本發(fā)明涉及一種體外纖維化模型、其制造方法以及用途。

背景技術(shù)：

目前，在全世界范圍內(nèi)有500萬名以上的人因纖維化(fibrosis)而備受痛楚，每年10萬名的新患者被診斷為纖維化，每年4萬名的患者因纖維化而死亡。

纖維化的特征在于，引發(fā)器官的功能障礙及死亡的結(jié)合組織的過度的發(fā)育。纖維化通常對如腎、肝、肺、心臟、皮膚或骨髓等多樣的器官產(chǎn)生影響。在這些當(dāng)中，包含腎小管間質(zhì)性纖維化或腎小球硬化癥在內(nèi)的腎臟纖維化難以治療，且被認(rèn)為是非可逆的。

另外，作為針對纖維化的實驗動物模型，已知有如下方法：給小鼠中投入博來霉素，或者通過遺傳轉(zhuǎn)化而制造肺纖維化等動物模型，，然而目前為止尚不知道用于在體外系統(tǒng)中研究纖維性組織并開發(fā)治療劑的模型。因此，為了開發(fā)纖維化治療劑而需要開發(fā)一種體外纖維化模型，其理想地模擬生物體內(nèi)環(huán)境，并表現(xiàn)出纖維化病理學(xué)特性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明之一形態(tài)旨在提供一種體外(invitro)纖維化模型，其包括由間充質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞集合體(cellcluster)，所述細(xì)胞集合體表現(xiàn)出纖維化病理學(xué)特征。

本發(fā)明的另一形態(tài)旨在提供一種體外纖維化模型的制造方法，包括如下步驟：將間充質(zhì)細(xì)胞黏著于表面呈現(xiàn)疏水性的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)而形成細(xì)胞集合體；以及將上述形成的細(xì)胞集合體至少額外培養(yǎng)12小時以上，從而在所述細(xì)胞集合體形成纖維化病理學(xué)特征。

本發(fā)明的又一形態(tài)旨在提供一種纖維化治療劑的篩選方法，包括如下步驟：對所述體外纖維化模型處理被檢測物質(zhì)；以及在所述體外纖維化模型的細(xì)胞集合體或所述細(xì)胞集合體內(nèi)的細(xì)胞中，與無處理對照組進行比較，從而將表現(xiàn)出改善或治療纖維化的病理學(xué)特征的被檢測物質(zhì)作為用于治療纖維化的候選物質(zhì)而進行選擇。

技術(shù)方案

本發(fā)明之一形態(tài)提供一種體外(invitro)纖維化模型，其包括由間充質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞集合體(cellcluster)，所述細(xì)胞集合體表現(xiàn)出纖維化的病理學(xué)特征。

在本說明書中，術(shù)語“間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymalcells)”作為可自我增殖并可分化為多樣的系統(tǒng)(lineages)的多功能性干細(xì)胞，其可以表示能夠分化成占據(jù)中胚層和內(nèi)胚層之間的塑性的組織；結(jié)合組織、真皮、皮下組織、骨、軟骨、骨髓、骨骼肌、平滑肌、心肌、血液細(xì)胞、淋巴結(jié)、淋巴管、血管、脾臟、胃等的未分化細(xì)胞。所述間充質(zhì)細(xì)胞可以是從例如包含人類等的哺乳動物之類的對象體中分離的細(xì)胞，其可以包括脂肪干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells)、間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。所述細(xì)胞中提及的術(shù)語“分離”可表示在與自然發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境不同的環(huán)境中存在的細(xì)胞。例如，如果細(xì)胞自然發(fā)生于多細(xì)胞器官，而且所述細(xì)胞從多細(xì)胞器官被去除，則細(xì)胞可謂是“分離”的細(xì)胞。

術(shù)語“細(xì)胞集合體(cellcluster)”或“三維細(xì)胞集合體”(與“細(xì)胞組織體”互換而使用)是指2個以上的細(xì)胞密集的狀態(tài)，既可以是組織狀態(tài)，也可以是單細(xì)胞狀態(tài)。各個細(xì)胞集合體可作為組織本身或局部、或者單細(xì)胞的集合體而存在，且可以包括由間充質(zhì)細(xì)胞分化的類細(xì)胞組織體。并且，術(shù)語“三維(three-dimension)”可表示并非二維而是具有幾何學(xué)的三個參數(shù)(例如，深度、寬度、高度或者x、y、z軸)模型的立體，因此，根據(jù)一個具體例的由間充質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞集合體可表示如下的細(xì)胞集合體：三維培養(yǎng)，即從培養(yǎng)容器中脫附而以浮游狀態(tài)被培養(yǎng)，且隨著細(xì)胞增殖而具有立體的球形、片(sheet)狀或者與之相似的三維形態(tài)(例如，類組織體)。所述細(xì)胞集合體的直徑為300μm以上，例如可以是300至2000μm、400至1500μm、400至1000μm。而且，所述細(xì)胞集合體可包括由間充質(zhì)細(xì)胞分化的血管細(xì)胞，例如可包括2×10⁴至1×10⁵細(xì)胞/cm²的血管細(xì)胞。

從所述間充質(zhì)細(xì)胞向細(xì)胞集合體的分化可按如下方式進行分化：將所述間充質(zhì)細(xì)胞黏著于表面呈現(xiàn)疏水性的培養(yǎng)容器中而進行培養(yǎng)。具體而言，如果將所述間充質(zhì)細(xì)胞黏著于表面呈現(xiàn)疏水性的培養(yǎng)容器中而進行培養(yǎng)，則隨著所述黏著的間充質(zhì)細(xì)胞的密度增加，間充質(zhì)細(xì)胞從培養(yǎng)容器中脫附而形成細(xì)胞集合體。并且，所述培養(yǎng)可以是如下的培養(yǎng)：在由間充質(zhì)細(xì)胞分化成細(xì)胞集合體之后，至少再培養(yǎng)12小時以上，或者至少再培養(yǎng)1日以上，例如再培養(yǎng)了12小時至15日、1日至15日、3日至10日、3日至7日或者5日至7日。通過上述培養(yǎng)而形成細(xì)胞集合體的方法將會在后面詳細(xì)說明。

