本實(shí)用新型涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的設(shè)備及方法。
背景技術(shù)：
：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱。在腫瘤的發(fā)展過程中，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落，大部分CTC在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中，許多研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)其在腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷和預(yù)后、藥物研發(fā)、個(gè)體化治療及其探索腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制等方面具有潛在的價(jià)值。因此，特異、敏感地檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞非常重要，不僅能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后，還有利于制定個(gè)性化治療方案。根據(jù)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的途徑，在血液或淋巴管中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞被定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell，CTC)，而其中若干細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團(tuán)塊被稱為循環(huán)腫瘤微栓(circulatingtumormocroemboli,CTM)。CTM是腫瘤細(xì)胞的“集體遷移”行為，因其能夠抵抗細(xì)胞凋亡、保持細(xì)胞增殖能力而具有更高的轉(zhuǎn)移潛能。然而，外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目較少(1個(gè)CTC/106～107個(gè)單核細(xì)胞)，精確分離很困難。CellSearch系統(tǒng)是目前FDA唯一批準(zhǔn)用于臨床富集及檢測(cè)分析的技術(shù)設(shè)備，是一種半自動(dòng)技術(shù)，集合了免疫磁珠分選技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)法的分離檢測(cè)技術(shù)。標(biāo)記有抗EpCAM抗體的磁珠與靶細(xì)胞結(jié)合，在外加磁場(chǎng)作用下被保留下來，接著采用熒光標(biāo)記(CK8/18/19，DAPI，CD45)來區(qū)別CTC與血細(xì)胞，隨后采用半自動(dòng)熒光顯微鏡檢測(cè)分析細(xì)胞大小和形態(tài)，最終確定CTC。但是，該法操作復(fù)雜，成本很高，通量低，限制了其在臨床大規(guī)模篩選檢測(cè)時(shí)的應(yīng)用。另外，由于外周血中存在一定數(shù)量的非腫瘤性上皮細(xì)胞(循環(huán)上皮細(xì)胞)，加上大多數(shù)惡性循環(huán)腫瘤細(xì)胞由于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變，從而丟失了上皮抗原EpCAM，因而無法被檢測(cè)到。因此當(dāng)CTC計(jì)數(shù)用于評(píng)估腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)、腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)以及腫瘤篩查時(shí)，這些問題就顯得特別重要。此外，由于多步細(xì)胞標(biāo)記和處理會(huì)使細(xì)胞團(tuán)塊離散，從而使得免疫磁性分離法無法用來檢測(cè)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更高的CTM。另外一種CTC富集方法采用密度梯度分離原理，根據(jù)血液中的各種細(xì)胞的密度不同，利用一種特定密度且近于等滲的溶液(分層液)與標(biāo)本加入同一試管后離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將血液中各種細(xì)胞加以分離。分離后可以進(jìn)行細(xì)胞染色、免疫標(biāo)記等進(jìn)一步的分析。在此基礎(chǔ)上建立起來的OncoQuick方法(德國Greiner公司)，用一種專用的50mL的試管，內(nèi)置多孔屏障，其下為密度梯度分離液，使用時(shí)將標(biāo)本置于屏障之上從而避免在離心之前與分離液混合，與前相比(CellSearch系統(tǒng))，更易從粒細(xì)胞中分離出腫瘤細(xì)胞，從而更有利于進(jìn)一步的分析。該法的局限性在于由于部分腫瘤細(xì)胞可遷至血漿層或留于紅細(xì)胞或中性粒細(xì)胞中，不僅容易造成在分離過程中腫瘤細(xì)胞的丟失，而且如果血液抗凝不完全，微小凝塊則可能使腫瘤細(xì)胞落至梯度密度液的底部。因此該法敏感性較低且依賴于腫瘤細(xì)胞的特性、離心的時(shí)間、溫度等多種因素。