本實(shí)用新型屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種21種食源性致病微生物多重PCR檢測試劑盒，特別涉及(結(jié)腸彎曲菌、空腸彎曲菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、出血性大腸桿菌、單核增生性李斯特菌、沙門氏菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌CTX型、霍亂弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-yst型、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-ail型、輪狀病毒和諾瓦克病毒)的多重PCR檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

食源性致病微生物是引起食物中毒的重要生物學(xué)因素。隨著國家對食品安全工作的重視，快速篩查食物中毒原因成為當(dāng)務(wù)之急。食源性微生物性疾病的病原菌種類繁多，通過臨床癥狀難以區(qū)分病原菌種類，因此在以往的食源性疾病診斷中，明確的大便培養(yǎng)結(jié)果非常重要，但大便培養(yǎng)耗時(shí)長，一般需要3-4天，因此臨床醫(yī)生往往在無病原學(xué)診斷結(jié)果的前期就經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素治療食源性腹瀉，從而導(dǎo)致抗生素濫用及病原菌耐藥。有關(guān)專家提出只有正確的細(xì)菌病原學(xué)診斷，是抗生素合理應(yīng)用的基礎(chǔ)。因此快速的病原學(xué)檢查是解決這一問題的關(guān)鍵。食源性致病微生物中的病原菌主要是副溶血性弧菌、沙門菌、變形桿菌和致瀉性大腸埃希菌等。其他如志賀菌屬、霍亂弧菌、葡萄球菌、彎曲菌等病原菌都是常見的致病菌。

多重PCR技術(shù)因具有較高的靈敏度和特異性，縮短了檢測時(shí)間，提高檢測效率和通量，是一種快速檢測病原體的方法，可彌補(bǔ)糞便培養(yǎng)及其他PCR檢測的不足，是現(xiàn)在食源性疾病病原學(xué)檢測技術(shù)的一種重要補(bǔ)充。多重PCR能避免費(fèi)時(shí)費(fèi)力的大海撈針式的排查,根據(jù)癥狀,選擇合適的靶序列組合,即對可能的病原體在一次反應(yīng)獲得結(jié)果。為處理“微生物性”食物中毒導(dǎo)致的“群體性腹瀉、嘔吐”等突發(fā)事件提供科學(xué)依據(jù),爭取寶貴時(shí)間。

然而，傳統(tǒng)的多重PCR檢測試劑盒只能對幾種特定的病原菌進(jìn)行檢測。發(fā)生食品安全突發(fā)事件的時(shí)候，如果檢測人員需要前往現(xiàn)場進(jìn)行檢測，同時(shí)攜帶多個(gè)試劑盒，不但攜帶不方便，而且試劑盒的固定就成為一個(gè)問題，若固定不穩(wěn)，試劑瓶會相互碰撞并產(chǎn)生破裂或者泄露。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了食源性致病微生物多重PCR檢測試劑盒，能夠很好的固定在試劑盒中方便攜帶，并且含有食源性疾病中常見的(結(jié)腸彎曲菌、空腸彎曲菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、出血性大腸桿菌、單核增生性李斯特菌、沙門氏菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌CTX型、霍亂弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-yst型、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-ail型、輪狀病毒和諾瓦克病毒)等21種致病微生物的所有檢測試劑，能夠快速、有效、準(zhǔn)確的篩查檢測出結(jié)腸彎曲菌、空腸彎曲菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、出血性大腸桿菌、單核增生性李斯特菌、沙門氏菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌CTX型、霍亂弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-yst型、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-ail型、輪狀病毒和諾瓦克病毒的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型可采取下述技術(shù)方案：

21種食源性致病微生物多重PCR檢測試劑盒，包括盒體，盒蓋和位于盒體內(nèi)的卡板，所述卡板上設(shè)有七個(gè)限位孔，每個(gè)限位孔中設(shè)有一個(gè)試劑管；

其中七個(gè)試劑管分別為1個(gè)多重PCR引物組反應(yīng)液管，1個(gè)多重RT-PCR引物組反應(yīng)液管，2個(gè)酶反應(yīng)混合液管，1個(gè)陰性對照品管和2個(gè)陽性對照品管；

