本實用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬惡性高熱病的基因檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

馬惡性高熱病(Equine malignant hyperthermia,EMH)是一種由鹵化麻醉劑、去極化肌肉松弛劑和應(yīng)激等引起的骨骼肌紊亂，馬惡性高熱病與蘭尼定受體1的突變相關(guān)，是蘭尼定受體1基因(GenBank登錄號AY375484)在外顯子46發(fā)生的單堿基錯義突變(C7360G)引起的基酸替換R2454G進而引起的疾病。

目前未見馬惡性高熱病的成熟高效的商用檢測試劑盒的報道。對于點突變引起的單基因遺傳病的檢測技術(shù)來說，涉及到DNA測序或芯片的技術(shù)都比較貴，涉及到熒光、生物素、磁珠的技術(shù)也都成本較高?，F(xiàn)有技術(shù)中存在著快速，簡單，高效，低成本地檢測馬惡性高熱病的需求。這對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本實用新型提供一種馬惡性高熱病的基因檢測試劑盒，用于方便、快速、低成本地檢測馬惡性高熱病蘭尼定受體1基因的單堿基錯義突變C7360G。本實用新型是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本實用新型提供的一種馬惡性高熱病的基因檢測試劑盒，包括包裝盒體，包裝盒體內(nèi)設(shè)有含有用于盛放正向引物的試劑瓶，用于盛放反向引物的試劑瓶和用于盛放突變型正向引物的試劑瓶。