2000年Vona等報(bào)道了一種依據(jù)細(xì)胞大小，通過過濾直接富集上皮性腫瘤細(xì)胞的方法(isolationbysizeofepithelialtumorcells,ISET)。該法可使較小的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞通過，而較大的腫瘤細(xì)胞則被阻滯在膜上。該方法不僅操作簡單，而且比較敏感，可避免煩瑣的多步驟分離造成的稀少細(xì)胞的破壞和丟失，且具有高轉(zhuǎn)移潛能的CTM也能被富集和計(jì)數(shù)。富集到的細(xì)胞可進(jìn)行細(xì)胞學(xué)染色，或通過免疫標(biāo)記、熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)、TUNEL等方法分析其抗原、非整倍性和細(xì)胞凋亡等。但是，目前該法多采用實(shí)驗(yàn)室手動(dòng)操作，自動(dòng)化程度低，通量低，誤差大，且容易引起交叉污染，特別易于在后續(xù)分子生物學(xué)檢測(cè)時(shí)造成干擾。此外，長期手動(dòng)操作對(duì)實(shí)驗(yàn)員的健康亦會(huì)造成潛在性的威脅。綜上所述，目前相關(guān)技術(shù)中常見的提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法存在操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、通量低以及敏感性較低(依賴于腫瘤細(xì)胞的特性、離心的時(shí)間、溫度等多種因素)等技術(shù)問題。有鑒于此，特提出本實(shí)用新型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本實(shí)用新型的第一目的在于提供一種高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置，該裝置用于快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞，具有自動(dòng)化程度高、高通量、不易引起交叉污染等效果。為了實(shí)現(xiàn)本實(shí)用新型的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：本實(shí)用新型提供了一種高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置：所述高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置包括：過濾模塊；所述過濾模塊包括過濾器、設(shè)置在過濾器內(nèi)部并與過濾器內(nèi)壁密封的濾膜、負(fù)壓裝置；所述負(fù)壓裝置連接在所述過濾器的出口一端，用于使所述過濾器的內(nèi)部保持負(fù)壓；所述濾膜用于當(dāng)所述負(fù)壓裝置使所述過濾器的內(nèi)部保持負(fù)壓時(shí)，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞截留。本實(shí)用新型提供的這種高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置，其包括了過濾模塊，而該過濾模塊中，包括了過濾器、設(shè)置在過濾器內(nèi)部并與過濾器內(nèi)壁密封的濾膜以及連接在所述過濾器的出口一端負(fù)壓裝置；在捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的過程中，預(yù)先將樣本液輸入到過濾器內(nèi)部，負(fù)壓裝置可以使得過濾器內(nèi)部形成負(fù)壓，并且使得樣本液透過濾膜，從過濾器的出口端排出。在樣本液透過濾膜的過程中，樣本液所含的循環(huán)腫瘤細(xì)胞由于其體積較其他血液細(xì)胞大，進(jìn)而會(huì)被濾膜截留，從而實(shí)現(xiàn)了高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的效果；由于將樣本液輸入到過濾器以及負(fù)壓裝置都可以自動(dòng)控制，因此濾膜截留循環(huán)腫瘤細(xì)胞的過程具有自動(dòng)化程度高，高通量(增加過濾器數(shù)量即可實(shí)現(xiàn))等效果。且在同時(shí)操作多個(gè)過濾器時(shí)，每個(gè)過濾器及濾過液流經(jīng)的管路均為獨(dú)立管路，無交叉污染，濾過液可單獨(dú)收集用于其他分析或直接排入所述廢液收集裝置。可選的，所述高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置還包括：試劑進(jìn)樣模塊和第一負(fù)壓泵；所述試劑進(jìn)樣模塊與所述過濾器連通，且所述第一負(fù)壓泵設(shè)置在所述試劑進(jìn)樣模塊與所述過濾器的連通管路上。在對(duì)過濾器中的樣本液過濾之后，一般都會(huì)對(duì)截留在濾膜上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清洗、染色等操作，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析的要求。因此，為了進(jìn)一步地提高清洗以及染色的自動(dòng)化程度，優(yōu)選設(shè)置了試劑進(jìn)樣模塊和第一負(fù)壓泵。使用時(shí)，在第一負(fù)壓泵的作用下，試劑進(jìn)樣模塊中的試劑可被順利的導(dǎo)入到過濾器中，從而非常便于實(shí)現(xiàn)樣本液的清洗、染色操作?？