所述七個(gè)限位孔分為四排，左起第一排設(shè)有兩個(gè)限位孔；左起第二排設(shè)有兩個(gè)限位孔；左起第三排設(shè)有一個(gè)限位孔；左起第四排設(shè)有兩個(gè)限位孔；

所述盒體下部還設(shè)有固定底座；

所述固定底座上設(shè)有與七個(gè)試劑管位置一致的凹槽。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述兩個(gè)陽性對照品管中分別包括了19種致病細(xì)菌的核酸模板，和2種致病病毒的核酸模板。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，陰性對照品管內(nèi)含無菌去離子水。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述卡板設(shè)置在盒體上部。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述盒體下部還設(shè)有固定底座。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述固定底座上設(shè)有與七個(gè)試劑管位置一致的凹槽。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述凹槽形狀為半球形，其形狀與試劑管的底部結(jié)構(gòu)形狀一致。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述試劑管為1.5mL的離心管。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述七個(gè)限位孔分為四排，左起第一排設(shè)有兩個(gè)限位孔，限位孔內(nèi)分別設(shè)有1個(gè)裝有檢測19種致病細(xì)菌的特異基因位點(diǎn)的多重PCR引物組反應(yīng)液管，1個(gè)裝有檢測2種致病病毒的特異基因位點(diǎn)的多重RT-PCR引物組反應(yīng)液管；左起第二排設(shè)有兩個(gè)限位孔，限位孔內(nèi)分別為酶反應(yīng)混合液管；左起第三排設(shè)有一個(gè)限位孔，限位孔內(nèi)為陰性對照品管；左起第四排設(shè)有兩個(gè)限位孔，限位孔內(nèi)分別為裝有19種致病細(xì)菌的核酸模板的陽性對照品管，和裝有2種致病病毒的核酸模板的陽性對照品管。

本實(shí)用新型具有以下的顯著技術(shù)效果：

本實(shí)用新型使用特殊設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增提取到的21種食源性致病微生物的致病基因片段，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測相關(guān)致病微生物的特征基因片段，從而就可以篩查出樣本中是否含有上述致病微生物。從結(jié)構(gòu)上來說，本實(shí)用新型所述的試劑盒優(yōu)點(diǎn)在于：首先在同一反應(yīng)體系中分別進(jìn)行19種細(xì)菌和2種病毒的2個(gè)多重反應(yīng)，多重PCR方法操作簡單快速，能同時(shí)檢測21種常見致病微生物；而普通的單一PCR分子生物學(xué)檢測技術(shù)在檢測時(shí)效性、操作簡便性和成本控制方面均差強(qiáng)人意。其次，本試劑盒中的陽性對照包含待測21種微生物的核酸模版，能監(jiān)控多重體系中每對引物的工作情況是否正常，避免實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的試劑盒中還設(shè)置了固定底座，并且在固定底座上設(shè)置凹槽，與試劑管的底部相匹配，通過該固定底座的設(shè)置可以更好的實(shí)現(xiàn)試劑管的穩(wěn)固放置。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的試劑盒通過將試劑管分為四排，根據(jù)功能分區(qū)，更清晰明了，操作簡單，不容易產(chǎn)生混淆。

附圖說明

圖1為21種食源性致病微生物多重PCR檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為圖1中固定底座的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為圖1中固定底座和盒體相結(jié)合的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本實(shí)用新型作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種21種食源性致病微生物多重PCR檢測試劑盒，如圖1、2和3所示，包括盒體1，盒蓋2，卡板3。

其中盒體1和盒蓋2一側(cè)相連，盒蓋2可以實(shí)現(xiàn)密封盒體1。

卡板3設(shè)置在盒體1的上部，設(shè)有七個(gè)限位孔，每個(gè)限位孔內(nèi)均設(shè)有試劑管。

其中左起第一排分別為裝有檢測19種致病細(xì)菌的特異基因位點(diǎn)的多重PCR引物組反應(yīng)液管4和裝有檢測2種致病病毒的特異基因位點(diǎn)的多重RT-PCR引物組反應(yīng)液管5。

