定細(xì)胞株中抗腫瘤活性優(yōu)于或等同于5-氟尿嘧啶，對不同腫瘤細(xì)胞株具有明顯選擇性。綜上，本發(fā)明的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類衍生物可作為抗腫瘤候選藥物進一步進行臨床前研究，也可以作為抗腫瘤先導(dǎo)化合物進一步研究。