所述纖維化的病理學(xué)特征可包括纖維化-特異性或者非特異性癥狀、纖維化-特異性或者非特異性的組織學(xué)形態(tài)特性、分子生物學(xué)特性、或者病理學(xué)特性。例如，纖維化的病理學(xué)特征可包括從由如下的病變組成的群中選擇的一種或者其組合：比無纖維化的細(xì)胞或組織形成過度的結(jié)合組織；膠原的沉積；纖維化相關(guān)分子的表達、分泌或合成的增加；以及細(xì)胞的死亡增加。所述纖維化相關(guān)分子可包括纖維化-特異性或者非特異性的標(biāo)記基因或者蛋白質(zhì)，例如，可以是從由tgf(transforminggrowthfactor)-β、smad、層粘連蛋白及sma(smoothmuscleactin)組成的群中選擇的一種以上。所述tgf-β可包括tgf-β1、2或3，所述smad可包括smad1至8、r-smad、co-smad或i-smad。所述sma作為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記，在纖維化中，膠原的沉積可因肌成纖維細(xì)胞而產(chǎn)生。因此，根據(jù)一個具體例的所述細(xì)胞集合體或所述細(xì)胞集合體內(nèi)的細(xì)胞可表現(xiàn)出如上所述的纖維化的病理學(xué)特征。

在本說明書中，術(shù)語“纖維化(fibrosis)”可表示在器官或組織形成過多的纖維性結(jié)合組織。所述纖維化可包括從由如下的癥狀組成的群中選擇的任意一種：特發(fā)性肺纖維化(ipf)、肺纖維化、間質(zhì)性肺疾病、非特異性間質(zhì)性肺炎(nsip)、普通型間質(zhì)性肺炎(uip)、心內(nèi)膜心肌纖維化、縱膈纖維化、骨髓纖維化、后腹膜纖維化、進行性腫塊纖維化、腎源性全身纖維化、克羅恩病、陳舊性心肌梗塞癥、皮膚硬化癥/全身硬化癥、神經(jīng)纖維瘤癥、hermansky-pudlak綜合征、糖尿腎病癥、腎纖維化、肥厚型心肌病癥(hcm)、高血壓相關(guān)腎病癥、腎小管間質(zhì)性纖維化、腎小球硬化癥(fsgs)、輻射誘導(dǎo)纖維化、子宮肌瘤(fibroids)、酒精性肝病、脂肪肝癥、肝纖維化、肝硬化癥、c型肝炎病毒(hcv)感染、慢性器官移植排斥、皮膚的纖維性疾病、疙瘩疤痕、杜普伊特倫攣縮、ehlers-danlos綜合征、營養(yǎng)障礙性表皮水皰癥、口腔黏膜下纖維化、以及纖維增生障礙。

由于根據(jù)一個具體例的從間充質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞集合體是以三維方式培養(yǎng)的產(chǎn)物，因此可理想地模擬生物體內(nèi)環(huán)境，并表現(xiàn)出纖維化的表現(xiàn)型即纖維化中表現(xiàn)的病理學(xué)特性，因此可在體外纖維化模型中有效地使用。在本說明書中，術(shù)語“纖維化模型(fibrosismodel)”可表示將具有纖維化的器官、組織或細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或形狀模式化的模型，其可以表示為了闡明具有纖維化的器官、組織或細(xì)胞間的交互作用、結(jié)構(gòu)或形態(tài)之間的關(guān)聯(lián)性而考慮的纖維化模型。因此，纖維化模型可以是如下的模型：表現(xiàn)出纖維化-特異性或非特異性的表現(xiàn)型、表現(xiàn)出纖維化-特異性或非特異性的標(biāo)記基因或蛋白質(zhì)的表達。

本發(fā)明的另一形態(tài)提供一種體外(invitro)纖維化模型的制造方法，包括如下步驟：將間充質(zhì)細(xì)胞黏著于表面呈現(xiàn)疏水性的培養(yǎng)容器中而培養(yǎng)并形成細(xì)胞集合體；以及將所述形成的細(xì)胞集合體至少額外培養(yǎng)12小時以上，從而使所述細(xì)胞集合體形成纖維化的病理學(xué)特征。

與所述間充質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞集合體及纖維化相關(guān)的內(nèi)容，與上面記載的內(nèi)容相同。

所述間充質(zhì)細(xì)胞可通過與疏水性表面之間的細(xì)胞-基質(zhì)間交互作用而黏著于培養(yǎng)容器。所述間充質(zhì)細(xì)胞(例如，脂肪干細(xì)胞)例如可從人類脂肪組織中分離，人類脂肪組織可包括成熟的脂肪細(xì)胞及包圍它的結(jié)締組織，且可以從患者自身或者表現(xiàn)型一致的他人處容易獲得。此時，與體內(nèi)位置無關(guān)地，可以使用借助于采取脂肪時使用的所有方法而獲取的所有脂肪組織，例如，可包括皮下脂肪組織、骨髓脂肪組織、腸系膜脂肪組織、胃脂肪組織或后腹膜脂肪組織?？赏ㄟ^公知的方法而從所述人類脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞。例如，如同國際專利公開第wo2000/53795號及第wo2005/04273號中披露，通過脂肪吸入(liposuction)、沉積、膠原酶(collagenase)等酶處理、借助于離心分離的紅血球等浮游細(xì)胞去除等過程而從脂肪組織獲取。此外，可通過公知方法而從多樣的組織分離間充質(zhì)細(xì)胞，例如間充質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。

對于如上所述地分離的間充質(zhì)細(xì)胞而言，即使進行數(shù)次的傳代培養(yǎng)，也直到傳代數(shù)(passagenumber)達到16為止表現(xiàn)出優(yōu)良的增殖率。因此，從人類組織分離的多能間充質(zhì)細(xì)胞可在隨后的三維細(xì)胞集合體形成中直接使用1傳代培養(yǎng)細(xì)胞，或者使用在60％稠密度(confluency)下培養(yǎng)了10傳代以上的細(xì)胞。

