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一種雞脂質(zhì)代謝合成相關(guān)的脂肪酸合成酶基因熒光定量RT-PCR試劑盒的制作方法

文檔序號:11836046閱讀:501來源:國知局
一種雞脂質(zhì)代謝合成相關(guān)的脂肪酸合成酶基因熒光定量RT-PCR試劑盒的制作方法與工藝

本實用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及雞FASN基因表達熒光定量RT-PCR試劑盒及檢測方法,主要用于雞FASN基因表達調(diào)控和脂質(zhì)代謝相關(guān)的功能研究。



背景技術(shù):

脂質(zhì)代謝基因包括脂肪合成相關(guān)的基因,它能夠影響脂肪合成速率,進而影響脂肪組織的含量。因為雞生長速度快,腹部脂肪的大量沉積,所以雞被作為研究脂質(zhì)代謝、肥胖和生長機制的模式生物(Stern,2005;Lee et al.,2008)。脂肪生成主要在肝臟(Leveille et al.,1975),并牽涉到一系列糖酵解、檸檬酸循環(huán)、脂肪酸合成。脂肪酸合酶(Fattyacid synthase,F(xiàn)ASN)是細胞內(nèi)脂肪酸從頭合成途徑中的關(guān)鍵酶,在脂肪酸生物合成過程中將小分子碳單位聚合成長鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶,能夠調(diào)控內(nèi)源性脂肪酸的合成,其主要產(chǎn)物是軟脂酸,并且以甘油三酯的形式存儲能量。因此,研究FASN基因的表達調(diào)控對于理解脂質(zhì)代謝調(diào)控機理具有重要意義。

實時熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,與逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)相結(jié)合使定量極微量的基因表達成為可能,廣泛用于基因表達、基因功能等方面研究。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

為了解決以上技術(shù)問題,本實用新型提供一種雞FASN基因表達熒光定量RT-PCR檢測試劑盒,本實用新型試劑盒準(zhǔn)確性高、快速、價格低廉,通過建立實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測雞FASN基因表達的方法,為研究及FASN表達調(diào)控以及脂質(zhì)代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ),為優(yōu)質(zhì)雞育種提供理論依據(jù),具有潛在的應(yīng)用價值和社會效應(yīng)。

本實用新型的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的,一種雞脂質(zhì)代謝合成相關(guān)的脂肪酸合成酶基因熒光定量RT-PCR試劑盒,包括盒體、襯墊、SYBR Green Master熱啟動熒光PCR混合物、雞FASN基因表達的特異性正反向引物、雞內(nèi)參基因β-actin表達的特異性正反向引物、dNTP、滅菌DEPC水。

其中,雞FASN基因正反向引物序列為:

F:5’—CCATTGCACCAGCACTACTCA—3’,

R:5’—ACGAGGCTTAGGGTGTGGAA—3’;

以及雞內(nèi)參基因β-actin表達的特異性正反向引物序列為

F:5’—GTCCACCGCAAATGCTTCT—3’,

R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。

上述雞脂質(zhì)代謝合成相關(guān)的脂肪酸合成酶基因熒光定量RT-PCR試劑盒的使用方法如下:

(1)組織RNA的抽提與純化:從雞組織中提取總RNA并純化;

(2)cDNA第一鏈的合成:以步驟(1)中所提取的RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈;

(3)熒光定量real time PCR擴增反應(yīng):采用SYBR Green I燃料法,以上述(1)設(shè)計的FASN正反向引物和β-actin基因正反向引物和(2)合成的cDNA第一鏈為模板,在熒光定量PCR儀上進行;

(4)溶解曲線分析

步驟(4)反應(yīng)后的溶解曲線分析中,F(xiàn)ASN和β-actin基因均只有一個特異性峰,溶解溫度分布為90.5℃和91℃,則說明設(shè)計的FASN引物具有較好的特異性,可以用來FASN基因定量表達分析。

本實用新型所述步驟(3)和(4)中real time PCR擴增的反應(yīng)條件設(shè)置如下:

FASN:95℃預(yù)變性20-30s,然后40個循環(huán)的95℃變性20-30s,退火55-60℃20-30s,最后95℃變性10-15s,60℃1min,95℃10-15s,連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。

