本發(fā)明涉及一種三維成纖維細胞集合體、該細胞集合體的生產(chǎn)方法、包含該細胞集合體的體外三維皮膚真皮模型以及使用該細胞集合體而篩選藥物的方法。

背景技術：

近來，細胞治療技術作為難治疾病等的治療的新領域而受到矚目。目前為止，為了治療人類的難治疾病，提出了臟器移植或基因治療等，但由于免疫排斥、供應臟器不足、載體開發(fā)或疾病基因相關知識的不足，未能完成有效的實用化。

于是，對于細胞治療技術的關心高漲，且將從生物體內分離的細胞在生物體外進行增殖并移植的技術正在商用化，人工皮膚、軟骨或纖維組織的重建等的實用化在持續(xù)進行。成纖維細胞為用于生產(chǎn)并維持間質性細胞外基質(ecm)的細胞，成纖維細胞通過細胞外基質而有機地連接。并且，成纖維細胞作為生產(chǎn)免疫防御用的多樣的細胞因子及生理活性因子的細胞而廣為人知。

為了將這樣的成纖維細胞作為細胞治療劑或組織工程學素材而靈活利用，以二維方式培養(yǎng)成纖維細胞而大量增殖之后利用胰蛋白酶之類的酶進行了處理，然而在這樣的成纖維細胞中，在將生成的細胞外基質分解而移植的步驟中無法期待細胞外基質的作用。作為組織工程學技術，利用可生物分解的合成高分子或天然高分子，并利用被稱為支架的人工三維多孔性細胞外基質，而用于將包含成纖維細胞在內的多樣的細胞培養(yǎng)成三維細胞集合體的研究曾展開。然而，其中卻存在著生物分解速度或炎癥反應等素材的限制，因此難以實現(xiàn)商用化，于是需要一種誘導形成三維細胞集合體的技術。

另一方面，人體的皮膚組織大體分為三個部分，即由形成皮膚的最外側的表皮層、其下層的真皮層、以及皮下組織所構成。其中，表皮層由從用于使表皮層與真皮層得以牢固結合的基底膜(basementmembrane)分化為多層的上皮細胞以及所述上皮細胞外的黑色素細胞、免疫細胞構成。表皮層下方的真皮層主要由成纖維細胞及該細胞所分泌的多種細胞外基質(extracellularmatrix)構成。真皮層與皮膚健康及老化密切相關，這一點已周知。

膠原作為占據(jù)真皮層的90％的主要蛋白質，用于維持皮膚結合組織，并提供皮膚彈力。通常，隨著外界因素及年齡的增加，成纖維細胞的數(shù)量和功能減少，這被周知為是老化的主要原因。細胞的減少引發(fā)皮膚組織中的纖維質成分合成及水分的損失、以及角質層的變化。而且，膠原酶的增加使交聯(lián)形態(tài)的膠原減少，這使皮膚的光滑、水分及彈力減小。膠原含量及合成增加意味著皮膚的水分及彈力的增加。

皮膚基質內的膠原的分解和合成借助于作為蛋白酶的基質金屬蛋白酶(mmp；matrixmetalloproteinase)而得到調節(jié)。根據(jù)結構和功能性特性，mmp分為多個種類。i型膠原作為皮膚的典型膠原，由于mmp-1的作用而分解。mmp-1活性借助于為了維持皮膚的穩(wěn)態(tài)而分泌的timp-1之類的抑制劑而得到調節(jié)。mmps和timps之類的生物分子由包含成纖維細胞在內的細胞而分泌。而且，mmp-1分解細胞外基質，并據(jù)此促進腫瘤轉移及進展?；趍mp-1的膠原合成及分解在癌的轉移中起到重要作用。因此，將mmp-1/膠原作為靶的藥物和物質作為癌治療劑或化妝品組合物的目的得到開發(fā)。

并且，已經(jīng)周知mmp在例如關節(jié)炎之類的炎癥性疾病或者例如癌轉移之類的癌癥等病理學條件下過表達，將mmp作為靶的mmp抑制劑被作為如上所述的疾病的治療劑得到開發(fā)。

如上所述的用于篩選將mmp或膠原作為靶的藥物的基于2d細胞的試驗，然而基于2d細胞的試驗因藥物的敏感度、對細胞及組織的藥物滲透問題而存在局限性，且不宜用于準確預測存活生命體的反應。而且，由于上述皮膚的結構、功能方面的復雜性，利用一個種類的皮膚細胞的皮膚研究具有限度，為了克服此而開發(fā)的三維結構的皮膚模型即為人工皮膚，然而現(xiàn)有的人工皮膚卻存在著難以高速篩選藥物的局限性。因此，如果想要快速篩選(high-throughput)藥物，則需要開發(fā)一種可用于皮膚環(huán)境仿真的新型皮膚模型系統(tǒng)。

技術實現(xiàn)要素：

技術問題

本發(fā)明之一形態(tài)旨在提供一種用于生產(chǎn)成纖維細胞集合體的方法，包括如下的步驟：將成纖維細胞在培養(yǎng)容器中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而獲得包含有因成纖維細胞從表面脫離而形成的成纖維細胞集合體(fibroblastcluster)的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)容器具備涂覆有蛋白質的所述表面，所述蛋白質具有結合于成纖維細胞的活性；以及從所述培養(yǎng)物中分離成纖維細胞集合體，其中，具有結合于所述成纖維細胞的活性的蛋白質以比成纖維細胞與成纖維細胞之間的結合更弱的方式結合于成纖維細胞。