如果將如上所述地制備的間充質(zhì)細(xì)胞接種到表面呈現(xiàn)疏水性的培養(yǎng)容器而培養(yǎng)，則因培養(yǎng)容器的疏水性表面而在間充質(zhì)細(xì)胞與培養(yǎng)容器之間形成細(xì)胞-基質(zhì)間交互作用，因此間充質(zhì)細(xì)胞借助于物理吸附而在黏著于培養(yǎng)容器表面的狀態(tài)下增殖。然后，對于形成所述細(xì)胞集合體的步驟而言，隨著所述黏著的間充質(zhì)細(xì)胞的密度增加，間充質(zhì)細(xì)胞從培養(yǎng)容器中脫附，從而可以形成細(xì)胞集合體。

適于本發(fā)明的表面呈現(xiàn)疏水性的培養(yǎng)容器可以是如下的培養(yǎng)容器：在普通的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，用賦予疏水性的高分子進行表面處理，或者由上述高分子進行制造。作為這樣的疏水性高分子，例如可以是：聚苯乙烯(polystyrene)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚氯乙烯(pvc)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚四氟乙烯(ptfe)、作為脂肪族聚酯高分子的聚(l-乳酸)(plla)、聚(d,l-乳酸)(pdlla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(己內(nèi)酯)(pcl)、聚(羥基烷酸酯)、聚二惡烷酮(pds)、聚三亞甲基碳酸酯中選擇的一種、或者作為以其為單位的共聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)、聚(l-乳酸-co-己內(nèi)酯)(plcl)、聚(羥基乙酸-co-己內(nèi)酯)(pgcl)、或者其衍生物等。并且，培養(yǎng)容器可具有如下的表面：由疏水性表面硅烷化的表面(silanizedsurface)、碳納米管(cnt)表面、涂覆有烴的表面(hydrocarboncoatedsurface)、或者金屬(例如，不銹鋼、鈦、金、鉑等)表面。

而且，在本發(fā)明的另一具體例中，為了比間充質(zhì)細(xì)胞與疏水性培養(yǎng)容器表面之間的交互作用所引起的物理吸附更加有效地將間充質(zhì)細(xì)胞黏著于培養(yǎng)容器，可借助于與針對間充質(zhì)細(xì)胞具有黏著活性的生長因子之間的交互作用而黏著于培養(yǎng)容器。例如，在將所述生長因子固定于培養(yǎng)容器表面之后，可利用固定的生長因子與間充質(zhì)細(xì)胞之間的生化學(xué)交互作用。

所述生長因子可包括對間充質(zhì)細(xì)胞具有黏著活性的生長因子，作為其例，可包括血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)、表皮生長因子(egf)、血小板誘導(dǎo)內(nèi)皮生長因子(pdgf)、肝細(xì)胞生長因子(hgf)、類胰島素生長因子(igf)或肝素結(jié)合區(qū)域(hbd)等。所述生長因子能夠以5至100μg/ml的濃度固定于培養(yǎng)容器表面。

針對培養(yǎng)容器表面的生長因子的固定化是將多肽固定于固體基質(zhì)表面使使用的方法，其可以通過相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法實現(xiàn)，例如可利用物理吸附、基于非選擇性化學(xué)反應(yīng)的共價鍵等。作為這種固定化方法之例，已知如下方法：在將生物素(biotin)結(jié)合于蛋白質(zhì)之后，將該蛋白質(zhì)應(yīng)用于由鏈霉親和素(streptavidin)或抗生物素蛋白(avidin)處理的固體表面，從而利用生物素-鏈霉親和素/抗生物素蛋白結(jié)合而將蛋白質(zhì)固定；利用等離子體而在基板上集聚活性基團(用于利用化學(xué)鍵而固定蛋白質(zhì)的化學(xué)作用基團)，從而將蛋白質(zhì)固定；利用溶膠-凝膠(sol-gel)法而在固體基板表面形成比表面積充分增加的多孔性溶膠-凝膠薄膜，然后借助于物理吸附而將蛋白質(zhì)固定于所述多孔性薄膜；通過等離子體反應(yīng)而將抗血栓性蛋白質(zhì)固定于聚四氟乙烯(ptfe)表面；將陽離子性氨基酸殘基在2個酶中連續(xù)融合2個以上的酶結(jié)合，從而將蛋白質(zhì)進行固定；利用基質(zhì)而將蛋白質(zhì)固定于與固體狀支撐臺相結(jié)合的疏水性高分子層；在塑料表面利用緩沖成分固定蛋白質(zhì)；在酒精溶液中將蛋白質(zhì)接觸于具有疏水性表面的固體表面，從而將蛋白質(zhì)進行固定。

在一個具體例中，可使用重組方面可實現(xiàn)大量表達及容易精制的多肽鏈而以在所述多肽鏈的羧基末端融合有生長因子的氨基酸末端的多肽鏈-生長因子重組蛋白質(zhì)形態(tài)執(zhí)行固定化。

適于本發(fā)明的多肽鏈(linker)通過其羧基末端而與生長因子的氨基末端結(jié)合，并可通過存在于該氨基末端的疏水性區(qū)域而被吸附于具有疏水性表面的培養(yǎng)容器，可包括如下的多肽鏈：在重組方面可實現(xiàn)大量表達和容易的精制，且不會對間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)生影響。這種多肽鏈可包括：麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(maltose-bindingprotein；mbp)、疏水蛋白(hydrophobin)或疏水性細(xì)胞穿透肽(hydrophobiccellpenetratingpeptides；cpps)等。