包裝盒體是任何可以容納并保存試劑瓶的裝置或容器。

包裝盒體可以是方便容納試劑瓶的任何形狀，其可以是長方體、正方體、球狀或橢球狀，其水平截面可以是多邊形，圓形，橢圓形或花瓣形。

包裝盒體可以是木質(zhì)的、紙質(zhì)的、塑料的、陶瓷的或金屬的。

包裝盒體的盒蓋與盒本體可以是一體成型的，可選地，是紙盒或塑料盒，盒蓋與盒體依靠紙板或塑料板的可折疊性支持開閉。

包裝盒體的盒蓋與盒本體可以通過轉(zhuǎn)軸連接。

包裝盒體是透明的、半透明的或不透明的。

包裝盒體關(guān)閉狀態(tài)可以是氣密的和/或防水的。

包裝盒體內(nèi)側(cè)壁和/或底壁可貼有防震動緩沖層，可選地，該緩沖層是一層海綿或橡膠。

各個試劑瓶相同或不同。

任一試劑瓶可以是透明的、半透明的或不透明的；

任一試劑瓶可以是帶有可插拔的橡膠塞或軟木塞的玻璃、塑料或金屬試管；

任一試劑瓶可以是瓶與瓶蓋配合的容器，其中瓶蓋是塞入瓶的，或瓶蓋是靠旋轉(zhuǎn)擰在瓶上的。

任一試劑瓶可以是安剖瓶、青霉素瓶。

任一試劑瓶表面有可以寫字的標(biāo)簽。

正向引物序列為：5’-ATCTAATCCAAGCCGGC。

反向引物序列為：5’-CAGAGGGAGGCTGATGA。

突變型正向引物序列為：5’-CCGAAGCTCTGAGGATCC。

可選地，包裝盒體內(nèi)設(shè)有盛放野生型反向引物的試劑瓶。

野生型反向引物序列為：5’-CGAGCGCAGGATGGCGCC

可選地，包裝盒體內(nèi)設(shè)有盛放雙鏈DNA參照序列的試劑瓶。

放雙鏈DNA參照序列長度為70bp。

可選地，包裝盒體內(nèi)設(shè)有盛放內(nèi)參照序列的正向引物的試劑瓶和盛放內(nèi)參照序列的反向引物的試劑瓶。

內(nèi)參照序列的正向引物為：5’-GCTCACTCTCCTCTCCC。

內(nèi)參照序列的反向引物為：5’-GAAGTGGGGGAAGTAGG。

或者：

內(nèi)參照序列的正向引物為：5’-TCAAGGAGCAGCTCAA。

內(nèi)參照序列的反向引物為：5’-GCAGAGGCGATTGCCG。

可選地，包裝盒體內(nèi)還設(shè)有用于PCR反應(yīng)的試劑瓶組。

其中，試劑瓶組9包括：用于盛放PCR緩沖液的試劑瓶、用于盛放MgCl₂的試劑瓶、用于盛放dNTPs的試劑瓶、用于盛放Taq酶的試劑瓶、用于盛放超純水的試劑瓶。

可選地，包裝盒體內(nèi)還設(shè)有用于DNA電泳的試劑瓶組。

其中，用于DNA電泳的試劑瓶組包括：用于盛放瓊脂糖的試劑瓶。用于盛放TBE緩沖液的試劑瓶。

可選地，包裝盒體內(nèi)還設(shè)有保溫隔層。

保溫隔層是任何可以延緩包裝盒體內(nèi)外熱交換的結(jié)構(gòu)。

可選地，保溫隔層是泡沫材料制成的。

可選地，保溫隔層是雙層不銹鋼結(jié)構(gòu)。

可選地，保溫隔層是雙層玻璃結(jié)構(gòu)。

可選地，保溫隔層與包裝盒體是一體成型的。

可選地，包裝盒體內(nèi)還設(shè)有儲冷劑包。

可選地，儲冷劑包是內(nèi)置冰塊的塑料袋子。

可選地，包裝盒體內(nèi)還設(shè)有樣品收集試劑瓶。

樣品收集試劑瓶可以與其他試劑瓶相同或不相同。

樣品收集試劑瓶內(nèi)可裝有生理鹽水、含有肝素的生理鹽水或含有青霉素的生理鹽水。

可選地，包裝盒體內(nèi)還設(shè)有試劑盒使用說明書。

本實用新型的有益效果主要有：該試劑盒架構(gòu)簡單，操作方便，通過選擇試劑盒中的試劑瓶并配合常規(guī)的PCR儀與電泳儀及其必要的耗材與試劑，可以簡單、快速、低成本地應(yīng)用于馬惡心高熱病的基因檢測，包括對突變型的檢測以及鑒別檢測。通過簡單地通過肉眼觀察電泳圖譜，就可以判斷所測試馬的該病的基因型。另一個效果是，本試劑盒測試的電泳圖譜中，不同的目標(biāo)擴增條帶之間的干擾降到很低，對檢測目的來說，可以認(rèn)為不存在這種干擾。

附圖說明

圖1為實施例1的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為實施例1的測試原理示意圖。

圖3為實施例2的測試原理示意圖。

具體實施方式

為了更直觀更清楚地描述本實用新型技術(shù)方案，以及幫助理解本實用新型對現(xiàn)有技術(shù)的貢獻之處，以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型進行詳細(xì)地說明。

實施例1

圖1為本實用新型提供的一種馬惡性高熱病的基因檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，包括包裝盒體1，包裝盒體1內(nèi)設(shè)有含有用于盛放正向引物的試劑瓶2，用于盛放反向引物的試劑瓶3和用于盛放突變型正向引物的試劑瓶4。