本發(fā)明的另一形態(tài)旨在提供一種通過上述方法制造的成纖維細胞集合體。

本發(fā)明的又一形態(tài)旨在提供一種包括由成纖維細胞培養(yǎng)成的成纖維細胞集合體的體外(invitro)三維皮膚真皮模型，。

本發(fā)明的其他形態(tài)旨在提供一種用于制造體外三維人工皮膚模型的方法，包括如下步驟：將成纖維細胞在培養(yǎng)容器中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而獲得包含有因成纖維細胞從表面脫離而形成的成纖維細胞集合體(fibroblastcluster)的培養(yǎng)物，其中，所述培養(yǎng)容器具備涂覆有蛋白質的所述表面，所述蛋白質具有與成纖維細胞結合的活性，具有所述成纖維細胞結合的活性的蛋白質以比成纖維細胞與成纖維細胞之間的結合更弱的方式結合于成纖維細胞；以及將源自所述培養(yǎng)物的成纖維細胞集合體額外培養(yǎng)至少12個小時。

本發(fā)明的其他形態(tài)旨在提供一種用于篩選使mmp的表達或活性減少的物質的方法，包括如下步驟：對所述成纖維細胞集合體或體外三維皮膚真皮模型處理被檢測物質；將處理所述被檢測物質的成纖維細胞集合體或皮膚真皮模型的mmp的表達或活性的水平進行測量；將測量的mmp的表達或活性的水平與無處理對照組的水平進行比較；以及將使mmp的表達或活性相對于對照組而言降低的物質進行篩選。

本發(fā)明的又一不同的形態(tài)旨在提供一種用于篩選使膠原的表達或活性增加的物質的方法，包括如下步驟：對所述成纖維細胞集合體或體外三維皮膚真皮模型處理被檢測物質；將處理所述被檢測物質的成纖維細胞集合體或皮膚真皮模型的膠原的表達或活性的水平進行測量；將測量的膠原的表達或活性的水平與無處理對照組的水平進行比較；以及將使膠原的表達或活性相對于對照組而言增加的物質進行篩選。

技術方案

根據(jù)本發(fā)明之一形態(tài)，提供一種用于生產(chǎn)成纖維細胞集合體的方法，包括如下的步驟：將成纖維細胞在培養(yǎng)容器中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而獲得包含有因成纖維細胞從表面脫離而形成的成纖維細胞集合體(fibroblastcluster)的培養(yǎng)物，其中，所述培養(yǎng)容器具備涂覆有蛋白質的所述表面，所述蛋白質具有與成纖維細胞結合的活性；以及從所述培養(yǎng)物分離成纖維細胞集合體，其中，具有與所述成纖維細胞結合的活性的蛋白質以比成纖維細胞與成纖維細胞之間的結合更弱的方式結合于成纖維細胞。

根據(jù)本發(fā)明的另一形態(tài)，提供一種用于形成成纖維細胞集合體的培養(yǎng)容器，其以如下方式構成：成纖維細胞在培養(yǎng)基中黏著于培養(yǎng)容器的表面，所述表面涂覆有蛋白質，所述蛋白質具有與成纖維細胞結合的活性，其中，具有與所述成纖維細胞結合的活性的蛋白質以比成纖維細胞與成纖維細胞之間的結合更弱的方式結合于成纖維細胞。

在本發(fā)明中，術語“成纖維細胞(fibroblast)”(與“纖維細胞”互換使用)為用于構成纖維性結合組織的成分的細胞，可表示哺乳動物的結合組織的細胞。成纖維細胞可用于生產(chǎn)細胞外基質和膠原，且可以起到治愈傷口的作用，例如用于治療皮膚的傷疤、燒傷、褥瘡或創(chuàng)傷。

術語“成纖維細胞集合體(fibroblastcluster)”或“三維成纖維細胞集合體”(與“成纖維細胞組織體”互換使用)表示2個以上的細胞密集的狀態(tài)，且既可以是組織狀態(tài)，也可以是單個細胞狀態(tài)。各個細胞集合體可作為組織本身或局部，或單一細胞的集合體而存在，且可以包括成纖維細胞類似-組織體。而且，術語“三維(three-dimension)”可表示非二次元的、具有幾何學3個參數(shù)(例如深度、寬度、高度或x、y、z軸)模型的立體，因此根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體可表示如下的成纖維細胞集合體：得到三維培養(yǎng)，即在培養(yǎng)容器中脫附而以浮游狀態(tài)培養(yǎng)，從而隨著細胞增殖而具有立體的球形、片(sheet)狀或者與之類似的三維形態(tài)(例如，類似組織體)。并且，對于根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體而言，無需通過組織工程學技術而使用人工的三維多孔性細胞外基質，例如無需使用片材、水凝膠、膜、支架之類的生物分解性合成高分子或天然高分子支撐體，其意味著可以憑借自身而形成三維成纖維細胞集合體，所述組織工程學技術并非細胞，而是三維基質，其與根據(jù)一具體例的三維成纖維細胞集合體存在區(qū)別。