如上所述，如果將間充質(zhì)細(xì)胞在表面呈現(xiàn)疏水性的培養(yǎng)容器中借助于細(xì)胞-基質(zhì)間交互作用而物理接觸并培養(yǎng)，或者借助于與固定在所述培養(yǎng)容器表面的生長因子之間的生化學(xué)交互作用而結(jié)合于生長因子的狀態(tài)培養(yǎng)，則在初期能夠以間充質(zhì)細(xì)胞黏著于培養(yǎng)容器表面的狀態(tài)增殖。所述間充質(zhì)細(xì)胞能夠以1×10³至1×10⁷細(xì)胞/cm³的濃度被播種。而且，所述培養(yǎng)溫度可以是35℃至38.5℃，用于形成細(xì)胞集合體的培養(yǎng)期間可以是4小時至2日，例如可以是1日。適于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基為在間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和/或分化中通常使用的培養(yǎng)基，只要包含血清或無血清，則可不加限制地使用，例如可以使用在dmem(dulbeco'smodifiedeaglemedium)、ham'sf12、它們的混合物等中添加血清的培養(yǎng)基。

然后，間充質(zhì)細(xì)胞以黏著于培養(yǎng)容器表面的狀態(tài)增殖，如果在高細(xì)胞密度下細(xì)胞-細(xì)胞間交互作用變得強于細(xì)胞-基質(zhì)間交互作用，則間充質(zhì)細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面脫附，從而以浮游于培養(yǎng)液內(nèi)的狀態(tài)增殖，并相互凝集，從而可以形成肉眼可檢測的大小的浮游的三維細(xì)胞集合體(cellcluster)。

在一個具體例中，在作為表面呈現(xiàn)疏水性而與之對應(yīng)的細(xì)胞黏著相對較弱地發(fā)生的培養(yǎng)容器的由聚苯乙烯制造的非組織細(xì)胞培養(yǎng)用板(non-tissuecultureplate；ntcp)中接種間充質(zhì)細(xì)胞，從而可以誘導(dǎo)三維細(xì)胞集合體的形成。接種到聚苯乙烯ntcp的間充質(zhì)細(xì)胞在初期借助于細(xì)胞-基質(zhì)間交互作用而在板表面被誘導(dǎo)較弱的細(xì)胞黏著，并以黏著的狀態(tài)以二維單層的方式增殖，如果細(xì)胞的密度隨著培養(yǎng)時間的經(jīng)過而提高，則比起細(xì)胞-基質(zhì)間交互作用而言，細(xì)胞-細(xì)胞間交互作用更強地作用，于是以二維單層的方式培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面脫附。此時，可以在初期將間充質(zhì)細(xì)胞以黏著于培養(yǎng)容器表面的狀態(tài)培養(yǎng)，而如果以不從初期開始發(fā)生細(xì)胞黏著而以浮游的狀態(tài)培養(yǎng)，則形成的三維細(xì)胞集合體的大小較小，且可能呈現(xiàn)出大部分的細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。如果將從培養(yǎng)容器脫附的細(xì)胞以浮游于培養(yǎng)液內(nèi)的狀態(tài)更進一步培養(yǎng)，則借助于細(xì)胞-細(xì)胞間交互作用而使細(xì)胞相互凝集，并可能形成三維細(xì)胞集合體。如此形成的三維細(xì)胞集合體中，雖然細(xì)胞在初期較弱地結(jié)合，但卻隨著培養(yǎng)時間的經(jīng)過而借助于細(xì)胞-細(xì)胞間交互作用而使得形成細(xì)胞集合體的細(xì)胞之間的黏著力得到強化，從而可以形成稠密(compact)的三維細(xì)胞集合體。

并且，如果將上述形成的細(xì)胞集合體額外地培養(yǎng)12個小時以上，則細(xì)胞集合體或細(xì)胞集合體內(nèi)的細(xì)胞中，可形成纖維化的病理學(xué)特征。所述額外的培養(yǎng)時間可以是至少12個小時以上、或至少1日以上，例如可以是12小時至15日、1日至15日、3日至10日、3日至7日、或者5日至7日。關(guān)于所述纖維化的病理學(xué)特征，如同上面的記載。

所述三維細(xì)胞集合體能夠以所形成的三維細(xì)胞集合體形態(tài)增殖并分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。如果間充質(zhì)細(xì)胞以三維細(xì)胞集合體形態(tài)得到培養(yǎng)，則隨著細(xì)胞集合體的形成，朝向內(nèi)部的氧穿透減少，因此可能造成低氧狀態(tài)。細(xì)胞集合體內(nèi)部造成的低氧狀態(tài)誘導(dǎo)出對血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化產(chǎn)生影響的多樣的血管新生促進因子的生成，其結(jié)果可以實現(xiàn)向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化。

對于如上所述地將間充質(zhì)細(xì)胞黏著于培養(yǎng)容器表面而培養(yǎng)形成的三維細(xì)胞集合體而言，具有肉眼可檢測的大小，例如具有300μm至2000μm的直徑，從而可借助于過濾或離心分離等方法而容易回收。對于如此回收的三維細(xì)胞集合體而言，借助于利用膠原酶、胰蛋白酶或分散酶(dispase)的酶處理、利用壓力的機械處理、或者它們的并用處理，可將集合體形態(tài)瓦解而以單細(xì)胞形態(tài)使用，或者將三維細(xì)胞集合體形態(tài)直接使用。

本發(fā)明的又一形態(tài)提供一種纖維化治療劑的篩選方法，包括如下步驟：對所述體外纖維化模型處理被檢測物質(zhì)；以及在所述體外纖維化模型的細(xì)胞集合體或所述細(xì)胞集合體內(nèi)的細(xì)胞中，與無處理對照組進行比較，從而將表現(xiàn)出纖維化病理學(xué)特征的改善或治療的被檢測物質(zhì)作為用于治療纖維化的候選物質(zhì)而進行挑選。

關(guān)于所述間充質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞集合體及纖維化的內(nèi)容，與上述內(nèi)容相同。

在上述篩選方法中，被檢測物質(zhì)可以是從由如下的物質(zhì)組成的群中選擇的任意一種：低分子化合物、抗體、反義核苷酸、小干擾rna(shortinterferingrna)、短發(fā)夾rna(shorthairpinrna)、核酸、蛋白質(zhì)、肽、其他提取物及天然物。

