本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種胰島分離純化裝置，具體地說本發(fā)明可以節(jié)省胰島獲得的時間，保證較高的胰島活性率，且提高胰島純度，且節(jié)約成本。
背景技術(shù)：
糖尿病已成為危險(xiǎn)人類健康的第三大殺手，糖尿病體質(zhì)的患者是細(xì)菌生長的“沃土”，同時也伴隨著白細(xì)胞吞噬功能的下降，從而更易倒置炎癥和自身免疫疾病，包括呼吸道感染、皮膚感染、視網(wǎng)膜病變等。胰島作為胰腺分泌胰島素的唯一組成部分，是許多大小不等的和形狀不定的胰島細(xì)胞團(tuán)，散在分布于胰腺的不同部位，可控制糖的代謝，維持體內(nèi)血糖穩(wěn)定在一個正常波動水平。在現(xiàn)今，治療糖尿病(尤其是1型糖尿病)最理想的方法是胰島移植(世界華人消化雜志2012年11月28日；20(33)：3186-3190)?，F(xiàn)在主流的從供體獲得胰島的機(jī)械分離法，持續(xù)用機(jī)械力和消化液的流動來沖擊胰腺達(dá)到消化的目的，比如專利(專利號：201210563477.1)、(專利號：200980156514.3)、(專利號：201210222446.X)、(專利號：200510040622.8)、(專利號：200580043739.X)以及(專利號：201410196765.7)。然而，這些方法分離胰島，存在胰島容易破碎，過濾時胰島混合液容易丟失，消化分離所用時間較長影響胰島活性，胰島純度不高，設(shè)備不易購買或者昂貴，人力物力耗費(fèi)較多等缺點(diǎn)。本發(fā)明通過創(chuàng)新改進(jìn)現(xiàn)有分離純化裝置，試圖克服上述缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
1.一種胰島分離純化裝置，其特征在于，該裝置包括多節(jié)兩端開口的離心管身，離心管帽，不同網(wǎng)孔尺寸的多層濾網(wǎng)，用于胰島消化、分離純化及收集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述離心管身兩端均有螺紋開口，能實(shí)現(xiàn)與對應(yīng)離心管帽或另一節(jié)離心管身的端端組裝吻合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述離心管壁上有刻度值，用于計(jì)算管內(nèi)液體量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述離心管外壁上有磨砂表面，用于作標(biāo)記之用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述離心管身含有一節(jié)或多節(jié)短管身，用于增加管內(nèi)空間和增加濾過次數(shù)。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述短管身中部橫截面處可鑲嵌有篩網(wǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求6所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述濾網(wǎng)網(wǎng)孔尺寸為3-1000um。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求5、6、7所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述含濾網(wǎng)的短管身可有不同組合方式組裝，以實(shí)現(xiàn)不同胰島尺寸的消化分離目的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰島分離純化裝置，其特征在于，所述離心管(包括離心管身和管帽)和濾網(wǎng)由生物材料(含有PP材料、聚四氟乙烯、新型納米或金屬材料)制成。
有益效果
本發(fā)明涉及的胰島分離方法，具有以下有益效果：
(1)本發(fā)明涉及的胰島分離純化裝置，利用胰腺消化液中不同組織細(xì)胞的尺寸差異(單個細(xì)胞5-30um，胰島70-220um，支持組織塊＞600um)，通過多層差異性網(wǎng)孔尺寸網(wǎng)篩過濾消化液的裝置，可以一次性獲得較高純度胰島細(xì)胞，減少胰島耗損，提高胰島活性和移植成功率。
(2)本發(fā)明所涉及的胰島分離純化裝置，利用胰腺消化液中不同組織細(xì)胞的尺寸差異，于同一只離心管內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)二次甚至多次消化，使胰腺消化比較完全，提高了胰島得率，且節(jié)省消化酶的用量和消化時間。
