本發(fā)明屬于蔬菜水果農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)，具體涉及一種用于吡蟲啉殘留分析的ELISA檢測試劑盒及檢測方法。
技術(shù)背景
吡蟲啉(imidacloprid)，化學(xué)名稱1- (6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪哩烷-2-基胺。吡蟲啉是煙堿類超高效殺蟲劑，具有廣譜、高效、低毒、低殘留，害蟲不易產(chǎn)生抗性，對人、畜、植物和天敵安全等特點(diǎn)，并有觸殺、胃毒和內(nèi)吸等多重作用。對飛虱、蚜蟲、葉蟬等刺吸式口器害蟲有特效。
目前檢測吡蟲啉的技術(shù)手段主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，但這些方法都存在回收率低、檢測樣品前處理程序繁瑣等缺點(diǎn)，不適用于大量樣品的檢測工作。因此，迫切需要一種方便快捷的新型檢測方法對果蔬中吡蟲啉的殘留進(jìn)行檢測。酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及高特異性、高靈敏度、價格低廉、操作簡單，能大批量快速檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫檢測方法。
本發(fā)明提供的一種吡蟲啉的人工抗體的制備方法，步驟如下：
（1）稱取吡蟲啉于三口燒瓶中，用DMSO 溶解，再加入KOH ；另稱取β-巰基丙酸，用DMSO 溶解并轉(zhuǎn)移至恒壓滴液漏斗中；在攪拌下將β-巰基丙酸溶液緩慢滴加到三口燒瓶中，于油浴上使之緩慢升溫至100℃，保溫2 h后，撤去油??；待產(chǎn)物自然冷卻至室溫后，加入水，以HCl溶液調(diào)節(jié)pH 值為3；將此混合液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用二氯甲烷分3次提取，收集有機(jī)相；用NaHCO3水溶液分3 次洗滌二氯甲烷提取液，收集水相；用乙醚洗滌水相，棄去乙醚層；再用HCl溶液調(diào)節(jié)水相pH 值為3，然后用乙酸乙酯分3 次萃取水相，合并乙酸乙酯提取液；用蒸餾水洗滌乙酸乙酯，棄水層；提取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮，得到黃色粘稠液體；加入丙酮溶液溶解，靜置過夜，有黃色晶體析出；過濾，取出晶體，供MS 和1H-NMR 鑒定結(jié)構(gòu), 即得到吡蟲啉的半抗原；
（2）將半抗原溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，然后加二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，讓其在室溫下攪拌反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)離心后，吸取上清液緩慢滴加到牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液，攪拌反應(yīng)6 h；待反應(yīng)完成后，裝入透析袋進(jìn)行透析，透析結(jié)束后取出分裝保存于－20℃的冰箱中，即得到吡蟲啉的人工完全抗原；
（3）利用吡蟲啉人工抗原對小型哺乳動物進(jìn)行免疫，所得到的多克隆抗體即為吡蟲啉多克隆抗體。
本發(fā)明提供一種檢測吡蟲啉殘留的ELISA檢測試劑盒，其特征在于包括有:
包被有吡蟲啉包被原的酶標(biāo)板；
吡蟲啉抗體；
吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品；
辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體；
洗滌液Na2HPO4·12H2O 68.8 g，NaH2PO4 6.9 g，NaCl 45 g；
底物液: 底物液A：無水乙酸鈉8.2 g，β-糊精2.5 g，過氧化氫脲428.6 mg，加雙蒸水至1000 mL，調(diào)節(jié)PH至5.0，4℃保存；底物液B：取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存。使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min；
反應(yīng)終止液為1.25 mol/L的H2SO4。
上述的吡蟲啉偶聯(lián)抗原是由吡蟲啉半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白。
本發(fā)明提供的測果蔬中吡蟲啉殘留的ELISA試劑盒檢測方法，其主要步驟如下：
（1）稱取果蔬中可食用部分，加入取提取液，充分研磨并過濾，所得濾液即為待測樣品；
（2）在包被有吡蟲啉抗原并封閉好的酶標(biāo)板孔中，加入相同體積的吡蟲啉抗體及待測樣品，37 ℃孵育40 min后用洗滌液，靜置5min，甩掉洗液，將酶標(biāo)板拍干，洗滌3次；
（3）加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗滌液，靜置5min，甩掉洗液，將酶標(biāo)板拍干，洗滌3次；
（4）加入新鮮配制的底酶標(biāo)板物顯色液，每孔0.1 mL，37 ℃反應(yīng)30min，觀察顏色變化；
（5）待顯色反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液，每孔0.05 mL，終止反應(yīng)；
（6）將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，于490 nm波長處測定檢測結(jié)果。