并且，在所述篩選方法中，所述纖維化病理學(xué)特征可包括：纖維化-特異性或非特異性的癥狀、纖維化-特異性或非特異性的組織學(xué)形態(tài)特性、分子生物學(xué)特性或病理學(xué)特性。例如，纖維化的病理學(xué)特征可包括從由如下的病變組成的群中選擇的一種或者其組合：比起無纖維化的細(xì)胞或組織而言，形成過度的結(jié)合組織；膠原的沉積；纖維化相關(guān)分子的表達、分泌或合成的增加；以及細(xì)胞的死亡增加。所述纖維化相關(guān)分子可包括纖維化-特異性或非特異性標(biāo)記基因或蛋白質(zhì)，例如可以是從由tgf(transforminggrowthfactor)-β、smad、層粘連蛋白及sma(smoothmuscleactin)所組成的群中選擇的一種以上。所述tgf-β可包括tgf-β1、2或3，所述smad可包括smad1至8、r-smad、co-smad或i-smad。所述sma作為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記，在纖維化中，膠原的沉積可源于肌成纖維細(xì)胞。因此，例如，將所述用于治療纖維化的候選物質(zhì)進行挑選的步驟可以是：被檢測物質(zhì)相較于無處理對照組而在細(xì)胞集合體或細(xì)胞集合體內(nèi)的細(xì)胞的結(jié)合組織的形成、膠原沉積或膠原纖維質(zhì)的厚度減小的情況下、或者增大細(xì)胞的生存率的情況下，將所述被檢測物質(zhì)作為用于治療纖維化的候選物質(zhì)而進行挑選。所述纖維化的表現(xiàn)型，即結(jié)合組織的形成與否、膠原沉積與否或者膠原纖維質(zhì)的厚度測定可借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的h&e染色、mt染色、免疫熒光染色、或免疫組織化學(xué)染色等而確認(rèn)，細(xì)胞的生存率或死亡程度則可借助于ldh試驗或生存/死亡試驗(live/deadassay)而確認(rèn)。而且，當(dāng)所述被檢測物質(zhì)使纖維化相關(guān)分子即纖維化-特異性或非特異性標(biāo)記基因或蛋白質(zhì)的表達減小或增加時，可將所述被檢測物質(zhì)作為用于治療纖維化的候選物質(zhì)而進行挑選。例如，當(dāng)所述被檢測物質(zhì)使tgf-β、smad、層粘連蛋白或sma的表達減小時，所述被檢測物質(zhì)可作為用于治療纖維化的候選物質(zhì)而得到挑選。用于測定所述表達的方法可包括從由如下的方法組成的群中選擇的任意一種方法：反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(rt-pcr)、酶免疫分析法(elisa)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡法(westernblotting)及流細(xì)胞分析法(facs)。

有益效果

根據(jù)基于一個形態(tài)的體外纖維化模型及其制造方法，可作為三維細(xì)胞集合體而理想地模擬生物體內(nèi)環(huán)境，且表現(xiàn)出纖維化的表現(xiàn)型即在纖維化中呈現(xiàn)出的病理學(xué)特性，因此具有可在纖維化研究或治療劑篩選方法中有效地使用的技術(shù)效果。

附圖說明

圖1a為表示根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的掃描電子顯微鏡圖像的照片。

圖1b為表示根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的h&e染色結(jié)果的照片。

圖2是將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的低氧狀態(tài)用免疫熒光染色確認(rèn)的結(jié)果的圖。

圖3為表示根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的tgf-β表達的圖。

圖4為表示根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的纖維化相關(guān)因子的表達的圖。

圖5a為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的膠原沉積用免疫熒光染色及羥脯氨酸含量分析進行確認(rèn)的結(jié)果的圖。

圖5b為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的膠原沉積用免疫熒光染色及羥脯氨酸含量分析進行確認(rèn)的結(jié)果的曲線圖。

圖6為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的膠原ⅰ型(collagentypei)沉積用免疫熒光染色進行確認(rèn)的結(jié)果的圖。

圖7為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的膠原ⅰ型沉積用免疫化學(xué)染色進行確認(rèn)的結(jié)果的圖。

圖8為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體利用透射電子顯微鏡觀察的圖像的圖。

圖9a為表示對根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的細(xì)胞生存率及死亡進行分析的結(jié)果的圖。

圖9a為表示對根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的細(xì)胞生存率及死亡進行分析的結(jié)果的圖。

具體實施方式

以下，通過實施例更加詳細(xì)地說明本發(fā)明。然而，這些實施例僅用于示例性地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不被這些實施例所限定。

實施例：體外(invitro)纖維化模型的制造及其纖維化模型化特性分析

(1)體外(invitro)纖維化模型的制造

(1.1)人類脂肪干細(xì)胞(humanadiposestemcell:hasc)的分離

將天主教大學(xué)(韓國)整形外科研究室中分配提供的正常人的皮下脂肪組織利用含有1％青霉素/鏈霉素(ps)的pbs洗滌了3次，而將污染的血液去除之后利用手術(shù)用剪刀細(xì)碎地切碎(chopping)。將該脂肪組織浸泡在含有1％bsa(w/v)、0.3％膠原酶類型1及1％ps的組織溶解液(dmem/f-12、welgene)，然后在37℃下攪拌(orbitalshaking)1小時。然后，將上層液體倒除，并將細(xì)胞懸濁液用250μmnitex過濾器(sefaramericainc)進行過濾，從而去除組織碎片(debris)，并以1,000rpm進行了歷時5分鐘的離心分離。針對借助于離心分離收集到的細(xì)胞，在含有10％bsa的dmem/f-12中進行了再次懸濁。針對分離的1次細(xì)胞，在具有5％co2和95％空氣的37℃的濕潤的大氣中，歷時24小時覆蓋于組織培養(yǎng)燒瓶(tissuecultureflask)。然后，將非貼附性細(xì)胞用相同體積的新鮮的培養(yǎng)基更換而去除。利用相位差顯微鏡觀察了貼附性hasc的形態(tài)，然后對所有實驗使用了5傳代的hasc。