(3)本發(fā)明所涉及的胰島分離純化裝置，所需設(shè)備簡單，不需要額外復(fù)雜昂貴的設(shè)備，且一次實(shí)驗(yàn)只需兩只離心管即可完成實(shí)驗(yàn)，極大程度上節(jié)約了成本，且本發(fā)明裝置可以由實(shí)驗(yàn)員在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室利用普通材料(離心管、濾網(wǎng)、刀片等)自己制作完成，降低生產(chǎn)成本，特別適合中小型實(shí)驗(yàn)室研究員使用，亦可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化批量生產(chǎn)。
(4)本發(fā)明所涉及的胰島分離純化裝置，操作簡單，不需要復(fù)雜的步驟，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下即可進(jìn)行，且消化過程人為干預(yù)少，減少細(xì)胞污染的可能性，且節(jié)省人力，節(jié)省時間，提高實(shí)驗(yàn)效率和成功率。
附圖說明
圖1本發(fā)明裝置示意圖：1離心管帽；2管外壁磨砂面；3胰腺組織；4粗孔篩；5、8結(jié)合處(可拆卸)；6胰島；7細(xì)孔篩；9單細(xì)胞混懸液；A上管節(jié)；B中管節(jié)；C下管節(jié)。
具體實(shí)施方式
以下將結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
一種高效分離純化小鼠胰島方法的具體操作步驟：
分離液的配制：Hanks液500mL加入羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，配制成10mmol/L，0.22um孔徑濾膜過濾除菌，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，4℃保存。
消化液的配制：臨用之前新鮮配制，以Hanks液溶解膠原酶V，其最終質(zhì)量濃度為1mg/mL；補(bǔ)充氯化鈣，使鈣離子最終摩爾濃度為10mmol/L；添加DNA裂解酶，其最終質(zhì)量濃度為0.01mg/mL。0.22um孔徑濾膜過濾除菌。
Ficoll 400配置：
(1)Ficoll 100g+Hank’s 200ml，完全溶解后加Hank’s至400ml即為25％Ficoll溶液。
(2)25％Ficoll 92ml+Hanks8ml即為23％Ficoll溶液。
(3)25％Ficoll80ml+Hanks20ml即為20％Ficoll溶液。
(4)25％Ficoll44ml+Hanks56ml即為11％Ficoll溶液。
雙硫腙(DTZ)染料：取DTZ粉末10mg溶于3ml無水乙醇，加入50ul濃氨水，再加Hanks液12ml，4°儲存?zhèn)溆谩ＥR用前用Hanks液按1∶100稀釋，0.22um孔徑濾膜過濾除菌。
本發(fā)明裝置方法組：
(1)胰腺的獲?。哼x取實(shí)驗(yàn)小鼠BALB/C，麻醉之(按10％水合氯醛(0.05ml/10g)*體重)，腹部消毒(75％乙醇)，開腹；找到十二指腸壺腹部，用絲線貼近十二指腸結(jié)扎壺腹部；沿膽囊管找到膽總管，靠近肝門處向胰頭方向用5號頭皮針進(jìn)針，結(jié)扎固定針頭；剪破心臟放血；沿頭皮針緩慢注入4度預(yù)冷膠原酶V(1g/L)2mL，使胰腺充分膨脹，立即剪除胃與橫結(jié)腸之間的大網(wǎng)膜及脾臟，沿十二指腸邊緣自十二指腸向小腸方向剝離胰腺組織.剩余部分沿胰腺邊緣完整取出，置 于本發(fā)明所述離心管中(15ml，上層濾網(wǎng)孔徑600um，下層濾網(wǎng)孔徑60um)。
(2)胰腺的消化：向步驟(1)所述離心管內(nèi)加入膠原酶V(1g/L)6mL，覆蓋所述胰腺，置于恒溫水浴鍋(37度)消化(約15min)。當(dāng)胰腺呈現(xiàn)融化現(xiàn)象，震蕩消化液變渾濁，出現(xiàn)乳糜樣時，倒置離心管，使消化液與胰島組織分離，終止消化。
(3)胰島的純化、離心：取出步驟(2)中包含下層濾網(wǎng)的離心管節(jié)，并倒置于另一離心管(含60um網(wǎng)孔)管口，用Hank’s液沖洗網(wǎng)上殘留組織團(tuán)，從離心管兩端濾網(wǎng)反復(fù)沖洗數(shù)次，動作需輕柔。殘留于濾網(wǎng)上沉淀物即為純化后的完整胰島，用RMPI-1640培養(yǎng)基(含10％NBS)2ml重懸，混勻，于37度細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置、備用。
(4)二次消化：對于殘留于600um濾網(wǎng)上的未消化完全的胰腺組織塊，重復(fù)上述步驟，利用上次未耗盡的膠原酶或重新加入膠原酶V(1g/L)2mL，繼續(xù)消化未消化完成胰腺，并分離、收集胰島細(xì)胞。
對照組為(傳統(tǒng)方法組)：