所述成纖維細胞的向培養(yǎng)容器中的播種可包括為了在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)成纖維細胞而執(zhí)行的所有行為，其中包括：將成纖維細胞添加到培養(yǎng)容器；或者將成纖維細胞黏著于培養(yǎng)容器。

術語“細胞黏著或細胞結合”的含義可包括：細胞與細胞之間的黏著或結合；以及細胞與培養(yǎng)容器或生物材料的表面之間的黏著或者結合。在培養(yǎng)容器或生物體材料的表面發(fā)生的細胞的黏著或結合可具有多樣的機制。例如包括：將生物學識別作為媒介的特異性細胞黏著；以及由靜電或表面能量支配的非特異性細胞黏著。特異性細胞黏著可表示如下的黏著：將作為細胞外基質(extracellularmatrix；ecm)蛋白質的膠原、纖連蛋白(fibronectin)、層粘連蛋白等中存在的特定的肽(例如：arginine-glycine-aspartidacid；rgd)借助于存在于細胞膜的水溶體而予以結合，從而引發(fā)的黏著。非特異性細胞黏著可表示如下的黏著：使具有攜帶電陰性的磷脂的細胞膜所黏著的表面攜帶電陽性，從而誘導細胞的黏著。

培養(yǎng)容器可包括具有疏水性的表面，例如可包括水接觸角為90至150°的表面，且可以是將具有與成纖維細胞黏著或結合的活性的蛋白質涂覆于表面的表面。上述具有改性的表面的培養(yǎng)容器可包括以如下方式誘導的表面：比起細胞-細胞之間的結合而言，細胞-黏著基質(例如，具有與涂覆于培養(yǎng)容器的表面的細胞結合的活性的蛋白質或生長因子)之間的結合更弱。所述成纖維細胞不同于血液細胞，作為黏著于細胞外基質而生育的上皮細胞或間充質細胞之類的黏著依賴性細胞，如果細胞不黏著于黏著基質則誘發(fā)細胞死亡，將這種細胞死亡稱為anokis。對于根據(jù)一個具體例的培養(yǎng)方法而言，在細胞-黏著基質之間的黏著或結合之中，并不誘發(fā)細胞死亡，且將細胞-黏著基質之間的黏著或結合以比細胞-細胞之間的黏著或結合更弱的方式誘導，因此不會培養(yǎng)成二維單層。即，所述成纖維細胞在培養(yǎng)初期被誘導較弱的細胞-黏著基質之間的黏著或結合，并因細胞-細胞之間的黏著或結合被誘導而借助于這樣的細胞之間的結合而形成二維成纖維細胞集合體，且隨著培養(yǎng)時間變長，二維成纖維細胞集合體從培養(yǎng)容器表面脫附或脫離，且脫附或脫離的二維成纖維細胞集合體在培養(yǎng)容器中以浮游狀態(tài)繼續(xù)得到培養(yǎng)，從而可以形成三維成纖維細胞集合體。

為了能夠使細胞-黏著基質(例如，具有與涂覆于培養(yǎng)容器的表面的細胞結合的活性的蛋白質或生長因子)之間的黏著或結合得以比所述細胞-細胞之間的黏著或結合更弱地誘導，將培養(yǎng)容器的表面進行改性的方法可通過使用具有與成纖維細胞結合的活性的蛋白質而進行誘導。

當使用與存在于成纖維細胞的細胞膜的整合素(integrin)結合的蛋白質(例如，膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白等)的情況下，所述細胞-黏著基質之間的黏著或結合被較強地誘導。術語“整合素(integrin)”可表示存在于細胞膜而在細胞黏著于纖連蛋白、膠原等細胞外基質時作用的水溶體分子，且作為由α或β兩個小單元雜2合體構成的膜貫通型糖蛋白質，可包括所有類型的整合素。因此，具有結合于所述成纖維細胞的活性的蛋白質可以在培養(yǎng)基中以比成纖維細胞與纖連蛋白相結合的力度而言更弱地結合于所述成纖維細胞。并且，具有結合于所述成纖維細胞的活性的蛋白質在培養(yǎng)基中以比成纖維細胞與纖連蛋白相結合的力度而言以60至95％的活性結合于所述成纖維細胞，例如，可以是60、70、80、90或95％。因此，具有結合于所述成纖維細胞的活性的蛋白質可包括不與整合素結合的蛋白質。而且，在一個具體例中，所述不與整合素結合的蛋白質可包括與存在于成纖維細胞的細胞膜的硫酸類肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan)相結合的蛋白質。在一個具體例中，與所述硫酸類肝素蛋白多糖結合的蛋白質可以是成纖維細胞生長因子(fgf)。并且，所述蛋白質可以是以5至100μg/ml的濃度固定于培養(yǎng)容器表面的蛋白質。