蛇x的，所述過濾器為多個(gè)，且所有所述過濾器與所述第一負(fù)壓泵的連通管路上設(shè)置有一試劑分配器。為了實(shí)現(xiàn)批量處理樣本液的效果，過濾器可優(yōu)選為多個(gè)，而且所有所述過濾器與所述第一負(fù)壓泵的連通管路上設(shè)置有一試劑分配器；通過試劑分配器可以將從試劑進(jìn)樣模塊輸入的試劑分配到多個(gè)過濾器中。更為優(yōu)選的，多個(gè)過濾器(一般為8-10個(gè))可以通過一個(gè)固定支架實(shí)現(xiàn)一體設(shè)置，形成一組固定的過濾器。當(dāng)處理量較大時(shí)，可以并行設(shè)置多組過濾器。對(duì)于過濾器的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的，過濾器包括管體、密封圈、可放置濾膜的支架，濾膜設(shè)置在濾膜支架上，密封圈使得濾膜和濾膜支架、管體的內(nèi)壁密封?？蛇x的，所述試劑進(jìn)樣模塊包括清洗液儲(chǔ)樣瓶、染色液儲(chǔ)樣瓶和保存液儲(chǔ)樣瓶；所述清洗液儲(chǔ)樣瓶、所述染色液儲(chǔ)樣瓶和所述保存液儲(chǔ)樣瓶通過一個(gè)多通道連接頭與所述第一負(fù)壓泵連接。一般來說，對(duì)于過濾后被截留的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，多會(huì)進(jìn)行清洗、染色以及封閉保存(如果不立即使用)的操作，因此，對(duì)于試劑進(jìn)樣模塊，其優(yōu)選包括清洗液儲(chǔ)樣瓶、染色液儲(chǔ)樣瓶和保存液儲(chǔ)樣瓶；且清洗液儲(chǔ)樣瓶、染色液儲(chǔ)樣瓶和保存液儲(chǔ)樣瓶通過一個(gè)多通道連接頭(便于將多個(gè)儲(chǔ)樣瓶與試劑分配器連接)與第一負(fù)壓泵連接?？蛇x的，所述清洗液儲(chǔ)樣瓶、所述染色液儲(chǔ)樣瓶和所述保存液儲(chǔ)樣瓶與所述多通道連接頭的連通管路上分別設(shè)置有通道閥門。通過多個(gè)通道閥門可以方便地控制多個(gè)儲(chǔ)樣瓶內(nèi)部試劑的流向，進(jìn)一步地提高了自動(dòng)化程度?？蛇x的，還包括廢液收集裝置和第二負(fù)壓泵；所述過濾器的出口與所述廢液收集裝置連通；且所述過濾器的管壁上還設(shè)置有溢流口，所述溢流口與所述廢液收集裝置通過溢流管連通；所述第二負(fù)壓泵設(shè)置在所述溢流管上。由于濾器的出口與所述廢液收集裝置連通，因此經(jīng)過過濾后的樣本液以及從儲(chǔ)樣瓶流出試劑使用完畢后可被廢液收集裝置收集。而且，由于溢流管以及第二負(fù)壓泵(較優(yōu)為蠕動(dòng)泵、真空泵)的設(shè)置，在操作開始時(shí)，啟動(dòng)第二負(fù)壓泵，可主動(dòng)預(yù)防由于濾膜堵塞引起的樣本液和試劑液溢出，從而最大限度的避免了高通量操作時(shí)樣本間的污染，同時(shí)避免了有毒有害物質(zhì)對(duì)儀器和操作人員的不良影響?？蛇x的，還包括可編程式邏輯控制器；所述可編程式邏輯控制器與所有的所述通道閥門、所述負(fù)壓裝置、所述第一負(fù)壓泵、所述第二負(fù)壓泵、所述多通道連接頭以及所述試劑分配器相連，并用于控制所述通道閥門、所述負(fù)壓裝置、所述第一負(fù)壓泵、所述第二負(fù)壓泵、所述多通道連接頭以及所述試劑分配器的開/關(guān)狀態(tài)。通過可編程式邏輯控制器控制所述通道閥門、所述負(fù)壓裝置、所述第一負(fù)壓泵、所述第二負(fù)壓泵、所述多通道連接頭以及所述試劑分配器的開/關(guān)狀態(tài)，進(jìn)一步地提高了整個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲過程中的自動(dòng)化程度，減少了手動(dòng)操作可能會(huì)導(dǎo)致的誤差以及試劑可對(duì)人體造成潛在危害的缺陷?？蛇x的，所述濾膜為高分子聚合微孔膜，且其孔徑為5-10μm。對(duì)于過濾器連接有負(fù)壓裝置的出口端，優(yōu)選設(shè)置有錐形的濾過頭，每個(gè)過濾器的濾過頭都通過獨(dú)立的濾過液輸送管濾過液收集管或與廢液收集裝置相連，若濾過液收集在濾過液收集管中，由于每個(gè)樣本間及每批次樣本間均為獨(dú)立操作，最大限度的避免同批次樣本間和不同批次樣本間的交叉污染，因此濾過液收集管中的濾過液仍可用于進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)分析。此外，對(duì)于濾膜優(yōu)選為透明或半透明的高分子聚合微孔膜，也可為黑色無熒光背景的高分子聚合微孔膜，微孔膜的平均孔徑介于5-10μm，樣本液或試劑在過濾器內(nèi)的流動(dòng)，均通過負(fù)壓裝置(較優(yōu)為蠕動(dòng)泵、真空泵、柱塞泵、注射泵)形成負(fù)壓實(shí)現(xiàn)，而且5-10μm的高分子聚合微孔膜可以實(shí)現(xiàn)很好的循環(huán)腫瘤細(xì)胞截留?？蛇x的，所述染色液儲(chǔ)樣瓶與所述試劑分配器的連通管路上設(shè)置有顆粒過濾器；所述顆粒過濾器處于所述染色液儲(chǔ)樣瓶與該連通管路上的通道閥門之間?？蛇x的，所述負(fù)壓裝置為蠕動(dòng)泵、真空泵、柱塞泵以及注射泵中的任意一種。利用所述的高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟：將血液樣本輸送至過濾器內(nèi)，啟動(dòng)負(fù)壓裝置使所述過濾器形成負(fù)壓，并使血液樣本穿過濾膜的過程中，所含的腫瘤細(xì)胞截留在濾膜上。