本實用新型涉及生物傳感器技術領域，更為具體地說，涉及一種檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器。

背景技術：

鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)是一種常見的人畜共患病原菌，其致病機制與菌體的毒力島基因表達分泌的毒素和毒力蛋白有關。鼠傷寒沙門氏菌的毒力島基因為SSeC基因，SSeC基因位于毒力島-2(SPI-2)上，且序列十分保守，SSeC基因編碼表達的毒素蛋白能夠引起機體發(fā)生器官功能障礙等癥狀，因此SSeC基因可以作為檢測鼠傷寒沙門氏菌的一個重要標記物。

目前，鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法有傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測法、生化鑒定法，以分子生物學為基礎的快速檢測方法以及以免疫學為基礎的檢測技術，其中，以分子生物學為基礎的快速檢測方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)、基因芯片技術等，以免疫學為基礎的檢測技術包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、同位素標記抗體、免疫熒光法、免疫磁性分離技術、自動酶標免疫檢測儀等，上述檢測方法包含了微生物培養(yǎng)、核酸分析、抗原-抗體反應等技術。但是，微生物培養(yǎng)檢測法、生化鑒定法等傳統(tǒng)檢測方法存在耗時長、靈敏度低、檢測準確度低等的缺點；ELISA和PCR等方法雖然檢測速度快，但存在操作繁瑣、易被污染、對設備要求高等的缺點，而且檢測的特異性也不是很理想，無法滿足現(xiàn)代臨床和食品的快速檢測的要求。

為應對上述缺點，近年來，檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法出現(xiàn)了生物傳感器檢測法。生物傳感器由具有生物活性的識別原件和信號轉換器組成，生物活性物質通常包括酶、抗原-抗體、適配體等。由于生物傳感器具有高度自動化、微型化、能在復雜的體系中進行實時監(jiān)測等的功能，因而在制藥、食品、化工、生物醫(yī)學、臨床檢驗等方面帶來了巨大的經(jīng)濟效益和廣泛的應用前景。然而大多數(shù)的納米生物傳感器由于存在靈敏度低、特異性差、檢測范圍窄的缺點，限制了納米生物傳感器的大范圍使用。

技術實現(xiàn)要素：

本實用新型的目的是提供一種檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器，利用納米氧化石墨烯對單鏈DNA的吸附及熒光猝滅性構建熒光探針，進而實現(xiàn)對含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測，且靈敏度高、特異性好、檢測范圍寬。

為了解決上述技術問題，本實用新型提供如下技術方案：

一種檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器，所述生物傳感器包括氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針，其中，所述氧化石墨烯為載體，所述熒光標記的核酸探針位于所述氧化石墨烯的表面上，所述熒光標記的核酸探針為所述SSeC基因序列的互補鏈序列。

優(yōu)選地，所述熒光標記的核酸探針通過非共價鍵結合在所述氧化石墨烯的表面上。

優(yōu)選地，所述非共價鍵為π-π共價鍵。

優(yōu)選地，所述熒光標記的核酸探針的基因序列為6-FAM-GCCTCCTCTG CCATCTCATTCG。

一種檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器，所述生物傳感器包括氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針，其中，所述氧化石墨烯為載體，所述熒光標記的核酸探針位于所述氧化石墨烯的表面上，所述熒光標記的核酸探針為所述SSeC基因序列的互補鏈序列。本實用新型提供的檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器通過以氧化石墨烯為載體，基于氧化石墨烯的非共價偶聯(lián)核酸分子和猝滅熒光的特性，已熒光標記的核酸探針設置在氧化石墨烯的表面上，從而得到檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器。本實用新型提供的生物傳感器處于非檢測狀態(tài)時，由于氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針之間的距離很小，因此，生物傳感器中發(fā)生能量共振轉移，進而熒光猝滅；當生物傳感器處于檢測狀態(tài)時，即生物傳感器中加入待檢測樣品的單鏈DNA時，單鏈DNA會與熒光標記的核酸探針互補形成雙鏈DNA，從而雙鏈DNA從氧化石墨烯的表面游離下來，進而恢復熒光，通過檢測熒光值就能夠得知待檢測樣品中含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度。本實用新型提供的檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器具有操作簡單、檢測精確、檢測下限低、靈敏度高、特異性好的特點，且能夠定量檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度。

附圖說明

為了更清楚地說明本實用新型實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，對于本領域普通技術人員而言，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。

圖1是本實用新型實施例提供的檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器的結構示意圖；

圖2是本實用新型實施例提供的檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器 的氧化石墨烯與熒光標記的核酸探針的濃度優(yōu)化圖；

圖3是本實用新型實施例提供的檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器檢測待測樣品靈敏度的線性曲線圖；