所述術語“成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor；fgf)”作為生長因子的一個種類，可表示通過刺激成纖維細胞而誘導增殖性的生長因子。成纖維細胞生長因子作為肝素結合(heparin-binding)蛋白質，如上所述，可以與成纖維細胞的硫酸類肝素蛋白多糖相互作用。fgf可包括22個種類，例如可包括：fgf1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。即使種類的名稱不同，只要本領域技術人員可認識到意味著相同蛋白質，則全都可以包含于所述fgf的種類中。例如，fgf11、12、13及14也被周知為“ifgf”，fgf15也被周知為“fgf15/19”。而且，例如fgf1或fgf2可包括“肝素結合生長因子1(heparin-bindinggrowthfactor1；hbgf-1)”或“肝素結合生長因子2(heparin-bindinggrowthfactor2,hbgf-2)”。

針對培養(yǎng)容器表面的具有結合于所述成纖維細胞的活性的蛋白質的固定化用于將多肽固定于固體基質表面，其可以通過相關技術領域中公知的所有方法實現(xiàn)，例如可利用物理性吸附、基于非選擇性化學反應的共價鍵等。作為這種固定化方法的例，可包括如下方法：在將蛋白質結合于生物素(biotin)之后，將該蛋白質應用于用鏈霉親和素(streptavidin)或抗生物素蛋白(avidin)處理的固體表面，從而利用生物素-鏈霉親和素/抗生物素蛋白結合而將蛋白質固定；利用等離子體而在基板上集聚活性基團(用于基于化學鍵而固定蛋白質的化學作用基團)，從而將蛋白質固定；利用溶膠-凝膠(sol-gel)法而在固體基板表面形成比表面積充分增加的多孔性溶膠-凝膠薄膜，然后借助于物理性吸附而將蛋白質固定于所述多孔性薄膜；通過等離子體反應而將抗血栓性蛋白質固定于聚四氟乙烯(ptfe)表面；將陽離子性氨基酸殘基在2個酶中連續(xù)融合2個以上的酶予以結合，從而將蛋白質進行固定；利用基質而將蛋白質固定于與固體狀支撐臺相結合的疏水性高分子層；在塑料表面利用緩沖成分而固定蛋白質；在酒精溶液中將蛋白質接觸于具有疏水性表面的固體表面，從而將蛋白質進行固定。

并且，可使用在重組方面可實現(xiàn)大量表達及容易精制的多肽鏈(link)，以如下的形態(tài)執(zhí)行固定化：在所述多肽鏈的羧基末端融合有生長因子(例如fgf)的氨基酸末端的多肽鏈-生長因子(例如fgf)重組蛋白質形態(tài)。針對所述生長因子，利用多肽鏈而在維持生長因子本來的生物學活性的情況下以重組蛋白質的形態(tài)固定于疏水性表面，然后利用針對固定的生長因子的成纖維細胞的黏著活性而將成纖維細胞黏著于所述表面，從而可以實現(xiàn)成纖維細胞的高效培養(yǎng)。

適于本發(fā)明的多肽鏈通過其羧基末端而與生長因子的氨基末端結合，并可通過存在于該氨基末端的疏水性區(qū)域而被吸附于具有疏水性表面的培養(yǎng)容器，只要在重組方面可實現(xiàn)大量表達和容易的精制，且不對成纖維細胞的培養(yǎng)產(chǎn)生影響，則可以使用任何多肽鏈。作為多肽鏈例如可包括：麥芽糖結合蛋白質(maltose-bindingprotein；mbp)、疏水蛋白(hydrophobin)、疏水性細胞穿透肽(hydrophobiccellpenetratingpeptides；cpps)等。

mbp(ncbigenbankaccessionno.aab59056)可表示如下的膜周邊(periplasm)蛋白質：橫穿大腸桿菌(escherichiacoli)的細胞膜而位于原生質膜空間，并參與到麥芽糖或麥芽糖糊精(maltodextrin)等糖類的向細胞內的移動。mbp主要用于將有用的外來蛋白質以重組蛋白質形態(tài)生產(chǎn)，其從細胞內的基因male解碼而得到制造，且當在克隆的male基因的下部(downstream)插入外來蛋白質的基因而在細胞內表達時，可容易地大量生產(chǎn)2個蛋白質所結合的重組蛋白質。尤其，當旨在表達的蛋白質的大小較小或者其為在其他宿主細胞內穩(wěn)定性降低的外來蛋白質時，如上所述地利用mbp而以重組蛋白質形態(tài)在細胞內予以表達可能有利。如此，由結合有male基因的基因表達的外來蛋白質可利用mbp具有與麥芽糖的結合親和力這一特性而進行分離。例如，使麥芽糖多重化的形態(tài)即涂覆有直鏈淀粉(amylose)的樹脂與細胞破碎液進行反應，并將反應的樹脂數(shù)次洗滌而將污染的其他蛋白質去除，然后添加高濃度的麥芽糖而予以競爭，從而可以簡單地使所期望的蛋白質單獨溶出。

所述mbp-細胞黏著基質(例如生長因子)重組蛋白質可利用業(yè)界通常采用的化學合成或基因重組技術等而制造，并將用于將其表達的性狀轉化細菌在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)，然后由培養(yǎng)液回收重組蛋白質以獲取。將如此獲取的mbp-細胞黏著基質重組蛋白質固定于具有疏水性表面的培養(yǎng)容器的過程不需要特別的處理，而是可以利用位于重組蛋白質多肽鏈的氨基末端的疏水性區(qū)域而借助于與疏水性表面之間的物理性吸附而自發(fā)實現(xiàn)。