優(yōu)選的，該方法具體包括以下步驟：1)、將樣本液固定后，加入至過濾器中，啟動(dòng)負(fù)壓裝置，使得樣本液經(jīng)過濾膜，且所含的循環(huán)腫瘤細(xì)胞被截留；2)、將被截留在濾膜上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞依次利用磷酸鹽緩沖液清洗、利用染色液染色、利用磷酸鹽緩沖液清洗以及利用保存液保存，即得，其中，染色液是DAPI、AO、PI、hoechst、sybgreen、熒光標(biāo)記抗體、伊紅美藍(lán)以及瑞氏-姬姆薩中的任意一種。該方法通過負(fù)壓抽濾的方式實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的截留和染色，整個(gè)操作簡單易行，可控性強(qiáng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型的有益效果為：(1)、該裝置整體結(jié)構(gòu)連貫緊湊，為快速有效地捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的提供了保障，基于該裝置的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞高自動(dòng)化捕獲。(2)、通過自動(dòng)控制整個(gè)裝置即可實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離、清洗以及染色和保存等操作，克服了現(xiàn)有技術(shù)中整個(gè)捕獲過程需要大量人工手動(dòng)操作而可能存在的對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的潛在危害以及捕獲效率低等缺陷。(3)、由于過濾器、管路及負(fù)壓裝置的特殊設(shè)計(jì)，使得每個(gè)樣本間及每批次樣本間均為獨(dú)立操作，最大限度的避免同批次樣本間和不同批次樣本間的交叉污染，因此濾過液重新收集后，仍可用于進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)分析，極大的拓寬了設(shè)備的應(yīng)用范圍，使得1管樣本進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)分析成為可能。(4)、該裝置和方法的結(jié)合，克服了現(xiàn)有技術(shù)中常見的手動(dòng)捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的操作所具有的通量低、誤差大，且容易引起交叉污染，特別是易于在后續(xù)分子生物學(xué)檢測(cè)時(shí)造成干擾的缺陷。附圖說明為了更清楚地說明本實(shí)用新型實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1為本實(shí)用新型提供的高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖附圖標(biāo)記：0-試劑儲(chǔ)樣瓶，1-試劑進(jìn)樣模塊，2-過濾模塊，3-主動(dòng)防溢出模塊，4-自動(dòng)控制模塊，5-廢液收集裝置；01為清洗液儲(chǔ)樣瓶，02為染色液儲(chǔ)樣瓶，03為保存液儲(chǔ)樣瓶，0X為可擴(kuò)充試劑瓶，111-11X為試劑輸送管，121-12X為通道閥門，13為多通道連接頭，14為第一負(fù)壓泵，15試劑分配器；21為過濾器固定支架，22為過濾器，23為濾膜，24濾過液輸送管，25為負(fù)壓裝置，26為濾過液輸送管密封夾，27為密封塞，221為管體，223為密封圈，224為可放置濾膜的支架，225為濾過頭，222為溢流口，31為溢流管，32為第二負(fù)壓泵，41為可編程式邏輯控制器，42為控制板；圖2為利用本實(shí)用新型的設(shè)備獲取和提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本實(shí)用新型，而不應(yīng)視為限制本實(shí)用新型的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明制備廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。請(qǐng)參考圖1，本實(shí)用新型提供的這種高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置，包括過濾模塊2；過濾模塊2包括過濾器22、設(shè)置在過濾器22內(nèi)部并與過濾器22內(nèi)壁密封的濾膜23、負(fù)壓裝置25；負(fù)壓裝置25連接在過濾器22的出口一端，用于使過濾器22的內(nèi)部保持負(fù)壓；濾膜23用于當(dāng)負(fù)壓裝置25使過濾器22的內(nèi)部保持負(fù)壓時(shí)，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞截留。在較為優(yōu)選的方案中，該高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置還包括：試劑進(jìn)樣模塊1和第一負(fù)壓泵14；試劑進(jìn)樣模塊1與過濾器22連通，且第一負(fù)壓泵14設(shè)置在試劑進(jìn)樣模塊1與過濾器22的連通管路上。過濾器22為多個(gè)，且所有過濾器22與第一負(fù)壓泵14的連通管路上設(shè)置有一試劑分配器15。為了進(jìn)一步地提高過濾后對(duì)截留的循環(huán)細(xì)胞的清洗以及染色的自動(dòng)化程度，優(yōu)選設(shè)置了試劑進(jìn)樣模塊1和第一負(fù)壓泵14。