包裝盒體1是任何可以容納并保存試劑瓶的裝置或容器。

包裝盒體1可以是方便容納試劑瓶的任何形狀，其可以是長方體、正方體、球狀或橢球狀，其水平截面可以是多邊形，圓形，橢圓形或花瓣形。

包裝盒體1可以是木質(zhì)的、紙質(zhì)的、塑料的、陶瓷的或金屬的。

包裝盒體1的盒蓋與盒本體可以是一體成型的，可選地，是紙盒或塑料盒，盒蓋與盒體依靠紙板或塑料板的可折疊性支持開閉。

包裝盒體1的盒蓋與盒本體可以通過轉(zhuǎn)軸連接。

包裝盒體1是透明的、半透明的或不透明的。

包裝盒體1關(guān)閉狀態(tài)可以是氣密的和/或防水的。

包裝盒體1內(nèi)側(cè)壁和/或底壁可貼有防震動緩沖層，可選地，該緩沖層是一層海綿或橡膠。

各個試劑瓶相同或不同。

任一試劑瓶可以是透明的、半透明的或不透明的；

任一試劑瓶可以是帶有可插拔的橡膠塞或軟木塞的玻璃、塑料或金屬試管；

任一試劑瓶可以是瓶與瓶蓋配合的容器，其中瓶蓋是塞入瓶的，或瓶蓋是靠旋轉(zhuǎn)擰在瓶上的。

任一試劑瓶可以是安剖瓶、青霉素瓶。

任一試劑瓶表面有可以寫字的標(biāo)簽。

該試劑盒的測試步驟的原理如下：

步驟1：采集血清等包含全基因組的生物材料；

步驟2：采取任何常規(guī)的技術(shù)手段提取樣本的基因組DNA；

步驟3：參照圖2的示意圖，對所用引物做如下設(shè)計：其中，平行線代表待檢測的基因組的一部分，粗線代表正義鏈，細(xì)線代表反義鏈，三角形所在O點代表待檢測是否突變的位點。以O(shè)點上游A點為起點設(shè)計正向引物p1(盛放于試劑瓶2)；以O(shè)點下游B點為起點設(shè)計反向引物p2(盛放于試劑瓶3)；設(shè)計引物p3(盛放于試劑瓶4)，p3與反義鏈互補，其3’端對應(yīng)于可變位點O，且對應(yīng)待檢突變型的堿基，p3的5’端位置為C，p3的5’端包含一個或更多個與互補鏈不互補的堿基(下稱末端保護堿基)，如星號所示。使用上述三個引物，采用分子生物學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的PCR儀器與試劑對上述基因組DNA進行PCR反應(yīng)。

步驟4：將上述PCR產(chǎn)物進行常規(guī)DNA電泳，例如瓊脂糖凝膠電泳。

步驟5：采取任何常規(guī)手段，觀察、讀取和/或記錄相應(yīng)的凝膠圖像。

實施例1的核心構(gòu)思與結(jié)果判斷：

當(dāng)O點為野生型時，PCR產(chǎn)物為一條AB之間長度的片段；

鑒于p3的5’端與互補鏈不互補，p2與p3的PCR產(chǎn)物中P2的延長鏈側(cè)不會與p1參與進一步的擴增反應(yīng)，所以，當(dāng)O點為突變型時，產(chǎn)物包括AB和CB對應(yīng)的兩個產(chǎn)物。

p3的5’端包括末端保護堿基，保證了CB之間擴增產(chǎn)物不會被延長，這就實現(xiàn)了在一個電泳泳道中對一次PCR產(chǎn)物進行判斷，即，一個條帶則推斷樣本為野生型，兩個條帶則推斷樣本為突變型。

因此，用該試劑盒配合常規(guī)儀器和試劑，可以最大限度地簡化馬惡性高熱病的基因測試程序和降低成本。

P3的方向是可以變化的，當(dāng)p3與上述定義的正義鏈互補，其3’端對應(yīng)于可變位點O，且對應(yīng)待檢突變型的堿基，p3的5’端也包括末端保護堿基，整個方案可以使試劑盒達到相同的技術(shù)效果。為了方面統(tǒng)一說明本實用新型中試劑盒的檢測原理，下文一律不提該方式，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以知道，兩種方式是等價的。

該試劑盒的測試步驟如下：

步驟一：采集馬血清。

步驟二：使用GIGMA-ALDRICH公司的GenElute^TM血液基因組DNA試劑盒提取馬血清的基因組DNA。

步驟三：蘭尼定受體1基因(參考GenBank登錄號AY375484)第56外顯子的序列如下：

5’CTGTGCGCCA GAGATGCATC TAATCCAAGC CGGCAAAGGC GAAGCTCTGAGGATCGCGC CATCCTGCGC TCCCTCGTGC CCCTGGACGA CCTCGTGGGCATCATCAGCC TCCCTCTGCA GATCCCCACC CTGGGCAAAG