而且，可用于使細胞-黏著基質(例如，具有結合于成纖維細胞的活性的蛋白質)之間的黏著或結合比所述細胞-細胞之間的黏著或結合更弱地誘導的方法可以是，利用使成纖維細胞與基質(例如，培養(yǎng)容器的表面)之間的黏著或結合弱化的物質進行處理，從而可以誘導。

所述表面具有疏水性的培養(yǎng)容器，例如具有水接觸角為90至150°的表面的培養(yǎng)容器可以是由對通常的細胞培養(yǎng)容器賦予疏水性的高分子進行表面處理，或者可以是由那樣的高分子制造的細胞培養(yǎng)容器。作為這樣的疏水性高分子，例如可包括但不限于：聚苯乙烯(polystyrene)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚氯乙烯(pvc)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚四氟乙烯(ptfe)、作為脂肪族聚酯高分子的聚(l-乳酸)(plla)、聚(d,l-乳酸)(pdlla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(己內酯)(pcl)、聚(羥基烷酸酯)、聚二惡烷酮(pds)、聚三亞甲基碳酸酯中選擇的一種、或者作為以其為單位的共聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)、聚(l-乳酸-co-己內酯)(plcl)、聚(羥基乙酸-co-己內酯)(pgcl)、其衍生物等。并且，根據(jù)一具體例的適當?shù)呐囵B(yǎng)容器可具有如下的表面：由疏水性表面硅烷化的表面(silanizedsurface)、碳納米管(cnt)表面、涂覆有烴的表面(hydrocarboncoatedsurface)、或者金屬(例如，不銹鋼、鈦、金、鉑等)表面。

在將所述成纖維細胞播種到培養(yǎng)容器之前，所述成纖維細胞可使用傳代增殖的培養(yǎng)細胞。所述傳代增殖的方法可以是將利用公知的方法分離的成纖維細胞以公知的方法傳代增殖的方法。例如，對于所述分離的成纖維細胞而言，可在隨后的三維成纖維細胞集合體的形成中直接使用1傳代培養(yǎng)的細胞，或者使用培養(yǎng)10傳代以上的細胞。

將所述成纖維細胞播種的濃度可以是以1.0×10⁴至2.0×10⁵細胞/cm²的細胞濃度進行的播種。而且，例如，所述細胞濃度可以是7.5×10⁴至1.5×10⁵細胞/cm²或1.25×10⁵細胞/cm²。如果所述細胞的濃度為1.0×10⁴以上，則可以形成三維的細胞集合體，如果其為1.25×10⁵細胞/cm²以上，則可以形成可用肉眼識別的大小的三維細胞集合體。

并且，所述培養(yǎng)期間可以是1日至1星期。適于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基為通常使用于成纖維細胞的培養(yǎng)和/或分化的培養(yǎng)基，只要是含有血清或無血清的培養(yǎng)基，就可以不加限制地使用，例如可以使用dmem(dulbeco'smodifiedeaglemedium)、ham'sf12、在它們的混合物等中添加血清的培養(yǎng)基。

如上所述，成纖維細胞形成三維成纖維細胞集合體的步驟中，借助于細胞-黏著基質之間的結合而在初期形成的二維成纖維細胞集合體從培養(yǎng)容器表面脫附，且脫附的二維成纖維細胞集合體在培養(yǎng)容器中以浮游的狀態(tài)繼續(xù)得到培養(yǎng)，從而可以形成三維細胞集合體。

在培養(yǎng)容器表面通過使成纖維細胞黏著而培養(yǎng)形成的成纖維細胞集合體具有可用肉眼檢測的程度的大小的直徑，因此可以使用移液器而分離，或者可借助于過濾或離心分離等方法而容易地獲取。即，用于由所述培養(yǎng)容器獲取形成的成纖維細胞集合體的步驟可以通過無酶處理方式實現(xiàn)。如此獲取的三維細胞集合體可按如下方式使用：利用膠原酶、胰蛋白酶或中性蛋白酶(dispase)的酶學處理、利用壓力的機械處理或者借助于其并用處理而將集合體形態(tài)瓦解而以單一細胞形態(tài)使用，或者以三維細胞集合體形態(tài)直接使用。

作為其他形態(tài)，提供一種由上述方法制造的成纖維細胞集合體。

關于成纖維細胞集合體的制造方法，如同以上記載。

所述成纖維細胞集合體可以是能夠用肉眼識別的大小的球形或片材，例如可以是直徑為300至2000μm的球形的成纖維細胞集合體，在一個具體例中，可以是300至1000μm。對于所述球形的成纖維細胞集合體的直徑而言，本領域技術人員可借助于根據(jù)一個具體例的培養(yǎng)方法而調節(jié)為肉眼可識別的大小。而且，根據(jù)一個具體例的球形的成纖維細胞集合體可在直徑為400μm以內的范圍內包括3.0×10⁵至1.0×10⁶個纖維細胞。在又一具體例中，所述成纖維細胞集合體可分泌上皮細胞生長因子(egf)、細胞外基質(ecm)或血管內皮生長因子(vegf)。