使用時(shí)，在第一負(fù)壓泵14的作用下，試劑進(jìn)樣模塊1中的試劑可被順利的導(dǎo)入到過濾器22中，從而非常便于實(shí)現(xiàn)樣本液的清洗、染色操作。為了實(shí)現(xiàn)批量處理樣本液的效果，過濾器22可優(yōu)選為多個(gè)，而且所有過濾器22與第一負(fù)壓泵14的連通管路上設(shè)置有一試劑分配器15；通過試劑分配器15可以將從試劑進(jìn)樣模塊1輸入的試劑分配到多個(gè)過濾器22中。在上述較為優(yōu)選方案的基礎(chǔ)之上，優(yōu)選的，試劑進(jìn)樣模塊1包括清洗液儲(chǔ)樣瓶01、染色液儲(chǔ)樣瓶02和保存液儲(chǔ)樣瓶03；清洗液儲(chǔ)樣瓶01、染色液儲(chǔ)樣瓶02和保存液儲(chǔ)樣瓶03通過一個(gè)多通道連接頭13與第一負(fù)壓泵14連接。清洗液儲(chǔ)樣瓶01、染色液儲(chǔ)樣瓶02和保存液儲(chǔ)樣瓶03與試劑分配器15的連通管路上分別設(shè)置有通道閥門。通過多個(gè)通道閥門可以方便地控制多個(gè)儲(chǔ)樣瓶內(nèi)部試劑的流向，進(jìn)一步地提高了裝置的自動(dòng)化程度。在上述方法的基礎(chǔ)之上，更為優(yōu)選的，該高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置進(jìn)一步包括廢液收集裝置5和第二負(fù)壓泵32；過濾器22的出口與廢液收集裝置5連通；且過濾器22的管壁上還設(shè)置有溢流口222，溢流口222與廢液收集裝置5通過溢流管31連通；第二負(fù)壓泵32設(shè)置在溢流管31上。這樣，經(jīng)過過濾后的樣本液以及從儲(chǔ)樣瓶流出試劑使用完畢后可被廢液收集裝置5收集或被重新收集到濾過液收集管中。而且，由于溢流管31以及第二負(fù)壓泵32(較優(yōu)為蠕動(dòng)泵、真空泵)的設(shè)置，在操作開始時(shí)，啟動(dòng)第二負(fù)壓泵32，可主動(dòng)預(yù)防由于濾膜23堵塞引起的樣本液和試劑液溢出，從而最大限度的避免了高通量操作時(shí)樣本間的污染，同時(shí)避免了有毒有害物質(zhì)對(duì)儀器和操作人員的不良影響。另外，為了實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的自動(dòng)化控制，在上述最為優(yōu)選的方案的基礎(chǔ)之上，優(yōu)選的，還設(shè)置可編程式邏輯控制器41；可編程式邏輯控制器與所有的通道閥門、負(fù)壓裝置25、第一負(fù)壓泵14、第二負(fù)壓泵32、多通道連接頭13以及試劑分配器15相連，并用于控制通道閥門、負(fù)壓裝置25、第一負(fù)壓泵14、第二負(fù)壓泵32、多通道連接頭13以及試劑分配器15的開/關(guān)狀態(tài)。基于以上的優(yōu)選設(shè)置，進(jìn)一步地提高了整個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲過程中的自動(dòng)化程度，減少了手動(dòng)操作可能會(huì)導(dǎo)致的誤差以及試劑可對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成潛在危害的缺陷。此外，在上述所有的方案中，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)循環(huán)重量細(xì)胞的大量截留，優(yōu)選的，濾膜為高分子聚合微孔膜(更具體的，其為聚碳酸酯膜或聚酯膜；孔徑生產(chǎn)模式較優(yōu)為蝕刻法)，且其孔徑為5-10μm。請(qǐng)參考圖1，在本實(shí)用新型的另一技術(shù)方案中，該高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞設(shè)備包括：試劑儲(chǔ)樣瓶0、試劑進(jìn)樣模塊1、過濾模塊2、主動(dòng)防溢出模塊3、自動(dòng)控制模塊4、廢液收集裝置5；試劑儲(chǔ)樣瓶0由多個(gè)試劑瓶組成，分別用以儲(chǔ)存樣品處理、染色、清洗、固定、保存時(shí)需要的試劑；附圖1中所示(但不僅限于此)，其中，01為清洗液儲(chǔ)樣瓶，02為染色液儲(chǔ)樣瓶，03為保存液儲(chǔ)樣瓶，0X為可擴(kuò)充試劑瓶(例如為固定液儲(chǔ)樣瓶、保存液儲(chǔ)樣瓶等)，可根據(jù)提取染色需要增添若干相關(guān)試劑瓶(最多可擴(kuò)充至10個(gè)儲(chǔ)樣瓶)。試劑進(jìn)樣模塊1包括：試劑輸送管111-11X、通道閥門121–12X、多通道連接頭13、第一負(fù)壓泵14、試劑分配器15。試劑輸送管111-11X有多條，用以連通試劑儲(chǔ)樣瓶0與過濾器22，且每條試劑輸送管上分別設(shè)置有通道閥門121–12X，通過多個(gè)通道閥門121–12X可以方便地控制多個(gè)試劑儲(chǔ)樣瓶(01-0X)內(nèi)部試劑的流向，進(jìn)一步地提高了自動(dòng)化程度。使用時(shí)，在第一負(fù)壓泵14的作用下，試劑儲(chǔ)樣瓶(01–0X)中的試劑可按順序被順利的分別導(dǎo)入到單個(gè)或多個(gè)過濾器22中，從而自動(dòng)化地實(shí)現(xiàn)樣本液的清洗、染色操作。由于從樣本液過濾以截留循環(huán)腫瘤細(xì)胞，到將各種試劑輸入多個(gè)過濾器22對(duì)截留的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清洗、固定、染色的所有步驟均可以自動(dòng)控制，因此濾膜截留染色循環(huán)腫瘤細(xì)胞的全過程具有自動(dòng)化程度高，高通量(增加過濾器數(shù)量即可實(shí)現(xiàn))等效果。