(1.2)源自脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體的制造

為了從所述獲取的脂肪干細(xì)胞制造三維細(xì)胞集合體，將所述脂肪干細(xì)胞在非-組織細(xì)胞培養(yǎng)用96-孔板(non-tissueculturetreated96-wellplate；"ntcp"；為聚苯乙烯材料，表面呈現(xiàn)疏水性；falcon公司)中培養(yǎng)。所述板為涂覆有融合蛋白質(zhì)mbp(maltosebindingprotein)-fgf(fribroblastgrowthfactor)的板，針對涂覆有所述融合蛋白質(zhì)的板，韓國專利第1109125號中已予記載，其全部作為參考而被包含于本說明書。具體而言，在所述孔板中接種了每孔對應(yīng)1×10⁵細(xì)胞/cm³的脂肪干細(xì)胞，然后在含有10％fbs的dmem/f-12培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)24小時以內(nèi)，在各個細(xì)胞黏著表面中形成了脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體。為了針對所述形成的三維細(xì)胞集合體的纖維化模型特性分析，收集了培養(yǎng)第一天(1day)、第三天(3day)及第五天(5day)的三維細(xì)胞集合體。而且，所述三維細(xì)胞集合體被確認(rèn)為具有約500μm以上的直徑。以下，將三維細(xì)胞集合體表示為“3dcm”。

并且，作為比較例，以二維方式培養(yǎng)了脂肪干細(xì)胞。具體而言，在組織細(xì)胞培養(yǎng)用96孔板(tcp)中接種了每孔對應(yīng)1×10⁵細(xì)胞/cm³的的脂肪干細(xì)胞，然后在含有10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基中進行了培養(yǎng)，且與上述三維細(xì)胞集合體相同地，為了分析纖維化模型特性，收集了第一天(1day)、第三天(3day)及第五天(5day)的細(xì)胞。以下，將以二維方式培養(yǎng)的細(xì)胞表示為“2d”。

(2)體外(invitro)纖維化模型的纖維化模型化特性分析

(2.1)源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體的特性分析

為了分析源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體的形態(tài)特性，執(zhí)行了掃描電子顯微鏡及h&e染色。并且，為了確認(rèn)所述三維細(xì)胞集合體內(nèi)部的低氧狀態(tài)，執(zhí)行了免疫染色。

具體而言，為了掃描電子顯微鏡觀察，針對上述收集的三維細(xì)胞集合體，利用2.5％戊二醛而在4℃下歷時2小時進行了固定，并利用脫離子水中1％四氧化鋨(osmiumtetroxide)而進行了后固定。將固定的三維細(xì)胞集合體利用一系列濃度的乙醇(50％、70％、80％、90％及100％)而脫水了2遍。在脫水之后，將三維細(xì)胞集合體在六甲基二硅氮烷(hexamethyldisilazane:hmds)中浸泡了2分鐘，并振動干燥了一天。為了獲得掃描電子顯微鏡圖像，將三維細(xì)胞集合體貼附于貼附性碳膠帶，并利用金而在10ma下歷時60秒進行了濺射鍍膜，在15kv下獲得了圖像，并將其結(jié)果示于圖1a。

并且，為了h&e染色，將所述收集到的三維細(xì)胞集合體歷時30分鐘而在常溫下用4％pfa固定，并利用一系列濃度的乙醇(50％、70％、80％、90％及100％)予以脫水，并投入到石蠟中。制造出4μm厚度的切片，并利用蘇木精和伊紅(h&e)而進行了染色。將切片去石蠟化，并利用蒸餾水進行水化，然后利用pbs洗滌了三次。然后，歷時10秒而在蘇木精(harris；sigma-aldrich)中浸泡，并在流動的水中歷時10至15分鐘進行了洗滌，并歷時15秒而利用伊紅進行了復(fù)染，然后再次歷時10至15分鐘進行了洗滌。然后，放到滑塊上并利用光學(xué)顯微鏡進行了觀察，其結(jié)果示于圖1b。

而且，為了進行低氧免疫熒光分析，在上述各個培養(yǎng)時間點進行收集之前，將三維細(xì)胞集合體利用0.1ml溶液中的10mmol鹽酸吡哆醇(pimonidazolehydrochloride)(羥基探針(hypoxyprobe^tm-1)套件；hypoxyprobe,usa)而歷時2小時進行了培養(yǎng)。然后，收集三維細(xì)胞集合體，并利用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)而在4℃下歷時30分鐘進行了固定，并在oct化合物(optimalcuttingtemperaturecompound)(4583；sakurafinetekusa,inc.)中進行了包埋。將6μm的冷凍切片利用pbs進行了洗滌，然后為了防止非特異性結(jié)合而利用pbs中4％bsa而歷時1小時進行了培養(yǎng)。哌莫硝唑則借助于一次小鼠抗體(羥基探針)和二次羊抗鼠alexa488抗體(invitrogen)而檢測。并且，為了核染色而使用了dapi(4,5-二氨基-2-苯基吲哚)(vectorlaboratories)。對照組則在相同的條件下以無一次抗體方式執(zhí)行，并利用共聚焦顯微鏡(carlzeiss)進行了觀察，其結(jié)果示于圖2。

圖1為表示根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的掃描電子顯微鏡圖像及h&e染色結(jié)果的圖。

圖2為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的低氧狀態(tài)利用免疫熒光染色確認(rèn)的結(jié)果的圖。

如圖1所示，可以確認(rèn)，培養(yǎng)第一天的三維細(xì)胞集合體的外部表面稠密地表現(xiàn)基于h&e的染色，因此可確認(rèn)借助于纖維性矩陣而使細(xì)胞連接。隨著培養(yǎng)繼續(xù)進行，培養(yǎng)第三天的三維細(xì)胞集合體的細(xì)胞之間的間距減小，培養(yǎng)第五天的三維細(xì)胞集合體的細(xì)胞之間的間距幾乎不存在(箭頭)。