其中，方框所示位點野生型為C，導(dǎo)致馬惡性高熱病的序列中該位點為G。

根據(jù)上述對引物的定義：

P1序列為：5’-ATCTAATCCAAGCCGGC。

P2序列為：5’-CAGAGGGAGGCTGATGA。

P3序列為：5’-CCGAAGCTCTGAGGATCC。

根據(jù)上文的定義：AB的長度是101bp，CB的長度是80bp。

按照常規(guī)方法，在PCR反應(yīng)管中添加引物P1、P2和P3共50pmol，2μg模板DNA,10μl 10×PCR緩沖液、1.5nnol/LMgCl₂，各200μmol/L dNTPs，2.5u Taq酶，加超純水至總體積100μl。

反應(yīng)條件：37℃啟動15分鐘，然后94℃所述的變性15秒鐘，53℃退火30秒鐘，72℃延伸15秒鐘，38個循環(huán)，然后72℃保持10分鐘。

步驟四：用2％瓊脂糖，在0.5×TBE緩沖液下，在加樣孔中加入EB和PCR產(chǎn)物，進行電泳。

步驟五：對電泳凝膠在紫外光下拍照。根據(jù)凝膠圖譜來判斷該蘭尼定受體1基因是否發(fā)生了C7360G突變。

根據(jù)一次PCR和一次電泳來判斷基因型，這使檢測時間短，成本低。

實施例2

如圖2所示，在實施例1的基礎(chǔ)上，包裝盒體1內(nèi)設(shè)有盛放野生型反向引物的試劑瓶(5)。

該試劑盒的測試步驟的原理如下：

其測試中相對于實施例1的差別在于：步驟3中還包括引物p4(盛放于試劑瓶5)，p4與正義鏈互補，其3’端對應(yīng)于可變位點O，且對應(yīng)待檢野生型的堿基，p4的5’端位置為D，其包含一個或更多個與互補鏈不互補的堿基，如星號所示。

步驟4中，在同一塊凝膠的另一泳道中添加DNA分子量標(biāo)記(Marker)。

實施例2的核心構(gòu)思與結(jié)果判斷：

參照對實施例1的說明，當(dāng)O點為野生型時，電泳結(jié)果包括AB、AD；當(dāng)O點為突變型時，電泳結(jié)果為AB、CB；當(dāng)O點為雜合型時，電泳結(jié)果為AB、CB、AD。在此，要求AD與CB之間長度有差別，差別達到在同一個泳道中可以明顯區(qū)別的程度。借助DNA分子量標(biāo)記，則可以判斷出樣品該位點的基因型組成。

實施例2的試劑盒的應(yīng)用，可以在一次PCR和一次凝膠電泳就區(qū)分出樣品的基因型，而一塊凝膠中還可以并行測試多個樣品。

該試劑盒的測試步驟如下：

根據(jù)上述對引物的定義：

P4序列為：5’-CGAGCGCAGGATGGCGCC。

根據(jù)上文的定義：

AD的長度是56bp。

與實施例1中試劑盒的測試步驟相比，差別在于PCR反應(yīng)體系中多了上述引物P4，另外在電泳的同一塊凝膠中添加DNA分子量標(biāo)記。

則對于野生型，電泳結(jié)果呈現(xiàn)101bp和56bp兩個條帶。對于突變型，電泳結(jié)果呈現(xiàn)101bp和80bp兩個條帶。對于雜合型，電泳結(jié)果呈現(xiàn)101bp、80bp和56bp三個個條帶。

這就很方便用同一個電泳泳道的結(jié)果來判斷樣品的基因型。

實施例3

在實施例2的基礎(chǔ)上，所述包裝盒體1內(nèi)設(shè)有盛放雙鏈DNA參照序列的試劑瓶6。

該試劑盒的測試步驟的原理如下：

其測試中相對于實施例2的差別在于：不使用DNA分子量標(biāo)記；在PCR產(chǎn)物中添加長度介于AD與CB之間的雙鏈DNA參照序列(盛放于試劑瓶6)，要求此三者在同一泳道中電泳時能夠區(qū)分電泳結(jié)果的邊界，且雙鏈DNA參照序列的含量明顯大約AD與CB中的任一個。