試劑進(jìn)樣模塊1與試劑儲(chǔ)樣瓶(01–0X)相連，每種試劑從獨(dú)立試劑輸送管(111-11X)，通過多通道連接頭13進(jìn)入試劑分配器1.5；試劑流動(dòng)通過第一負(fù)壓泵14(較優(yōu)為蠕動(dòng)泵、柱塞泵、真空泵、注射泵)形成負(fù)壓推動(dòng)試劑液體流動(dòng)；每種試劑的獨(dú)立試劑輸送管路上均設(shè)有通道閥門(121–12X，較優(yōu)為電磁閥)，用以控制通過該通道的試劑的開放和關(guān)閉時(shí)間；試劑分配器15具有定位和分配功能，可將進(jìn)入分配器中的試劑均勻分配到過濾模塊2的多個(gè)過濾器22中；在染色液通道112上設(shè)有顆粒過濾器1121，用以過濾染色液中由于結(jié)晶形成的顆粒物，最大限度降低對(duì)染色后細(xì)胞的干擾；所有通道閥門、負(fù)壓泵、多通道連接頭13以及試劑分配器15均與可編程式邏輯控制器41相連，并受編程程序控制。過濾模塊2包括：過濾器固定支架21、過濾器22、濾膜23、濾過液輸送管24、負(fù)壓裝置25；一組過濾器固定支架21上可同時(shí)固定8-10個(gè)過濾器22，多組過濾器固定支架21通過組合形式方便增加；過濾器22由管體221、密封圈223、可放置濾膜的支架224、濾過頭225組成；過濾器22的管體上設(shè)有溢流口222，該溢流口222與主動(dòng)防溢流模塊3相連，用以防止由于濾膜23堵塞引起的樣本和試劑液溢出。管體221與濾膜23、可放置濾膜的支架224、濾過頭225拼裝組合形成濾器22；密封圈223用以密封管體221與濾膜23、可放置濾膜的支架224之間的空隙，便于后續(xù)負(fù)壓操作；每個(gè)過濾器22的濾過頭225都與獨(dú)立的濾過液輸送管24相連，最大限度的避免同批次樣本間和不同批次樣本間的交叉污染，濾過液輸送管24最終與廢液收集裝置5相連，或與其他濾過液收集管相連；濾膜23為透明或半透明的高分子聚合微孔膜，也可為黑色無熒光背景的高分子聚合微孔膜，微孔膜的平均孔徑介于5-10μm；樣本試劑過濾及濾過液流動(dòng)，均通過負(fù)壓裝置25(較優(yōu)為蠕動(dòng)泵、真空泵)形成負(fù)壓推動(dòng)試劑液體流動(dòng)；負(fù)壓裝置25與可編程式邏輯控制器41相連，并受編程程序控制。主動(dòng)防溢出模塊3包括溢流管31、第二負(fù)壓泵32。溢流管31與過濾器22的管體221上的溢流口222相連，最終與廢液收集裝置5相連；溢流管路上接有第二負(fù)壓泵32(較優(yōu)為蠕動(dòng)泵、真空泵)，在樣本操作開始時(shí)即啟動(dòng)負(fù)壓操作，主動(dòng)預(yù)防由于濾膜23堵塞引起的樣本和試劑液溢出，從而最大限度的避免了高通量操作時(shí)樣本間的污染，同時(shí)避免了有毒有害物質(zhì)對(duì)儀器和操作人員的不良影響；第二負(fù)壓泵32與可編程式邏輯控制器41相連，并受編程程序控制。廢液收集裝置5與濾過液輸送管24，溢流管31相連，內(nèi)裝病原微生物滅活試劑(較優(yōu)為次氯酸鈉、酒精溶液等)用以滅活進(jìn)入廢液收集裝置的濾過液或溢流液中的病原微生物，從而對(duì)操作環(huán)境和人員進(jìn)行有效保護(hù)。自動(dòng)控制模塊4用以控制試劑進(jìn)樣模塊1、過濾模塊2、主動(dòng)防溢出模塊3的可編程式邏輯控制器41，可編程式邏輯控制器4.1可與電腦或控制板42相連，用以按照編程程序按順序和時(shí)間調(diào)控各個(gè)控制器，或按具體要求更改操作程序及時(shí)間。接下來，結(jié)合以上的內(nèi)容，對(duì)本實(shí)用新型的利用高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞設(shè)備快速捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法舉出以下具體實(shí)施例：本實(shí)用新型提供的這種快速捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法具體包括如下的步驟：1、血液樣本(樣本液)的過濾：a)在2ml外周血液樣本中加入3ml4％多聚甲醛溶液，處理10分鐘，對(duì)外周血中的細(xì)胞進(jìn)行固定，同時(shí)對(duì)可能的病原微生物進(jìn)行滅活。b)一次性或分批加入組裝好的過濾器22中，每次加入后過濾器2.2中的液面應(yīng)低于過濾器22的溢流口222的最下端；c)啟動(dòng)負(fù)壓裝置25，并持續(xù)運(yùn)行10-15分鐘，使血液樣本在負(fù)壓作用下全部穿過濾膜23，使循環(huán)腫瘤細(xì)胞得以被微孔膜截留在膜表面。在該步驟中，由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的直徑大于紅細(xì)胞及絕大部分血液有核細(xì)胞，因此，循環(huán)腫瘤細(xì)胞得以被微孔膜截留在濾膜23表面，而紅細(xì)胞及血液有核細(xì)胞則穿過微孔膜通過獨(dú)立的濾過液輸送管24最終進(jìn)入廢液收集裝置5，并被病原微生物滅活試劑將濾過液中可能存在的病原微生物滅活，或?qū)V過液收集入其他濾過液收集管，用于其他檢測(cè)分析。固定液可為任何有固定細(xì)胞樣本作用的試劑，較優(yōu)為多聚甲醛、甲醛等醛類固定液；或者，較優(yōu)為甲醇、乙醇、及無醛類固定液。