圖4是本實用新型實施例提供的檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器檢測待測樣品時特異性的圖譜。

具體實施方式

本實用新型的目的是提供檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器，利用納米氧化石墨烯對單鏈DNA的吸附及熒光猝滅性構建熒光探針，進而實現(xiàn)對含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測。

為了使本技術領域的人員更好地理解本實用新型實施例中的技術方案，并使本實用新型實施例的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本實用新型實施例中的技術方案作進一步詳細的說明。

本實用新型提供了一種檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器，所述生物傳感器包括氧化石墨烯1(graphene oxide，GO)和熒光標記的核酸探針2(FAM-P)，其中，所述氧化石墨烯1為載體，所述熒光標記的核酸探針2位于所述氧化石墨烯1的表面上，所述熒光標記的核酸探針2為所述SSeC基因序列的互補鏈序列。

具體的，本實用新型提供的檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌納米生物傳感器簡稱為FAM-P/GO生物傳感器，GO1為納米材料，F(xiàn)AM-P2為羧基熒光素(carboxy-fluorescein，F(xiàn)AM)標記的核酸。附圖1示出了本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器的結構示意圖。本實用新型提供的FAM-P/GO生物傳感器包含有GO1和FAM-P2兩個部分，GO1為載體，F(xiàn)AM-P2分布在GO1的表面上，優(yōu)選地，F(xiàn)AM-P2均勻地分布在GO1的表面上。FAM-P2通過非共價鍵偶聯(lián)在GO1的表面上，其中，該非共價鍵為π-π共價鍵結合，即FAM-P2通過π-π共價鍵結合在GO1的表面上。

本實用新型提供的FAM-P/GO生物傳感器的檢測原理為：基于GO1的非共價偶聯(lián)核酸分子和猝滅熒光的特性，在GO1的表面引入FAM-P2。具體為：當FAM-P/GO生物傳感器處于非檢測狀態(tài)時，即沒有加入靶標DNA時，F(xiàn)AM-P2呈自由卷曲狀態(tài)，由于FAM-P2位于GO1的表面上，F(xiàn)AM-P2和GO1之間的距離很小，因此，F(xiàn)AM-P/GO生物傳感器中發(fā)生能量共振轉移，進而熒光猝滅，檢測不到熒光值；當FAM-P/GO生物傳感器處于檢測狀態(tài)時，即FAM-P/GO生物傳感器中加入待檢測樣品的單鏈DNA(single－stranded DNA,ssDNA)時，即加入靶標DNA時，靶標DNA的ssDNA會與FAM-P2互補形成雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)，由于形成dsDNA時的結合力大于GO1和FAM-P2之間的非共價鍵力，因此，dsDNA能夠從GO1的表面游離下來，進而恢復熒光，最后通過檢測熒光值就能夠得知待檢測樣品中含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度，檢測精確，操作簡單。

基于上述原理，加入的靶標DNA越多，形成的雙鏈也就越多，熒光回復也就越強，進而能夠定量檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度，同時，本實用新型提供的FAM-P/GO生物傳感器還具有檢測下限低、靈敏度高的特點。

進一步，SSeC基因序列為5’-CGAATGAGATGGCAGAGGAGGC-3’，由于FAM-P的基因序列為SSeC基因序列的互補鏈序列，則FAM-P的基因序列為6-FAM-GCCTCCTCTGCCATCTCATTCG。

由于熒光共振能量轉移受納米材料GO1和FAM-P2比例的影響很大，同時，為使本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器具有靈敏的檢測性能及檢測極低濃度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的性能，本實用新型實施例提供了FAM-P/GO生物傳感器供受比例優(yōu)化的研究，即研究GO1的表面上設置多少FAM-P2時，F(xiàn)AM-P/GO生物傳感器具有最優(yōu)的效益，具體研究內(nèi)容為：

設定FAM-P/GO生物傳感器體系中FAM-P2溶液的濃度恒定為50nM，考察GO1溶液濃度分別為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL時的熒光值。具體實施過程為：在一定體積的FAM-P2溶液中分別加入超聲處理后的不同濃度的GO1溶液形成混合液，上述混合液在溫度為95℃的條件下變性處理5min，并用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋至100ul形成復合溶液，該復合溶液充分混合并在37℃下靜置15min，檢測各熒光值。在進行熒光值檢測時，設置激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長517nm，測定復合溶液熒光值F和原始熒光值F₀,通過GO1溶液濃度與熒光相對值F/F₀-1之間的關系得知FAM-P2溶液的濃度為50nM時，與FAM-P2相配合的GO1溶液的最佳濃度，具體請參考附圖2。