β-actin:95℃預(yù)變性20s,然后40個循環(huán)的95℃變性20-30s,退火56-59℃20-30s,最后95℃變性10-15s,60℃1min,95℃10-15s,連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。

雞各組織樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后,分別利用FASN和β-actin基因基因各自優(yōu)化好的條件進行real time PCR反應(yīng),每個樣品均做3個平行管,每次反應(yīng)均設(shè)無模板對照(NTC)。以β-actin基因為內(nèi)參照,對FASN基因mRNA表達水平進行校正,并采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行處理,其中ΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因),以一種組織,比如肝臟ΔCt作為其他組織的參照,計算相對表達量ΔΔCt,ΔΔCt=(ΔCtXgroup–ΔCt參照),以此來比較FASN基因表達量的倍數(shù)變化。

β-actin基因作為看家基因,在所有類型的細胞中都是穩(wěn)定表達的,其表達只收到啟動子序列或啟動子序列與RNA聚合酶相互作用影響,而不受其他機制調(diào)節(jié)。因此,其常被用做測定目標(biāo)基因表達量時的參照基因。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本實用新型具有以下有益效果:

第一,F(xiàn)ASN熒光定量RT-PCR試劑盒及其檢測方法,準(zhǔn)確性可靠、快速、特異性強、價格低廉,具有靈敏度高、自動化程度高,無污染、實時性好等優(yōu)點。

第二,脂肪酸合酶(Fattyacid synthase,F(xiàn)ASN)是細胞內(nèi)脂肪酸從頭合成途徑中的關(guān)鍵酶,在脂肪酸生物合成過程中將小分子碳單位聚合成長鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶,能夠調(diào)控內(nèi)源性脂肪酸的合成,并且以甘油三酯的形式存儲能量。因此,研究FASN基因的表達調(diào)控對于理解脂質(zhì)代謝調(diào)控機理具有重要意義。

第三,本研究通過建立實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測雞FASN基因表達的方法,為研究及FASN表達調(diào)控以及脂質(zhì)代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ),為優(yōu)質(zhì)雞育種提供理論依據(jù),具有潛在的應(yīng)用價值和社會效應(yīng)。

附圖說明

圖1是本實用新型β-actin和FASN基因的溶解曲線圖;

圖1中:前一個峰圖為β-actin基因的溶解曲線,后一個峰圖為FASN基因的溶解曲線;

圖2是本實用新型FASN基因在狼山雞公母雞不同組織中的差異表達量圖;(已經(jīng)修改)

圖2中:不同小寫字母表示FASN在不同組織中表達差異顯著(P<0.01or P<0.05);*表示FASN基因在公母雞的同一組織中表達量差異顯著(P<0.01or P<0.05)。

圖3是本實用新型雞脂質(zhì)代謝合成相關(guān)的脂肪酸合成酶基因熒光定量RT-PCR試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖;

圖3中:1盒體,2襯墊,3SYBR Green Master熱啟動熒光PCR混合物,4雞FASN基因表達的特異性正反向引物,5雞內(nèi)參基因β-actin表達的特異性正反向引物,6dNTP,7滅菌DEPC水。

具體實施方式

結(jié)合具體實施例和附圖對本實用新型作進一步說明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明目的,而不用于限制本實用新型范圍。

實施例:FASN基因在狼山雞公母雞不同組織中差異表達量分析

狼山雞是優(yōu)良的蛋肉兼用型雞種之一。以產(chǎn)蛋多、蛋體大,體肥健壯、肉質(zhì)鮮美而著稱,年產(chǎn)蛋量為200個左右,蛋重為58g左右,性成熟為180d。具有繁殖力強,適應(yīng)性廣,配套利用優(yōu)勢明顯等優(yōu)點,受到國內(nèi)外很多養(yǎng)殖戶的青睞。

利用常用的Trizol裂解法,從180日齡(產(chǎn)蛋高峰期)的狼山雞公母雞的下丘腦、肝臟、心臟、胸肌、腓腸肌、腹脂、鎖骨下脂肪、皮下脂肪中提取總RNA,以提取的總RNA為模板,按照RT-PCR試劑盒(Takara,Dalian,China)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

如圖3所示,一種雞FASN基因表達熒光定量試劑盒,包括盒體1、襯墊2、SYBR Green Master熱啟動熒光PCR混合物3、雞FASN基因表達的特異性正反向引物4、雞內(nèi)參基因β-actin表達的特異性正反向引物5、dNTP 6、滅菌DEPC水7。