其中19種致病細(xì)菌分別為結(jié)腸彎曲菌、空腸彎曲菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、出血性大腸桿菌、單核增生性李斯特菌、沙門氏菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌CTX型、霍亂弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-yst型、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-ail型；2種致病病毒為輪狀病毒和諾瓦克病毒。

左起第二排分別為第一酶反應(yīng)混合液管6和第二酶反應(yīng)混合液管7。

左起第三排為陰性對照品管8，陰性對照品管8內(nèi)含無菌去離子水。

左起第四排為第一陽性對照品管9和第二陽性對照品管10，其中第一陽性對照品管9中包括了19種致病細(xì)菌的核酸模板，第二陽性對照品管10包括了2種致病病毒的核酸模板。

本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，所述盒體1下部還設(shè)有固定底座11，所述固定底座11上設(shè)有與七個(gè)試劑管位置一致的凹槽12。

固定底座11材料為泡沫塑料，可將反應(yīng)液管和對照品管做很好的固定；不僅適用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測，也適用于檢測人員前往現(xiàn)場進(jìn)行檢測。

進(jìn)一步，于本發(fā)明的實(shí)施例中，所述凹槽12形狀為半球形，其形狀與試劑管的底部結(jié)構(gòu)形狀一致。通過設(shè)置凹槽12，與試劑管的底部相匹配，可以更好的實(shí)現(xiàn)試劑管的穩(wěn)固放置。

本實(shí)用新型中試劑管為1.5mL的離心管。該規(guī)格的試管可以大規(guī)模便捷地應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域。

優(yōu)選的，本實(shí)用新型的多重PCR引物組反應(yīng)液管中包含21組特殊設(shè)計(jì)的引物對，可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增提取到的(結(jié)腸彎曲菌、空腸彎曲菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、出血性大腸桿菌、單核增生性李斯特菌、沙門氏菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、霍亂弧菌CTX型、霍亂弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-yst型、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-ail型、輪狀病毒和諾瓦克病毒)21種食源性致病微生物的致病基因片段，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測相關(guān)致病微生物的特征基因片段，從而就可以篩查出樣本中是否含有上述21種致病微生物。

其中檢測空腸彎曲菌的引物(說明：以下引物對的核酸序列均為5端到3端的核酸序列)為：

上游引物：AATACTAGACTTACAAGGCGAAT

下游引物：AATCCTCACTTGCCATTAAAG

檢測結(jié)腸彎曲菌的引物為：

上游引物：CMTTTAGGAAGATCTTATGG

下游引物：TAAGCTGCCAAGCTCTTG

檢測阪崎腸桿菌的引物為：

上游引物：CAGAACGCCTTCTGGAAC

下游引物：CTTCGCCGATGATCCAGT

檢測大腸桿菌的引物為：

上游引物：TTGTTTGCCTCCCTGCTGC

下游引物：AAGCGTGGTGATGCTGC

檢測腸侵襲性大腸桿菌的引物為:

上游引物：

TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT

下游引物：GACTCTAGTTGTTGTTAATATCTCTAGCAGTACTATTAGCGC

檢測腸出血性大腸桿菌(EHEC)的引物為：

上游引物：CCCGTTCGGCACAAGCATAAGA

下游引物：CCCGGARCCGRCRCGCCAGRARRCG

檢測腸致病性大腸桿菌(EPEC)的引物為：

上游引物：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC

下游引物：GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC

檢測腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)的引物為：

上游引物：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG

下游引物：CACCAGACAATGTAACCTCTG

檢測出血性大腸桿菌(O157)的引物為：

上游引物：ACAGGTGAAGGTGGAATG

下游引物：CGCAGATATTTGTCATCCTA

檢測單核增生性李斯特菌的引物為：

上游引物：AGCATCTCCGCCTGCAAG

下游引物：AGTAACAGCTTTGCCGAAA

檢測沙門氏菌的引物為：

上游引物：CCGGKGAAATTATACCAT

下游引物：CTTTACCGGGCATACCAT

檢測志賀菌的引物為：

上游引物：TCACATGGAACAATCTCCG

下游引物：GTTTCTCTGCGAGCATGG

檢測金黃色葡萄球菌的引物為：

上游引物：CCTGAAGCAAGTGCATTTAC

下游引物：AGCATAAATATACGCTAAGC

檢測蠟樣芽孢桿菌的引物為：

上游引物：GTTGCGGATTTAAAAGTCATTG

下游引物：GCWGTTAAACCTTCACGA

檢測霍亂弧菌CTX型的引物為：

上游引物：CTGTAAAGATGCCAATATCTC

下游引物：CGATGCGTTAAACACRAAG

檢測霍亂弧菌OMPW型的引物為：

上游引物：CTGTAAAGATGCCAATATCTC

下游引物：CGATGCGTTAAACACRAAG

檢測副溶血弧菌的引物為：

上游引物：GCCCGCTTTCTTCAGACTCA

下游引物：TCATACGAGTGGTTGCTG

檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-yst型的引物為：

上游引物：ACCGCATAACGTCTTCGG

下游引物：GTAACGTCAATCACAAAGGT

檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌-ail型的引物為：

上游引物：ACCGCATAACGTCTTCGG

下游引物：GTAACGTCAATCACAAAGGT

檢測輪狀病毒的引物為：

上游引物：CTTTAAAAGAGAGATTTCCGTCTGG

下游引物：TCACATCATACAATTCTAATCTAAG

檢測諾瓦克病毒的引物為：

上游引物：CCYAGACAAGAGCCAATGTTC

下游引物：GACGYCATCTTCATTCACAAAK

實(shí)施例1

以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。

按照下列方式制備含病原菌DNA的待測樣品：

病原菌核酸提取和PCR體系構(gòu)建

從平板上挑取適量菌落，加入含有200μL的無菌去離子水的滅菌離心管中，震蕩混勻，菌懸液肉眼可見混濁即可。菌液煮沸10min，冷卻至室溫后，在13,000rpm下離心2min。將上清液移至新離心管中，即得到可用于本試劑盒檢測的細(xì)菌DNA模版。目前，也可以使用市售試劑盒(如北京天根生化或德國qigen品牌)提取病原菌DNA。按照比例制備20μL的PCR反應(yīng)體系，其中無菌去離子水4μL、2×Master Mix10μL、Primer Mix4μL、病原菌DNA2μL。

PCR反應(yīng)

在96孔梯度熱循環(huán)儀(杭州朗基)中進(jìn)行，具體的參數(shù)條件如下：

94℃預(yù)變性6min；94℃變性30sec，59℃復(fù)性30sec，72℃延伸30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

用1×TAE緩沖液配置成2％的瓊脂糖凝膠溶液，微波爐加熱使瓊脂糖完全溶解，加入1/20000體積的Dye Gene Green核酸染料(天根生化科技(北京)有限公司)，倒膠后取適量PCR產(chǎn)物(15μL)與6×LoadingBuffer混勻后，上樣分析。90V電壓下電泳30min后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照記錄，對照核酸產(chǎn)物的條帶大小來鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

實(shí)施例2

按照實(shí)施例1的要求進(jìn)行病原菌核酸提取和PCR體系構(gòu)建，PCR反應(yīng)；然后利用DW-800A多重食源性致病菌核酸檢測系統(tǒng)的QSEP全自動毛細(xì)管電泳模塊進(jìn)行全自動的凝膠分離、成像及自動化條帶分析。

實(shí)施例3

按照實(shí)施例1的要求進(jìn)行病原菌核酸提取，并按照本實(shí)用新型技術(shù)方案的介紹在美國ICUBATE4000平臺上構(gòu)建專用的多重PCR檢測卡盒，利用ICUBATE卡盒的多重、全自動、全封閉PCR反應(yīng)和檢測能力來進(jìn)行多重PCR體系自動構(gòu)建、擴(kuò)增和多重PCR產(chǎn)物檢測。

總之，以上所述僅為本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例，凡依本實(shí)用新型申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本實(shí)用新型專利的涵蓋范圍。