本實用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中目的蛋白的富集分離領(lǐng)域，具體涉及一種能從少量樣品中獲取內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的裝置。

背景技術(shù)：

人類基因組中約含有1500個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，是人類基因組編碼的第二大類蛋白，根據(jù)結(jié)合域的不同可以分為50個家族。轉(zhuǎn)錄因子幾乎參與所有生物過程的調(diào)控，包括發(fā)育、分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。因此，對轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的研究一直受到極大關(guān)注。

轉(zhuǎn)錄因子在細胞內(nèi)的表達豐度極低(僅占細胞總蛋白的0.01-0.001％)，用傳統(tǒng)方法在蛋白質(zhì)組水平上分析轉(zhuǎn)錄因子表達譜非常困難。通過傳統(tǒng)色譜方法進行轉(zhuǎn)錄因子的純化通常需要抽提成百升細胞培養(yǎng)物，通過10,000-100,000倍的富集得到的蛋白也僅夠用于化學(xué)和功能的分析。

可利用轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列(concatenated transcription factor response elements，catTFRE)實現(xiàn)對樣品中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的有效富集，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對轉(zhuǎn)錄因子進行鑒定和定量。已有方法(專利公開號：ZL 2011 1 0457108.X)可以獲得轉(zhuǎn)錄因子和DNA的結(jié)合活性，對轉(zhuǎn)錄因子表達譜研究十分有效，但是該方法需要毫克級細胞核蛋白提取物進行富集，時間至少需要兩天，而且不能夠進行高通量操作,從而限制了應(yīng)用范圍和檢測效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型目的在于提供一種用于快速富集樣品中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物、適用高通量操作的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子富集柱，簡稱TOT柱。

本實用新型所提供的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子富集柱，簡稱TOT柱(英文TFRE on tips的縮寫)，其包括長錐形吸頭，吸頭尾端開有小孔，內(nèi)部設(shè)有膜層將尾端小孔封閉，吸頭中裝填有已連接有轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列的磁珠；該富集柱還包括套裝并固定吸頭的柱錐形離心管，離心管小頭端封閉，大頭端敞口，吸頭尾端與離心管封閉端有一距離。離心管容積最好為1.5mL以配合離心機使用。

優(yōu)選的，該內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子富集柱還包括套管，由內(nèi)向外所述吸頭、套管和離心管依次套裝并固定，套管與吸頭和離心管形狀和尺寸相匹配。其中：

套管大頭端敞口并設(shè)有固定臺階，固定臺階外徑與離心管大頭端內(nèi)徑匹配；套管 小頭端設(shè)有開孔，開孔尺寸與錐形吸頭中部外徑匹配。

軸向上套管的長度小于離心管的長度，吸頭伸出的尾端置于套管和離心管之間的空間內(nèi)。

以上所述內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子富集柱中，吸頭內(nèi)的膜層為47mm的C18膜。

吸頭內(nèi)的磁珠直徑280μm。優(yōu)選M280磁珠，即M-280鏈霉親和素磁珠。

本實用新型提供了一種僅需少量樣品即可快速富集、分離內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的專用裝置TOT柱，利用轉(zhuǎn)錄因子可與序列特異性DNA元件結(jié)合的特點，將核蛋白或全蛋白(樣品)在該TOT柱中與結(jié)合有轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列(TFRE DNA，DNA誘餌)的磁珠進行微量體積的孵育，從核蛋白或全蛋白中高效富集、分離內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物，目標蛋白可用于后續(xù)進一步進行轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的鑒定及定量。

本實用新型的TOT柱設(shè)計新穎實用，由吸頭(吸頭內(nèi)部尾端設(shè)有膜結(jié)構(gòu)，防止磁珠漏下)、套管(吸頭固定裝置)和離心管(1.5mL)組成，三者可分離和組裝，使用時需將套管放入離心管中，再將吸頭插入套管中，從而使吸頭固定在離心管中。結(jié)合有轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列的磁珠可置于TOT柱的吸頭內(nèi)部底端，用封口膜封裝，置于4℃保存。使用時直接取用(加入核蛋白或者全蛋白樣品即可進行檢測)，在三個月的保質(zhì)期內(nèi)不會有柱效降低現(xiàn)象。本實用新型內(nèi)管吸頭中裝有磁珠并以膜層阻擋磁珠而使液體流出，作為富集樣品中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)空間，使用與離心機配套的離心管作為外管，方便離心操作，內(nèi)管和外管之間以套管銜接，巧妙地將吸頭與離心管固定。使用該TOT柱，可以配合相關(guān)試劑實現(xiàn)對樣品中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的富集，富集過程操作簡便，步驟少，能縮短富集流程的用時，與傳統(tǒng)TFRE方法需要至少兩天的試驗周期相比，使用該TOT柱僅需要幾個小時，是一種快速富集、分離內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的理想裝置，其應(yīng)用簡便、能儲存富集物、體積小，可廣泛應(yīng)用于生物研究、醫(yī)學(xué)檢驗、藥物篩選等方面，應(yīng)用前景廣闊。