實施例3的核心構(gòu)思與結(jié)果判斷：

對于雜合子，電泳結(jié)果中包含四個條帶；對于純合子則有三個條帶，而根據(jù)遷移率較大條帶與高亮度雙鏈DNA參照序列的相對位置則可以判斷其為野生型或突變型。例如，AD大于CB，則相對于高亮度的雙鏈DNA參照序列的條帶，遷移率較大的條帶比該條帶大則其為CB，判斷樣品為突變體，遷移率較大的條帶比該條帶小則其為AD，判斷樣品為野生型。

這在實施例2的基礎(chǔ)上，進一步省去了DNA分子量標(biāo)記的使用，使該試劑盒的使用更加方便，而且所有參與電泳的DNA在同一個泳道中進行電泳，結(jié)果更加清晰。

該試劑盒的測試步驟如下：

對于實施例3的電泳結(jié)果，突變型和野生型均呈現(xiàn)兩個電泳條帶，要想?yún)^(qū)分該兩種情況，就需要通過DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)來判斷遷移率較大的條帶是80bp和56bp中的那一條。

在電泳混合物中添加長度70bp，相對其他產(chǎn)物過量的雙鏈DNA。

因此，可以通過判斷遷移率較大的片段位于高亮條帶的上游還是下游來判斷對應(yīng)的基因型。

作為該方案的一種變體，可以不約束雙鏈DNA參照序列的用量。而是在一個泳道中電泳PCR混合物，在其相鄰泳道電泳雙鏈DNA參照序列，這就不需要控制雙鏈DNA參照序列與PCR產(chǎn)物的相對含量。

實施例4

在實施例2的基礎(chǔ)上，包裝盒體1內(nèi)設(shè)有盛放內(nèi)參照序列的正向引物的試劑瓶7和盛放內(nèi)參照序列的反向引物的試劑瓶8。

該試劑盒的測試步驟的原理如下：

實施例4的測試原理如下：其測試中相對于實施例2的差別在于：不使用DNA分子量標(biāo)記；以同一基因組中的多拷貝少或無回文的DNA序列為模板，在其正向引物p5(盛放于試劑瓶7)和反向引物p6(盛放于試劑瓶8)的作用下形成了PCR產(chǎn)物，該PCR產(chǎn)物長度介于AD與CB之間的，要求此三者在同一泳道中電泳時能夠區(qū)分電泳結(jié)果的邊界。

實施例4的核心構(gòu)思與結(jié)果判斷：

由于該模板DNA序列是多拷貝的，所以PCR產(chǎn)物雙鏈DNA內(nèi)參照序列的含量明顯大于AD與CB中的任一個。

實施例4與實施例3相似，二者的區(qū)別在于前者是在電泳樣品中添加的對照序列，后者是在一個PCR體系中生成的對照序列。

這樣，可以充分地用一次PCR產(chǎn)物和一次電泳來為基因進行分型檢測。

測試步驟如下：

根據(jù)馬α珠蛋白基因(GenBank登錄號AH001203)設(shè)計如下上游引物和下游引物

正向引物p5：5’-GCTCACTCTCCTCTCCC。

反向引物p6：5’-GAAGTGGGGGAAGTAGG。

在PCR反應(yīng)體系中加入上述引物對p5和p6，則它們對應(yīng)的擴增產(chǎn)物長度為68bp，且由于α珠蛋白基因是多拷貝基因，該產(chǎn)物的豐度(條帶亮度)會大于AD及CB。該方案可以實現(xiàn)測試目的。