因此，根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體可作為供應細胞治療劑或者生理活性物質時的細胞源(source)而有效地使用。以下，對所述成纖維細胞集合體的用途進行說明。

根據(jù)另一形態(tài)，提供一種包括根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體的用于皮膚再生或血管新生的細胞治療劑。

而且，提供一種將根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體或者其培養(yǎng)液作為有效成分而包含的皮膚傷疤、燒傷、褥瘡或者缺血性疾病的預防及治療用藥學組合物。

如上所述，成纖維細胞集合體可分泌上皮細胞生長因子、細胞外基質或血管內皮生長因子，因此可以移植到需要它的個體而執(zhí)行作為細胞源的作用，從而可以促進皮膚再生或血管新生。并且，通過促進皮膚再生或血管新生，可在皮膚傷疤、燒傷、褥瘡或缺血性疾病的預防及治療用藥學組合物中也可有效地利用。所述缺血性疾病例如可以是缺血性心臟疾病、缺血性心肌梗塞、缺血性心臟衰竭、缺血性腸炎、缺血性血管疾病、缺血性眼疾病、缺血性網(wǎng)膜癥、缺血性綠內障、缺血性腎衰竭、缺血性禿頭、缺血性中風及缺血性下肢疾病。

根據(jù)一個具體例的細胞治療劑或藥學組合物的給藥量以構成作為有效成分的細胞集合體的成纖維細胞集合體為基準，而可以是1.0×10⁵至1.0×10⁸細胞/kg(體重)或1.0×10⁷至1.0×10⁸細胞/kg(體重)。然而，給藥量因制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病理狀態(tài)、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應感應性之類的要素而多樣的調節(jié)，只要是本領域技術人員則可通過考慮這樣的因素而適當?shù)卣{節(jié)給藥量。給藥次數(shù)可以是1次或者是臨床可允許的副作用范圍內的2次以上，關于給藥部位，可以對1處或2處以上給藥。針對人類以外的動物，每kg以相同于人類的量給藥，或者例如以目的動物與人類之間的器官(心臟等)的容積比(例如平均值)等將所述給藥量換算而以換算量給藥。作為根據(jù)一個具體例的治療的對象動物，可將人類及其以外的作為目的的哺乳動物包含，例如包括人類、猿猴、小鼠、大鼠、兔子、羊、牛、狗、馬、豬等。

根據(jù)一個具體例的細胞治療劑或藥學組合物中，作為有效成分，可包含細胞集合體以及藥學可允許的載體和/或添加物。例如，可包括殺菌水、生理鹽水、慣用的緩沖劑(磷酸、檸檬酸、其他的有機酸等)、穩(wěn)定劑、鹽、抗氧化劑(抗壞血酸等)、界面活性劑、懸濁劑、等滲劑或保存劑等。為了局域給藥，優(yōu)選與生物體高分子(biopolymer)等有機物、羥基磷灰石等無機物、具體而言與膠原基質、聚乳酸聚合物或共聚物、聚二醇聚合物或共聚物及其化學衍生物等進行組合。當根據(jù)一個具體例的細胞治療劑或藥學組合物被制造成適于注射的劑型時，細胞集合體可溶解于藥學可允許的載體中，或者以溶解的溶液狀態(tài)凍結。

根據(jù)一個具體例的細胞治療劑或藥學組合物可根據(jù)其給藥方法或劑型而適當?shù)匕☉覞釀?、溶解輔助劑、穩(wěn)定化劑、等滲劑、保存劑、吸附防止劑、界面活性化劑、稀釋劑、賦形劑、ph調整劑、無痛化劑、緩沖劑、還原劑、抗氧化劑等。包括以上舉例的試劑在內，適于本發(fā)明的藥學可允許的載體及制劑詳細記載于文獻[remington'spharmaceuticalsciences,19thed.,1995]中。

對于根據(jù)一個具體例的細胞治療劑或藥學組合物而言，在根據(jù)本發(fā)明所屬的技術領域中具備基本知識的人員所能夠容易實施的方法，可利用藥學可允許的載體和/或賦形劑予以制劑化，從而以單位容量形態(tài)制造或者內置于多容量容器內而制造。此時，劑型可以是油或水性介質中的溶液、懸濁液或乳化液形態(tài)或者粉末、顆粒、片劑或膠囊形態(tài)。

并且，另一形態(tài)提供一種根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體裝載(loading)于生物分解性高分子支架的組織工程學用支撐體。

如上所述，根據(jù)一個具體例的成纖維細胞可分泌上皮細胞生長因子、細胞外基質或血管內皮生長因子，因此能夠以裝載于支架的狀態(tài)移植到需要它的個體而促進皮膚再生或血管新生。所述組織工程學用支撐體可以是通過成型出生物分解性高分子而制造的支撐體中裝載有成纖維細胞集合體的支撐體。