下面結(jié)合具體實施例對本實用新型做進一步詳細說明。

附圖說明

圖1為本實用新型TOT柱組裝后構(gòu)成圖；

圖2為本實用新型TOT柱中吸頭結(jié)構(gòu)圖(底部封閉)；

圖3為本實用新型TOT柱組裝前的分件圖；

圖4為使用TOT柱快速富集樣品中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的流程。

具體實施方式

本實用新型提供一種用于快速富集樣品中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物、適用高通量操作的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子富集柱，簡稱TOT柱(英文TFRE on tips的縮寫)，核蛋白或全 蛋白樣品與結(jié)合有轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列的磁珠可在該TOT柱中進行孵育、清洗、分離等操作，以得到富集有內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的蛋白提取物。

參見圖1所示，該TOT柱由內(nèi)向外依次由吸頭1、套管2和離心管3套裝組成。其中，結(jié)合圖2所示，吸頭1呈長錐形結(jié)構(gòu)，頭端(大頭端)敞口，尾端(小頭端)開有小孔，尾端內(nèi)部設(shè)有膜層31進行封閉，膜層31上裝填有磁珠32，該磁珠32是已連接有轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列的磁珠。吸頭1用于裝填磁珠和各液體，為完成轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列-磁珠連接、轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的富集和分離提供空間。

離心管3為配合已有的離心機設(shè)計的柱錐形管體，通常小頭端封閉，大頭端敞口，離心管3容積最好為1.5mL以配合離心機使用。參見圖3和圖4。

套管2用于固定吸頭1，并可插入離心管3中固定，為此套管2整體設(shè)計成與吸頭1和離心管3相匹配的形狀；其大頭端敞口并設(shè)有固定臺階21，固定臺階21外徑與離心管3大頭端內(nèi)徑匹配以使套管2與離心管3固定；套管2小頭端設(shè)有開孔22，開孔22尺寸與吸頭1錐管中部外徑匹配用于使錐形吸頭1尾端從中伸出并卡固；組裝時套管2放入離心管3中，吸頭1插入套管2中從而使吸1頭和離心管3固定，因此，軸向上套管2的長度小于離心管3的長度，且使吸頭1伸出的尾端置于套管2和離心管3之間的空間內(nèi)，參見圖1和圖3。

以上吸頭1、套管2和離心管3套裝組成了本實用新型TOT柱。這里，吸頭1內(nèi)的膜層31可以阻止磁珠漏下，但是允許液體通過，可使用47mm的C18膜(購自3M公司)；吸頭1內(nèi)的磁珠32是已連接有轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列(該序列能與樣品中的轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合)的磁珠，該磁珠具有磁性，可使用M280磁珠(M-280 streptavodin鏈霉親和素磁珠，購自Invitrogen公司，1.2-1.4×10⁷個磁珠)作為起始磁珠，直徑280μm，用已有的方法使轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列與起始磁珠結(jié)合。組裝好的TOT柱能裝入離心機中以對其中吸頭內(nèi)的反應(yīng)物進行離心操作，可多個TOT同時裝入離心機中進行同步離心，實現(xiàn)高通量操作。

以下結(jié)合圖4說明如何使用本實用新型TOT柱進行樣品中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的富集。結(jié)合圖4所示，進行以下操作：

1)剪取47mm的C18膜，置于吸頭內(nèi)部的尾端，C18膜能截留磁珠的同時保證液體能夠流出；

2)向吸頭中加入100μL乙腈，組裝到離心管后置于離心機中1000rpm離心1min，重復(fù)一次，以清洗吸頭及C18膜；

3)向吸頭中加入100μL BC200溶液，組裝到離心管后置于離心機中1400rpm離心1min，重復(fù)一次，以去除吸頭中的乙腈；

4)將已連接有轉(zhuǎn)錄因子串聯(lián)結(jié)合序列的磁珠BC200溶液(每100mLBC200溶液含有：甘油20mL，3M KCl 6.7mL，0.5M EDTA 40μL，1M Tris(pH7.3)2mL)加入TOT柱吸頭中；

5)將50μg核蛋白樣品加入TOT柱吸頭中，將核蛋白樣品和TOT柱吸頭中的磁珠混勻后，冰上靜置孵育10min，2300rpm離心5分鐘，離心去除上清；

6)向TOT柱吸頭中加入100μL 50mM NETN溶液(每100mL含有：1M Tris-HCl(pH8.0)1mL，5M NaCl 1mL，0.5M EDTA 200μL，NP40乙基苯基聚乙二醇250μL)，將磁珠混勻后，500rpm離心5min，去除上清；

7)向TOT柱吸頭中加入100μL PBS溶液(磷酸緩沖鹽溶液，配方：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄)，將磁珠混勻后，用500rpm離心5min，去除上清；

8)向TOT柱吸頭中加入10μL 50mM碳酸氫銨溶液，并加入0.2μg胰酶，37℃靜置1小時，得到長度為8-25個氨基酸不等的短肽段，該短肽段中包含有內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物；

9)用100μL含有0.1％(V/V)甲酸的50％(V/V)乙腈萃取使短肽段與磁珠分離，取萃取液并熱干得到已富集有內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的目標短肽段，該短肽段可用于后續(xù)對富集到的轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物的鑒定和定量檢測。