2、微孔膜上循環(huán)腫瘤細(xì)胞的清洗：a)在血液樣本過濾步驟完成后，立即啟動(dòng)第二負(fù)壓泵32(其后始終開啟)，同時(shí)第一負(fù)壓泵14；b)開啟清洗液通道閥門121，清洗液磷酸鹽緩沖液(pH7.4)在第一負(fù)壓泵14作用下，從清洗液儲(chǔ)樣瓶01進(jìn)入清洗液輸送管道111，清洗液再經(jīng)過多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個(gè)過濾器22中；c)在第一負(fù)壓泵14開啟1-2分鐘后，再次開啟負(fù)壓裝置25，使過濾器22中的清洗液穿過濾膜，起到對(duì)濾膜23及其上所截留的細(xì)胞的清洗作用。其中，在上述的步驟中，清洗液通道閥門121和第一負(fù)壓泵14的開啟時(shí)長為5分鐘，隨后清洗液通道閥門121關(guān)閉，第一負(fù)壓泵14停止；而負(fù)壓裝置25得開啟，時(shí)長為10-15分鐘，直至過濾器22中的所有清洗液排空。此外，清洗液除了選擇磷酸鹽緩沖液(pH7.4)外，還可為生理鹽水、5％葡萄糖溶液等。3、濾膜上循環(huán)腫瘤細(xì)胞的染色：a)在清洗步驟完成后，暫停負(fù)壓裝置25，再次開啟第一負(fù)壓泵14，同時(shí)開啟染色液通道閥門122；b)染色液即瑞氏-姬姆薩染色液(染色液類別根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇)在第一負(fù)壓泵14作用下，從染色液儲(chǔ)樣瓶02進(jìn)入染色液輸送管道112，隨后經(jīng)過顆粒過濾器1121，經(jīng)多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個(gè)過濾器22中；c)在負(fù)壓裝置25暫停15-20分鐘后，再次開啟負(fù)壓裝置25，使過濾器22中的染色液穿過濾膜23，起到對(duì)濾膜23上的細(xì)胞染色的作用，直至過濾器22中的所有染色液排空。上述步驟中，染色液通道閥門122和第一負(fù)壓泵14的開啟時(shí)長為5分鐘，隨后染色液通道閥門122關(guān)閉，第一負(fù)壓泵14停止；而負(fù)壓裝置25在第一負(fù)壓泵14停止后，繼續(xù)停止15-20分鐘，隨后負(fù)壓裝置25開啟，時(shí)長為1-2分鐘，直至過濾器22中的所有染色液排空。需指出的是，除了瑞氏-姬姆薩染色液，該步驟中的染色液也可以是細(xì)胞核或/及細(xì)胞漿熒光染色液，較優(yōu)為DAPI、AO、PI、hoechst、sybgreen等染色液，還可以是各種真核細(xì)胞染色液，如，伊紅美藍(lán)染色液。4、濾膜上循環(huán)腫瘤細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體染色(可選)為進(jìn)一步區(qū)分濾膜上白細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞，可選用熒光標(biāo)記的CD45抗體對(duì)濾膜上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行負(fù)選染色。a)在步驟3之前或完成后，暫停負(fù)壓裝置25，再次開啟第一負(fù)壓泵14，同時(shí)開啟熒光標(biāo)記CD45抗體染色液通道閥門12X；b)熒光標(biāo)記CD45抗體染色液在第一負(fù)壓泵14作用下，從熒光標(biāo)記CD45抗體染色液儲(chǔ)樣瓶0X進(jìn)入染色液輸送管道11X，經(jīng)多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個(gè)過濾器22中；c)在負(fù)壓裝置25暫停60-90分鐘后，再次開啟負(fù)壓裝置25，使過濾器22中的熒光標(biāo)記CD45抗體染色液穿過濾膜23，起到對(duì)濾膜23上的細(xì)胞抗體標(biāo)記染色的作用，直至過濾器22中的所有染色液排空。上述步驟中，染色液通道閥門122和第一負(fù)壓泵14的開啟時(shí)長為1分鐘，隨后染色液通道閥門12X關(guān)閉，第一負(fù)壓泵14停止；負(fù)壓裝置25在第一負(fù)壓泵14停止后，繼續(xù)停止60-90分鐘，隨后開啟，時(shí)長為1-2分鐘，直至過濾器22中的所有染色液排空。需指出的是，除了熒光標(biāo)記CD45抗體染色液，該步驟的熒光標(biāo)記抗體染色液還可以根據(jù)待分析組織特性或癌細(xì)胞類型進(jìn)行選擇。5、染色后清洗步驟：該步驟的具體操作與步驟2一致，且清洗次數(shù)為兩次，在此不作贅述。6、膜上細(xì)胞保存步驟(可選)：a)若染色后細(xì)胞并不馬上用于后續(xù)分析，為保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)、染色結(jié)果及細(xì)胞內(nèi)核酸的穩(wěn)定，可采用本步驟；b)在染色后清洗步驟完成后，暫停負(fù)壓裝置25，再次開啟第一負(fù)壓泵14，同時(shí)開啟保存液通道閥門(圖中標(biāo)號(hào)為123)；c)保存液在第一負(fù)壓泵14作用下，從保存液儲(chǔ)樣瓶03進(jìn)入保存液輸送管道113，保存液經(jīng)過多通道連接頭13和試劑分配器15均勻分配到多個(gè)過濾器22中；d)在保存液進(jìn)入過濾器22并可覆蓋濾膜23后，關(guān)閉所有負(fù)壓泵以及負(fù)壓裝置，用濾過液輸送管密封夾26和溢流管密封夾33進(jìn)行封閉，封閉后，將整個(gè)過濾器22取下，在過濾器頂部塞入密封塞27后，將過濾器22置于4-25℃保存；e)上述步驟中，保存液可為任何可溶于水或乙醇的封片劑，較優(yōu)為抗熒光淬滅封片液、甘油、甘油與水或其他緩沖液按不同比例混合的溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醇與水或其他緩沖液按不同比例混合的溶液等；f)采用本步驟保存后的細(xì)胞，在進(jìn)行后續(xù)計(jì)數(shù)及提純分析前，可優(yōu)選再次采用清洗步驟1次，所用清洗液可為清洗步驟中給的中性等滲透緩沖液或乙醇，以降低保存液對(duì)后續(xù)分析造成干擾的可能性。