附圖2示出了本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器體系中FAM-P2與GO1的濃度優(yōu)化圖。從附圖2中能夠看出，隨著GO1濃度的不斷增大，F(xiàn)AM-P/GO生物傳感器體系的熒光相對值F/F₀-1不斷升高，這表明隨著GO1濃度的增大熒光值呈顯著下降的趨勢，當GO1濃度達到0.05mg/mL及以上時，熒光相對值F/F₀-1幾乎不變且接近于1.0，而且超過95％的FAM-P2的熒光被GO1猝滅，由此能夠表明FAM-P/GO生物傳感器體系中FAM-P2已經(jīng)完全結合到GO1表面，溶液中不存在游離的FAM-P2，背景值低，此時，F(xiàn)AM-P2溶液的濃度為50nM，與FAM-P2相配合的GO1溶液的最佳濃度為0.05mg/mL。

本實用新型實施例還提供了FAM-P/GO生物傳感器檢測待測樣品靈敏度的實驗研究， 具體內(nèi)容為：將鼠傷寒沙門氏菌在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)24h，經(jīng)平板計數(shù)后，制備濃度分別為10³CFU/mL、10⁴CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL和10⁸CFU/mL的菌體，將上述不同濃度的菌體放置于95℃的水浴中15min，然后放置冰上10min以獲取相應的ssDNA，將所獲得的ssDNA分別加入配置好的FAM-P/GO生物傳感器體系中，在溫度為37℃的條件下孵育30min，最后分別檢測各體系的熒光值，并根據(jù)所測得的各體系的熒光值與菌體濃度的對數(shù)繪制線性曲線，線性曲線結果具體請參考附圖3。

附圖3示出了本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器檢測待測樣品靈敏度的線性曲線圖。從附圖3中能夠得知，隨著菌體濃度的不斷增大，熒光值顯著增大，且在上述濃度范圍內(nèi)熒光值與菌體濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系，熒光值與菌體濃度的對數(shù)的線性方程為Y＝29.192X-45.239，線性相關系數(shù)為0.9987，由此能夠說明，F(xiàn)AM-P/GO生物傳感器體系能夠檢測到菌體的下限為10³CFU/mL，進而說明本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器在檢測待檢樣品時具有很高的靈敏度，且能夠檢測到較低濃度的菌體。

進一步，本實用新型實施例還提供了FAM-P/GO生物傳感器檢測待測樣品特異性的實驗研究，具體研究內(nèi)容為：將20種不同菌體的ssDNA，均配置成濃度為5×10⁷CFU/ml的溶液，其中，20種不同菌體為1-鼠傷寒沙門氏菌；2-甲型副傷寒沙門氏菌；3-腸炎沙門菌；4-豬霍亂沙門氏菌；5-志賀氏菌；6-金黃色葡萄球菌；7-大腸桿菌K88；8-變形桿菌；9-副溶血性弧菌；10-溶血性弧菌；11-李斯特菌；12-空腸彎曲菌；13-嗜熱鏈球菌；14-枯草桿菌；15-地衣芽孢桿菌；16-嗜熱雙歧桿菌；17-長雙歧桿菌；18-短雙歧桿菌19-嗜酸乳桿菌、20-干酪乳桿菌，上述菌體均可以采用外購菌體。設置不加菌體的ssDNA為空白組，即為圖4中的21組，將空白組與上述20種不同菌體的ssDNA分別加入配置好的FAM-P/GO生物傳感器體系中，在溫度為37℃的條件下孵育30min，然后分別測量熒光值，并以各菌體的排列為橫坐標、熒光值為縱坐標繪制特異性圖譜，具體結果請參考附圖4。

附圖4示出了本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器檢測待測樣品時特異性的圖譜。從附圖4中能夠得知，1號菌體的熒光值顯著增加且明顯高于其余20組菌體的熒光值，2-4號的其余種類的沙門氏菌由于其序列存在一定的同源性而產(chǎn)生部分熒光，但其熒光值遠遠低于1號菌體的熒光值，其他種類的菌體及空白組的熒光值更低，由此能夠說明，本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器在檢測待檢樣品時具有很好的特異性。

由上述檢測內(nèi)容及描述能夠得知，本實用新型實施例提供的FAM-P/GO生物傳感器具有檢測下限低、靈敏度高、特異性好的特點，且能夠定量檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門 氏菌的濃度。

雖然已經(jīng)以具體實施例的方式描述了本實用新型，但是對于本領域技術人員來說，在不脫離所附權利要求書所限定的本實用新型的精神和范圍的情況下，可以對本實用新型進行各種變化和修改，這些變化和修改同樣包括在本實用新型的范圍內(nèi)。