本發(fā)明的積極效果：本發(fā)明提供了檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，利用該試劑盒檢測果蔬中吡蟲啉殘留，具有高特異性、高靈敏度、價格低廉、操作簡單的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)大批量快速檢測果蔬吡蟲啉殘留。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
吡蟲啉人工抗原制備
（1）稱取20 mmol吡蟲啉5.15g于100 ml 三口燒瓶中，用20 ml DMSO 溶解，再加入40mmol KOH 2.25 g ；另稱取20mmolβ-巰基丙酸2.10 g，用10 ml DMSO 溶解并轉(zhuǎn)移至50 ml 恒壓滴液漏斗中；在攪拌下將β-巰基丙酸溶液緩慢滴加到三口燒瓶中，于油浴上使之緩慢升溫至100℃，保溫2 h后，撤去油?。?/p>
待產(chǎn)物自然冷卻至室溫后，加入50ml水，以6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 值為3；將此混合液轉(zhuǎn)移到250 ml 分液漏斗中，用90 ml 二氯甲烷分3次提取，收集有機(jī)相；用75 ml 1 mol/L NaHCO3水溶液分3 次洗滌二氯甲烷提取液，收集水相；用乙醚洗滌水相，棄去乙醚層；再用 6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)水相pH 值為3，然后用90 ml 乙酸乙酯分3 次萃取水相，合并乙酸乙酯提取液；用蒸餾水洗滌乙酸乙酯，棄水層；提取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮，得到黃色粘稠液體；加入少量丙酮溶液溶解，靜置過夜，有黃色晶體析出；過濾，取出晶體，供MS 和1H-NMR 鑒定結(jié)構(gòu), 即得到吡蟲啉的半抗原。
（2）將50～80 μmol半抗原溶解在2ml N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入1mL二環(huán)己基碳二亞胺和1mL N-羥基琥珀酰亞胺，讓其在室溫下攪拌反應(yīng)過夜，反應(yīng)液經(jīng)離心（4 000r/min）后，吸取上清液800 μl 緩慢滴加到8 ml 20 mg/ml 牛血清蛋白（BSA）碳酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L,pH 9.0)，攪拌反應(yīng)6 h。待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析3 次，然后用PBS 透析3 d，取出分裝保存于－20℃的冰箱中，即得到吡蟲啉的人工完全抗原。
實(shí)施例2
吡蟲啉多克隆抗體制備
取3mg吡蟲啉人工抗原溶于1mL生理鹽水中，將稀釋過的吡蟲啉人工抗原與等體積的弗式完全佐劑進(jìn)行乳化，隨后利用皮下多點(diǎn)注射的方法將乳化后的人工抗原注射于新西蘭大白兔體內(nèi)，每只大白兔一次用量為0.5mg/kg，15天后，將同樣用生理鹽水稀釋過的吡蟲啉人工抗原與等體積的弗式不完全佐劑進(jìn)行乳化，加強(qiáng)免疫，用量為0.01mg/kg；15天后，進(jìn)行第三次使用稀釋過的吡蟲啉人工抗原與等體積的弗式不完全佐劑進(jìn)行乳化后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫；從此次加強(qiáng)免疫開始，免疫7天后取血，并測定其抗血清效價；將制備好的吡蟲啉多克隆抗體保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例3
吡蟲啉殘留的ELISA檢測試劑盒，包括有:
包被有吡蟲啉包被原的酶標(biāo)板。
吡蟲啉抗體。
吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品。
辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體。
洗滌液Na2HPO4·12H2O 68.8 g，NaH2PO4 6.9 g，NaCl 45 g。
底物液: 底物液A：無水乙酸鈉8.2 g，β-糊精2.5 g，過氧化氫脲428.6 mg，加雙蒸水至1000 mL，調(diào)節(jié)PH至5.0，4℃保存；底物液B：取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存。使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min。
反應(yīng)終止液為1.25 mol/L的H2SO4。
說明書1份。
實(shí)施例4
利用試劑盒檢測果蔬中吡蟲啉殘留
（1）樣品前處理：稱取果蔬中可食用部分10 g放入研缽中，加入取10 mL提取液，充分研磨并過濾，所得濾液即為待測樣品。
（2）在包被有吡蟲啉抗原并封閉好的酶標(biāo)板孔中，加入相同體積的吡蟲啉抗體及待測樣品，37 ℃孵育40 min后用洗滌液，靜置5min，甩掉洗液，將酶標(biāo)板拍干，洗滌3次。
（3）加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗滌液，靜置5min，甩掉洗液，將酶標(biāo)板拍干，洗滌3次。
（4）加入新鮮配制的底酶標(biāo)板物顯色液，每孔0.1 mL，37 ℃反應(yīng)30min，觀察顏色變化。
（5）待顯色反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液，每孔0.05 mL，終止反應(yīng)。
（6）將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，于490 nm波長處測定檢測結(jié)果。