檢測方法中FASN熒光定量RT-PCR條件的優(yōu)化:

(1)引物設(shè)計:根據(jù)GenBank上登錄的雞FASN和β-actin基因mRNA序列,利用Primer5.0和oligo6.0設(shè)計一種采用熒光定量RT-PCR檢測狼山雞FASN基因表達的特異性引物,經(jīng)過引物篩選與條件優(yōu)化,最終選擇出符合熒光定量PCR反應(yīng)特點的FASN基因特異性正反向引物F:5’—CCATTGCACCAGCACTACTCA—3’,

R:5’—ACGAGGCTTAGGGTGTGGAA—3’;以及作為內(nèi)參基因的雞β-actin基因特異性正反向引物F:5—GTCCACCGCAAATGCTTCTAA—3’,

R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。

(2)組織RNA的抽提與純化:從狼山雞組織中提取總RNA并純化;

(3)cDNA第一鏈的合成:以步驟(2)中所提取的RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈;

(4)熒光定量real time PCR擴增反應(yīng):采用SYBR Green I燃料法,以上述(1)設(shè)計的FASN正反向引物和β-actin基因正反向引物和(3)合成的cDNA第一鏈為模板,在ABI7500fast熒光定量PCR儀上進行。即狼山雞各組織樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后,分別利用FASN和β-actin基因各自優(yōu)化好的條件進行real-time PCR反應(yīng),每個樣品均做3個平行管,每次反應(yīng)均設(shè)無模板對照(NTC)。

熒光定量PCR擴增體系配制如下

real time PCR擴增的反應(yīng)條件設(shè)置如下:

FASN:95℃預(yù)變性20-30s,然后40個循環(huán)的95℃變性20-30s,退火55-60℃20-30s,最后95℃變性10-15s,60℃1min,95℃10-15s,連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。

β-actin:95℃預(yù)變性20s,然后40個循環(huán)的95℃變性20-30s,退火56-59℃20-30s,最后95℃變性10-15s,60℃1min,95℃10-15s,連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。

為檢測反應(yīng)的特異性,在real-time反應(yīng)后,進行溶解曲線分析,以確定得到的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。擴增溫度以0.5℃的增幅從60℃緩慢遞增到95℃,連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。結(jié)果顯示如圖1,F(xiàn)ASN和β-actin基因均只有一個特異性峰,溶解溫度分別為86℃和81℃。則設(shè)計的FASN引物有很好的特異性,可以進行FASN基因定量分析。

狼山雞FASN在不同組織中差異表達分析

狼山雞各組織樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后,分別利用FASN和β-actin基因基因各自優(yōu)化好的條件進行real time PCR反應(yīng),每個樣品均做3個平行管,每次反應(yīng)均設(shè)無模板對照(NTC)。以β-actin基因為內(nèi)參照,對FASN基因mRNA表達水平進行校正,并采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行處理,其中ΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因),以一種組織,比如肝臟ΔCt作為其他組織的參照,計算相對表達量ΔΔCt,ΔΔCt=(ΔCt(組織)–ΔCt(肝臟),以此來比較FASN基因相對表達量。結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出,F(xiàn)ASN基因表達在公母雞同一組織表達量有一定的差異。母雞FASN基因在肝臟、胸肌和下丘腦中表達量顯著高于公雞,在其他組織中公母雞FASN mRNA表達量無顯著差異。同時,F(xiàn)ASN基因表達具有一定的組織特異性,公雞FASN基因在下丘腦中表達量顯著高于胸肌和腹部脂肪中表達量,在其他組織中表達量差異不顯著。母雞FASN在肝臟中表達量顯著高于下丘腦、胸肌、腓腸肌和三種脂肪組織,F(xiàn)ASN基因在胸肌、腓腸肌和三種脂肪組織中表達量差異不顯著。說明狼山雞產(chǎn)蛋高峰期肝臟在脂質(zhì)代謝的脂肪合成過程中發(fā)揮重要作用。

本實用新型從實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測雞FASN基因表達的方法,為研究雞FASN表達調(diào)控以及脂質(zhì)代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ),為優(yōu)質(zhì)雞育種提供理論依據(jù),具有潛在的應(yīng)用價值和社會效應(yīng)。

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