并且，如圖2所示，培養(yǎng)第一天的dapi-染色細(xì)胞在三維細(xì)胞集合體整體中均勻分布，并可確認(rèn)更多的低氧探針陽性細(xì)胞存在于三維細(xì)胞集合體的內(nèi)部。隨著培養(yǎng)繼續(xù)進行，培養(yǎng)第三天的三維細(xì)胞集合體內(nèi)部的低氧探針陽性細(xì)胞增加，而且可以確認(rèn)對于培養(yǎng)第五天的三維細(xì)胞集合體而言，外部的低氧探針陽性細(xì)胞也有所增加。據(jù)此，可知低氧在三維細(xì)胞集合體的內(nèi)部被誘導(dǎo)，且擴散到了外部。其與圖1的結(jié)果相關(guān)，從而可知由于三維細(xì)胞集合體的外部表面的細(xì)胞之間的間距關(guān)閉，從而誘導(dǎo)低氧。在纖維化中，tgf-1為重要的相關(guān)因子，tgf-1在低氧中過度表達。即，如果細(xì)胞與細(xì)胞之間的間距變窄，則細(xì)胞集合體內(nèi)部的氧的供應(yīng)受限，而且tgf-1被誘導(dǎo)而誘發(fā)纖維化。因此，由于上述結(jié)果，可以確認(rèn)對于根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體而言，模型化了纖維化的病理學(xué)特性。

(2.2)源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體的纖維化相關(guān)因子分析

tgf-β為纖維化的主要分子，且因低氧條件而被誘導(dǎo)，為了確認(rèn)在源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體中，纖維化相關(guān)因子是否被表達，對包含tgf-β的纖維化相關(guān)因子執(zhí)行了elisa。

具體而言，為了測定總tgf-β1的量，由正常細(xì)胞ncc(normalcellconcentration)、以二維方式培養(yǎng)的細(xì)胞(2d)、以及三維細(xì)胞集合體(3dcm)制造了培養(yǎng)基。為了將潛在的tgf-β1以免疫反應(yīng)性形態(tài)激活，將培養(yǎng)上層液用1nhcl進行培養(yǎng)，并用1.2nnaoh/0.5mhepes進行中和。使用quantikineelisa人類tgf-β1套件(r&dsystem)而根據(jù)制造商的指示執(zhí)行了試驗。使用multisakn(thermo)而在560nm下測定吸光度，其結(jié)果示于圖3。

并且，為了確認(rèn)三維細(xì)胞集合體的纖維化相關(guān)因子的表達，根據(jù)制造商的指示而利用三唑試藥(invitrogen,usa)從上述收集到的三維細(xì)胞集合體提取了總rna。將提取出的rna溶解于核酸酶去除水，并使用nanodropnd1000分光光度計(spectrophotometer)(thermofisherscientific)而將rna濃度定量化。使用maximertpremix(intron)而根據(jù)制造商的指示執(zhí)行了互補dna合成。從先驅(qū)者(bioneer)購入所有的靶引物而使用。使用abiprism7500(appliedbiosystems)而執(zhí)行了所有聚合酶連鎖反應(yīng)，并使用sybrpremixextaq(takara)而將基因表達水平定量化。使用相對性ct方法(comparativectmethod)而計算出相對基因表達水平，其結(jié)果示于圖4。

圖3為表示根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的tgf-β表達的圖。

圖4為表示根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的纖維化相關(guān)因子的表達的圖。

如圖3和圖4所示，可確認(rèn)，對于源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體而言，比起正常細(xì)胞和2d，包含tgf-β的纖維化相關(guān)因子即層粘連蛋白、sma(smoothmuscleactin)、膠原i型及smad3的表達增加。

(2.3)源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體的膠原沉積分析

為了分析源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體的總膠原沉積，執(zhí)行了免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色、羥脯氨酸(hydroxyproline)定量，并利用透射電子顯微鏡進行了觀察。

具體而言，為了mt染色(massontrichromestaining)，而與所述h&e染色相同地執(zhí)行了前處理，并利用masson'strichrome進行了染色。在三維細(xì)胞集合體中，使用imagej軟件(nih)而對數(shù)字圖像內(nèi)的被染色的膠原面積的像素數(shù)進行了計數(shù)，從而確定了三維細(xì)胞集合體中的纖維化百分比，其結(jié)果示于圖5a。而且，為了執(zhí)行羥脯氨酸試驗，使用ripa緩沖物而準(zhǔn)備了以二維方式培養(yǎng)的細(xì)胞和三維細(xì)胞集合體，并利用12nhcl而在120℃下歷時3小時執(zhí)行了水解。根據(jù)制造商的指示，使用羥脯氨酸套件(sigma-aldrich)執(zhí)行了試驗。使用multisakn(thermo)而在560nm下測量了吸光度，其結(jié)果示于圖5b。

并且，為了免疫熒光染色(immunofluorescence；if)，如同所述h&e染色，固定住三維細(xì)胞集合體，并包埋于oct化合物(optimalcuttingtemperaturecompound)(4583；sakurafinetekusa,inc.)，且在-28℃下凍結(jié)并以6μm厚度截切。為了避免非特異性結(jié)合，將切片在常溫下歷時1小時而在bsa(4％)下進行培養(yǎng)。然后，在4℃下利用針對膠原i的一次抗體(rabit,abicam)而進行了一夜的培養(yǎng)。然后，利用pbs洗滌了試料，然后用1％bsa內(nèi)的相應(yīng)的熒光共軛二次抗體(donkeyanti-rabbit)(lifetechnologies)而歷時1小時而在常溫下進行了培養(yǎng)。而且，將dapi(4,5-二脒基-2-苯基吲哚)(vectorlaboratories)用于核染色。對照群則在相同的條件下以無一次抗體方式執(zhí)行，并利用共聚焦顯微鏡(carlzeiss)進行了觀察，其結(jié)果示于圖6。