7、膜上循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)及提純步驟：a)為了對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，將染色后的濾膜23從過濾器22中取出，平鋪在干凈的載玻片或襯膜上，然后放入數(shù)字病理掃描設(shè)備中，選用合適波長對(duì)濾膜進(jìn)行掃描，由于染色后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血液中有核血細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)及表面熒光標(biāo)記上存在很大差異，可方便區(qū)分，因此可對(duì)掃描后的結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)分析；b)掃描結(jié)束后將濾膜放在襯膜上，然后在激光顯微切割儀下將循環(huán)腫瘤細(xì)胞用激光切割下來，并分別收集在不同離心管中，用于后續(xù)分子生物學(xué)分析；c)對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞周圍的可疑有核血細(xì)胞，為防止其對(duì)切割后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)分析造成干擾(有核血細(xì)胞非常容易對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)分析造成顯著干擾)，創(chuàng)新性的采用切割前單光束大功率激光擊穿技術(shù)，破壞可疑細(xì)胞及核酸分子，最大限度的防止非特異性擴(kuò)增和干擾。試驗(yàn)例對(duì)以上述的高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法同時(shí)處理多個(gè)樣本液，測(cè)定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的截留率及平行性，具體操作方法如下：S1：將預(yù)定量的1000個(gè)人宮頸癌HeLa細(xì)胞投加到2ml磷酸緩沖液中，然后按本實(shí)用新型操作方法上機(jī)過濾，同時(shí)測(cè)定10個(gè)相同樣本；S2：過濾后用數(shù)字病理系統(tǒng)和計(jì)數(shù)分析軟件對(duì)膜上細(xì)胞進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，細(xì)胞截留率＝(膜上計(jì)數(shù)結(jié)果/1000)×100％.結(jié)果顯示(請(qǐng)參見表1)，利用本實(shí)用新型設(shè)備和方法可對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行處理，細(xì)胞截留率均高于75％，且樣本間平行性好。表1：同時(shí)處理多個(gè)樣本時(shí)腫瘤細(xì)胞的截留率及平行性過濾器編號(hào)1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#細(xì)胞截留率78.2％75.9％79.3％80.6％76.7％76.1％78.9％79.1％81.3％75.1％此外，在圖2中，示出了利用本實(shí)用新型的設(shè)備獲取和提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的結(jié)果：被黑色曲線圈出的部分是截留在濾膜上的循環(huán)腫瘤微栓；右側(cè)小圖是采用切割前單光束大功率激光擊穿技術(shù)破壞了周邊可疑有核血細(xì)胞后，用顯微切割技術(shù)提純的循環(huán)腫瘤微栓；通過圖2可以看出，本實(shí)用新型提供的這種提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了較好的截留效果。綜上，本實(shí)用新型提供的該裝置，在樣本液透過濾膜的過程中，樣本液所含的循環(huán)腫瘤細(xì)胞由于其體積較其他血液細(xì)胞大，進(jìn)而會(huì)被濾膜截留，實(shí)現(xiàn)了高通量快速捕獲提純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的效果；由于將樣本液輸入到過濾器以及負(fù)壓裝置都可以自動(dòng)控制，因此濾膜截留循環(huán)腫瘤細(xì)胞的過程具有自動(dòng)化程度高，高通量(通過增加過濾器數(shù)量即可實(shí)現(xiàn))等效果。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本實(shí)用新型的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本實(shí)用新型各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3