(1)胰腺的獲?。哼x取實(shí)驗(yàn)小鼠BALB/C，麻醉之(按10％水合氯醛(0.05ml/10g)*體重)，腹部消毒(75％乙醇)，開腹；找到十二指腸壺腹部，用絲線貼近十二指腸結(jié)扎壺腹部；沿膽囊管找到膽總管，靠近肝門處向胰頭方向用5號頭皮針進(jìn)針，結(jié)扎固定針頭；剪破心臟放血；沿頭皮針緩慢注入4度預(yù)冷膠原酶V(1g/L)2mL，使胰腺充分膨脹，立即剪除胃與橫結(jié)腸之間的大網(wǎng)膜及脾臟，沿十二指腸邊緣自十二指腸向小腸方向剝離胰腺組織.剩余部分沿胰腺邊緣完整取出，置于本發(fā)明所述離心管中(15ml，上層濾網(wǎng)孔徑600um，下層濾網(wǎng)孔徑60um)。。
(2)胰腺的消化：將所得胰腺置入常規(guī)離心管中(15ml)，向管內(nèi)加入膠原酶V(1g/L)6mL，覆蓋所述胰腺，置于恒溫水浴鍋(37度)消化(約15min)。當(dāng) 胰腺呈現(xiàn)融化現(xiàn)象，震蕩消化液變渾濁，出現(xiàn)乳糜樣時，立即加入4℃含10％新生牛血清(NBS)的Hanks液10mL，終止消化。
(3)胰島純化、離心：用600um濾網(wǎng)，剪成圓形置于另一只離心管口，過濾(2)中所得混合液，濾液離心洗滌(1000rpm/mim*3min，Hank’s液)兩次，沉淀物加25％Ficoll 4ml混勻，其上依次分別加入23％、20％、11％Ficoll液和Hank’s液各2ml，3000rmp/min*20min、4度離心，吸出23％-20％及20％-11％界面的胰島，用Hank’s液于50ml離心管內(nèi)洗滌兩次備用。
(4)二次消化：對于(3)中濾網(wǎng)上大塊胰腺組織，可以用離心管收集，重復(fù)上述消化、分離純化步驟。
胰島活性鑒定：
用臺盼藍(lán)染色法，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。加注0.1ml0.4％臺盼藍(lán)液(4％臺盼藍(lán)母液：稱取4g臺盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加dd水至100ml，用濾紙過濾，4度保存。使用時，用hanks液稀釋至0.4％。)至離心管中，同時加入0.9ml細(xì)胞懸液(細(xì)胞懸液/胎盤藍(lán)液9∶1，終濃度0.04％)，充分混勻，注入血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中，光鏡下分別計(jì)數(shù)各個方格中染成藍(lán)色的和未被染色的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量，重復(fù)取樣3次，求平均值，即得出0.1mm3內(nèi)的平均死細(xì)胞及活細(xì)胞數(shù)。活率＝活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。
胰島純度測定
DTZ染色法：胰島內(nèi)僅胰島b細(xì)胞可以被染成猩紅色，其他胰腺細(xì)胞不著色。取0.5ml細(xì)胞懸液，加入DTZ工作液0.5ml，充分混勻，靜置10min，肉眼觀察培養(yǎng)皿中出現(xiàn)細(xì)小紅色顆粒，表明染色完成，小心加入計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中，光鏡下計(jì)數(shù)各方格內(nèi)直徑約150um的陽性細(xì)胞團(tuán)數(shù)。按公式計(jì)算胰島當(dāng)量IEQ：計(jì)算每一格的當(dāng)量值，重復(fù)3次取樣求平均值，即得出0.1mm3內(nèi)的平均當(dāng)量值。 當(dāng)量值IEQ＝平均每一方格的IEQ值*105*所取樣本的原始細(xì)胞懸液量(ml)。純度＝陽性細(xì)胞/全部細(xì)胞。
胰島功能檢測
葡萄糖刺激下胰島素分泌實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)50IEQ胰島，分別用葡萄糖濃度為1.7mmol/L和16.7mmol/L的Hanks液孵育1h，收集第1h和第2h的培養(yǎng)液，放射免疫法檢測血清胰島素水平，計(jì)算胰島素釋放指數(shù)(SI)：SI＝第2h(高糖環(huán)境)的胰島素含量/第1h(低糖環(huán)境)的胰島素含量。
表1本發(fā)明裝置及方法獲得胰島效果與傳統(tǒng)方法對比如下圖(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次實(shí)驗(yàn)取平均值)：
注：以上數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室及本發(fā)明人所測得結(jié)果。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)想的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以所附權(quán)利要求 書為準(zhǔn)。