而且，為了免疫組織化學(xué)染色，與所述h&e染色相同地進行了前處理。分別使用小鼠單克隆抗體和fn及l(fā)n所對應(yīng)的山羊多克隆抗體(santacruzbiotechnology)而檢測出纖維連接蛋白(fn)和層粘連蛋白(ln)。為了αsma分析，使用小鼠單克隆抗體(dako)而進行檢測。在4℃下分別用它們的一次抗體進行了一夜的培養(yǎng)，然后利用辣根標(biāo)記抗鼠(horseradishlabelledanti-mouse)(fn和αsma)及抗羊(ln)二次抗體(vector)而在常溫下歷時1小時培養(yǎng)了切片。陽性染色則利用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)(dab,vector)而進行了視覺化。陰性對照組則在相同的條件下以無一次抗體方式執(zhí)行。利用蘇木精而復(fù)染切片，并在普通的光學(xué)顯微鏡下觀察，其結(jié)果示于圖7。

并且，為了透射電子顯微鏡觀察，如同所述掃描電子顯微鏡觀察，對試料進行了前處理。附加地，將固定的三維細(xì)胞集合體利用環(huán)氧樹脂(epoxyresin)進行了浸潤，并包埋，且在60℃下歷時24小時進行了聚合。利用超薄切片機(ultramicrotome)(ultracutc,leicaco.ltd)制造超薄切片，并利用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行了染色。使用凍結(jié)tem(cryotecanaif20,feico.ltd)觀察了圖像，其結(jié)果示于圖8。

圖5為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的膠原沉積利用免疫熒光染色和羥脯氨酸含量分析進行確認(rèn)的結(jié)果的圖。

圖6為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的膠原ⅰ型沉積利用免疫熒光染色進行確認(rèn)的結(jié)果的圖。

圖7為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的膠原ⅰ型沉積利用免疫化學(xué)染色進行確認(rèn)的結(jié)果的圖。

圖8為表示將根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體利用透射電子顯微鏡進行觀察的圖像的圖。

如圖5所示，可確認(rèn)在mt染色中膠原在三維細(xì)胞集合體中被染色了眾多，并可確認(rèn)羥脯氨酸含量也比起用二維方式培養(yǎng)的細(xì)胞而言在三維細(xì)胞集合體中增加。

并且，如圖6所示，可確認(rèn)在免疫熒光染色中膠原i型在三維細(xì)胞集合體中顯著增加。

并且，如圖7所示，可確認(rèn)免疫化學(xué)染色中αsma在三維細(xì)胞集合體中顯著增加。αsma作為肌成纖維細(xì)胞的典型標(biāo)記，膠原i型在纖維化中由肌成纖維細(xì)胞合成，因此可知上述結(jié)果與圖6的結(jié)果一致。

而且，如圖8所示，可確認(rèn)如下的事實：在透射電子顯微鏡圖像中，隨著三維細(xì)胞集合體中培養(yǎng)期間變長，膠原纖維質(zhì)(fiber)和膠原沉積漸進地增加。具體而言，更厚的膠原纖維質(zhì)在培養(yǎng)第五天被觀察(箭頭)，這源于膠原的交聯(lián)。并且可確認(rèn)，在培養(yǎng)第五天，三維細(xì)胞集合體的內(nèi)部的如初的細(xì)胞結(jié)構(gòu)幾乎無法被觀察到?；谏鲜鼋Y(jié)果，沿著細(xì)胞周圍，膠原纖維質(zhì)變得更厚，而且這迎接營養(yǎng)成分的輸送而引起細(xì)胞死亡，因此可確認(rèn)，根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體模型化纖維化的病理學(xué)特性。

(2.4)源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體的細(xì)胞生存率及死亡分析

膠原沉積在纖維化中最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此為了確認(rèn)這樣的特性是否在源于脂肪干細(xì)胞的三維細(xì)胞集合體中也出現(xiàn)，執(zhí)行了ldh試驗和生存/死亡試驗(live/deadassay)。

具體而言，為了執(zhí)行l(wèi)dh試驗，測定了正常細(xì)胞ncc(normalcellconcentration)、以二維方式培養(yǎng)的細(xì)胞(2d)及三維細(xì)胞集合體(3dcm)培養(yǎng)基中的絕對性乳酸脫氫酶(ldh)釋放。使用ldh試驗套件(promega)而根據(jù)制造商的指示執(zhí)行了上述測定。使用multisakn(thermo)而在490nm下測定了吸光度，其結(jié)果示于圖9a。并且，根據(jù)制造商的指示，使用生存/死亡試驗套件(molecularprobes)而執(zhí)行了生存/死亡試驗。簡而言之，將收集到的三維細(xì)胞集合體利用含有1μl的綠色熒光核酸染色溶液(syto10)和1μl的紅色熒光染色溶液(ethidiumhomodimer-2)的1ml的hepes-緩沖鹽水(hbss)進行了處理，并在co2培養(yǎng)器中歷時30分鐘進行了培養(yǎng)。然后，將三維細(xì)胞集合體利用pbs而洗滌了3遍，并歷時30分鐘而用4％pfa進行固定，且包埋于oct化合物(optimalcuttingtemperaturecompound)(4583；sakurafinetekusa,inc.)，并在-28℃下凍結(jié)并以10μm厚度切割。將整個三維細(xì)胞集合體完全截切，并從各個試料的中間和外側(cè)部挑選擇出2個滑塊。使用共聚焦顯微鏡(carlzeiss)而分析了切片，其結(jié)果示于圖9b。

圖9為表示對根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體的細(xì)胞生存率和死亡進行分析結(jié)果的圖。

如圖9a所示，可確認(rèn)，在ldh試驗中，三維細(xì)胞集合體比起正常培養(yǎng)細(xì)胞和2d而言ldh水平有所增加。而且，如圖9b所示，與圖9a的結(jié)果一致地，在三維細(xì)胞集合體中細(xì)胞死亡以視覺方式得到驗證。

基于以上結(jié)果可知，根據(jù)一個具體例的三維細(xì)胞集合體表現(xiàn)出纖維化的病理學(xué)特性，因此可作為體外(invitro)纖維化模型有效地使用。