作為一種變體，首先假設(shè)CB長度大于AD且小于AD的二倍，上游引物p7(盛放于試劑瓶7)與下游引物p8(盛放于試劑瓶8)位于同一個基因的A或B外側(cè)，且p7與p8的產(chǎn)物長度等于AD，且以保證p7與p8的產(chǎn)物與AB分子數(shù)量差不多。這樣，基因型為野生型時，電泳為兩條帶，遷移率較大的為p7與p8的產(chǎn)物和AD的混合物。如果是突變型，則遷移率由小到大的順序為：AB、CB、p7與p8的產(chǎn)物，且三者豐度差不多，CB長度大于p7與p8的產(chǎn)物，所以對應(yīng)條帶略亮。如果是雜合型，則遷移率由小到大的順序為：AB、CB、p7與p8的產(chǎn)物與AD的混合物，則遷移率最大的條帶的亮度應(yīng)該大于遷移率中間的。

根據(jù)蘭尼定受體1基因第二外顯子(GenBank登錄號AY375476)：

上游引物p7：5’-TCAAGGAGCAGCTCAA。

下游引物p8：5’-GCAGAGGCGATTGCCG。

在PCR反應(yīng)體系中加入上述引物對p7和p8，則它們對應(yīng)的擴增產(chǎn)物長度為56bp的條帶，該方案可以實現(xiàn)測試目的。

實施例5

在實施例1-4中任一個的基礎(chǔ)上，包裝盒體(1)內(nèi)還設(shè)有用于PCR反應(yīng)的試劑瓶組9。

其中，試劑瓶組9包括：用于盛放PCR緩沖液的試劑瓶、用于盛放MgCl₂的試劑瓶、用于盛放dNTPs的試劑瓶、用于盛放Taq酶的試劑瓶、用于盛放超純水的試劑瓶。

實施例6

在實施例1-5中任一個的基礎(chǔ)上，包裝盒體(1)內(nèi)還設(shè)有用于DNA電泳的試劑瓶組10。

其中，用于DNA電泳的試劑瓶組10包括：用于盛放瓊脂糖的試劑瓶。用于盛放TBE緩沖液的試劑瓶。

實施例7

在實施例1-6中任一個的基礎(chǔ)上，包裝盒體1內(nèi)還設(shè)有保溫隔層11。

保溫隔層11是任何可以延緩包裝盒體1內(nèi)外熱交換的結(jié)構(gòu)。

可選地，保溫隔層11是泡沫材料制成的。

可選地，保溫隔層11是雙層不銹鋼結(jié)構(gòu)。

可選地，保溫隔層11是雙層玻璃結(jié)構(gòu)。

可選地，保溫隔層11與包裝盒體1是一體成型的。

保溫隔層11可以延緩包裝盒體1內(nèi)外熱交換，以便在交通運輸過程中包裝盒體1內(nèi)部保持低溫，起到避免酶失活的作用。

實施例8

在實施例1-7中任一個的基礎(chǔ)上，包裝盒體1內(nèi)還設(shè)有儲冷劑包12。

可選地，儲冷劑包12是內(nèi)置冰塊的塑料袋子。

儲冷劑包的存在，能夠使試劑盒保持低溫的時間大大延長，延緩酶的活性喪失。

實施例9

在實施例1-8中任一個的基礎(chǔ)上，包裝盒體(1)內(nèi)還設(shè)有樣品收集試劑瓶13。

樣品收集試劑瓶13可以與其他試劑瓶相同或不相同。

在采集樣品和實驗室距離較遠(yuǎn)時，用樣品收集試劑瓶13容納待測樣品，可以起到避免或減少污染的作用，另外，在存在保溫隔層11和/或儲冷劑包12時，還可起到低溫運輸樣品的作用。

樣品收集試劑瓶13內(nèi)可裝有生理鹽水、含有肝素的生理鹽水或含有青霉素的生理鹽水。

實施例10

在實施例1-9中任一個的基礎(chǔ)上，包裝盒體1內(nèi)還設(shè)有試劑盒使用說明書14。

試劑盒的使用說明書14中詳細(xì)記載了本實用新型所要求保護的試劑盒的測試原理和使用方法，以方便用戶使用。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本實用新型作了詳盡的描述，但在本實用新型基礎(chǔ)上，可以對其構(gòu)思作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本實用新型精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均落入本實用新型要求保護的范圍。