所述生物分解性高分子在生物體內經(jīng)過預定期間后自發(fā)徐緩分解，其可以包括具備有生物體適合性、血液親和性、防鈣化特性、細胞的營養(yǎng)成分及形成細胞間基質的功能中的一種以上的特性的高分子。這樣的生物分解性高分子的種類在本發(fā)明中并不特別受限定，然而代表性地可以使用纖維蛋白、膠原、明膠、殼聚糖、藻酸鹽(alginate)、透明質酸、葡聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸(poly(glycolicacid),pga)、聚(乳酸-co-羥基乙酸)(poly(lactic-co-glycolicacid),plga)、聚-ε-(己內酯)、聚酐、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚氨酯、聚丙烯酸、聚-n-異丙基丙烯酰胺、聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)共聚物、它們的共聚物、它們的混合物等。此時，復合支撐體中的生物分解性高分子的含量可根據(jù)支撐體的成型觀點或者細胞集合體的裝載觀點而為5至99重量％含量。所述復合支撐體可根據(jù)現(xiàn)有的公知方法成型出生物分解性高分子而制造，所述公知方法例如包括：鹽浸出法(solvent-castingandparticle-leachingtechnique)、氣體發(fā)泡法(gasformingtechnique)、將高分子纖維制造成無紡布而制造成高分子網(wǎng)孔(mesh)的方法(fiberextrusionandfabricformingprocess)、相分離法(thermallyinducedphaseseparationtechnique)、乳化凍結干燥法(emulsionfreezedryingmethod)、高壓氣體膨脹法(highpressuregasexpansion)等。

如上所述地成型制造的支撐體將裝載的細胞集合體傳遞到移植的組織內，并可起到使細胞三維地貼附生長而形成新組織的作用。此時，在細胞貼附生長于復合支撐體的方面，支撐體的孔隙大小和結構可能產(chǎn)生影響，為了使營養(yǎng)液可均勻滲透至支撐體內部而使細胞良好地生長，可具有孔隙相互連接(inter-connecting)的結構。而且，在所述支撐體中，孔隙可具有50至600μm的平均直徑。

作為又一形態(tài)，提供一種包括根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體的藥物篩選用三維培養(yǎng)系統(tǒng)。

所述三維成纖維細胞集合體具有仿真生物體內環(huán)境的人為細胞形態(tài)，其可在實際的細胞形態(tài)及功能研究或治療劑(例如，所述皮膚疾病或血管疾病)等中有效地使用。因此，對于包括所述三維成纖維細胞集合體的藥物篩選用三維培養(yǎng)系統(tǒng)而言，在用于醫(yī)藥品或化妝品等的疾病治療劑功效測試或者炎癥及過敏測試等的實驗中，可取代動物實驗。

作為又一形態(tài)，提供一種包括由成纖維細胞培養(yǎng)成的成纖維細胞集合體的體外(invitro)三維皮膚真皮模型。

作為另一形態(tài)，提供一種包括由成纖維細胞培養(yǎng)成的成纖維細胞集合體的藥物(例如，mmp抑制劑或細胞內膠原的表達或活性增加劑)篩選用體外(invitro)模型。

作為另一形態(tài)，提供一種用于篩選體外三維皮膚真皮模型或者mmp抑制劑或細胞內膠原的表達或活性增加劑的體外模型制造方法，其包括如下的步驟：將成纖維細胞在培養(yǎng)容器中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而獲得包含有因成纖維細胞從表面脫離而形成的成纖維細胞集合體(fibroblastcluster)的培養(yǎng)物，其中，所述培養(yǎng)容器具備涂覆有蛋白質的所述表面，所述蛋白質具有結合于成纖維細胞的活性，具有結合于所述成纖維細胞的活性的蛋白質以比成纖維細胞與成纖維細胞之間的結合更弱的方式結合于成纖維細胞；以及將源自所述培養(yǎng)物中的成纖維細胞集合體額外培養(yǎng)至少12個小時的。

關于所述成纖維細胞集合體及其制造方法的內容，如同上面的記載。

在一個具體例中，本說明書可提供包括由成纖維細胞培養(yǎng)成的成纖維細胞集合體的藥物篩選用組合物或模型。所述藥物可以是皮膚老化改善劑；炎癥性疾病、關節(jié)炎或癌的治療劑。因此，例如，包括由成纖維細胞培養(yǎng)成的成纖維細胞集合體的體外三維皮膚真皮模型可用于篩選皮膚老化改善劑；炎癥性疾病、關節(jié)炎或癌的治療劑。

在一個具體例中，所述成纖維細胞集合體可表現(xiàn)出基于皮膚老化的病理學特性。例如，對于所述成纖維細胞集合體而言，膠原的表達或活性可處于減少的狀態(tài)，或者基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase:mmp)的表達或活性可處于增加的狀態(tài)。所述成纖維細胞集合體可額外地處于纖連蛋白的表達或活性減少的狀態(tài)，或者處于彈性蛋白的表達或活性增加的狀態(tài)。在本說明書中，所述表達或活性的減少或增加可表示如下的含義：比起正常細胞而言，或者比起以二維方式培養(yǎng)的成纖維細胞而言，所述提及的蛋白質或基因的表達或活性處于減少或增加的狀態(tài)。所述膠原可包括膠原類型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii或xiv。而且，所述mmp可包括mmp1至28中的任意一種以上。

如同在上文的背景技術中提到的那樣，所述膠原的減少可引起皮膚組織中的纖維質成分合成及水分的損失、以及角質層的變化。而且，所述膠原可被mmp分解。因此，膠原的表達或活性減少的、或者mmp的表達或活性增加的根據(jù)一具體例的成纖維細胞集合體可在篩選用于改善皮膚老化的藥物的方面有效地使用。例如，用于改善所述皮膚老化的藥物可包括具有皮膚的保濕效果、彈力的增加、皺紋的減少及抗氧化活性的藥物。并且，所述mmp可分解細胞外基質，并據(jù)此促進腫瘤轉移及進展，基于此的膠原合成及分解可在癌轉移中起到作用。而且，mmp在例如關節(jié)炎等炎癥性疾病或者例如癌癥轉移等癌之類的病理學條件下過表達，這已被周知，將mmp作為靶的mmp抑制劑作為上述疾病的治療劑而得到開發(fā)。因此，膠原的表達或活性減小的、或者mmp的表達或活性增加的根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體可在篩選炎癥性疾病、關節(jié)炎或者癌的治療劑時效地使用。所述炎癥性疾病可從如下的疾病構成的群中選擇：皮膚炎、結膜炎、腹膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃體炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、克羅恩病、大腸炎、痔瘡、痛風、強直性脊柱炎、風濕熱、狼瘡、纖維肌痛(fibromyalgia)、銀屑病關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、風濕性關節(jié)呀、肩關節(jié)周圍炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌腱周炎、肌肉炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、干燥綜合征(sjogren'ssyndrome)、多發(fā)性硬化癥、急性及慢性炎癥疾病。而且，所述關節(jié)炎可以是骨關節(jié)炎或風濕性關節(jié)炎。所述癌治療劑不僅包括抑制癌癥本身的細胞增殖的物質，而且還可以包括用于抑制癌的轉移的物質。

由所述成纖維細胞到成纖維細胞集合體的培養(yǎng)可通過將所述成纖維細胞黏著于表面具有疏水性的培養(yǎng)容器而予培養(yǎng)并分化。具體而言，如果將所述成纖維細胞在表面具有疏水性的培養(yǎng)容器中黏著培養(yǎng)，則隨著所述黏著的成纖維細胞的密度增加，成纖維細胞從培養(yǎng)容器中脫附，從而形成成纖維細胞集合體。并且，對于所述培養(yǎng)而言，在培養(yǎng)成成纖維細胞集合體之后，或者在形成成纖維細胞集合體之后，可額外地培養(yǎng)至少12個小時，或者至少1日以上，例如可以額外培養(yǎng)12小時至15日、1日至15日、3日至10日、3日至7日、或者5日至7日。適于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基作為成纖維細胞的培養(yǎng)和/或分化中通常使用的培養(yǎng)基，只要是含有血清或者無血清的就都可用，其不受限制。例如，可以使用dmem(dulbeco'smodifiedeaglemedium)、ham'sf12、以及其混合物等中添加了血清的培養(yǎng)基。上述通過培養(yǎng)而形成細胞集合體的方法的詳細內容將在后面說明。

由根據(jù)一個具體例的成纖維細胞培養(yǎng)成的成纖維細胞集合體由于是三維地培養(yǎng)而成的，因此可以良好地仿真生物體內的環(huán)境，且由于包含細胞外基質，因此可作為體外皮膚真皮模型而有效地使用。在本說明書中，術語“皮膚真皮模型(skindermismodel)”(可以與人工真皮(dermalequivalent)互換使用)可表示將真皮組織或真皮的結構或形狀模式化的模型，且可以表示為了闡明真皮內細胞之間的相互作用、與結構或形態(tài)關聯(lián)性而考慮到的模型。

作為另一形態(tài)，提供一種用于篩選使mmp的表達或活性降低的物質的方法，包括如下的步驟：對所述成纖維細胞集合體或體外三維皮膚真皮模型處理被檢測物質；將所述被檢測物質得到處理的成纖維細胞集合體或皮膚真皮模型的mmp的表達或活性的水平進行測量；將測量的mmp的表達或活性的水平與無處理對照組的水平進行比較；以及將使mmp的表達或活性相對于對照組而言減少的物質進行挑選。

作為又一形態(tài)，提供一種用于篩選使膠原的表達或活性增加的物質的方法，包括如下的步驟：對所述成纖維細胞集合體或體外三維皮膚真皮模型處理被檢測物質；將處理所述被檢測物質的成纖維細胞集合體或皮膚真皮模型的膠原的表達或活性的水平進行測量；將測量的膠原的表達或活性的水平與無處理對照組的水平進行比較；以及將使膠原的表達或活性相對于對照組而言增加的物質進行篩選。

在上述篩選方法中，被檢測物質可以是從由如下的物質構成的組中選擇的任意一種：低分子化合物、抗體、反義核苷酸、短干擾rna(shortinterferingrna)、短發(fā)夾rna(shorthairpinrna)、核酸、蛋白質、肽、其他提取物及天然物。

上述處理被檢測物質的步驟可包括如下的步驟：使所述成纖維細胞集合體或體外三維皮膚真皮模型與被檢測物質接觸。所述接觸例如可包括如下的步驟：在包含有一個以上的成纖維細胞集合體或體外三維皮膚真皮模型的各個孔中，注入包含有預定濃度的被檢測物質的溶液。

所述mmp或膠原的表達或活性水平測量可通過從由如下的方法組成的群中選擇的任意一種方法測量：逆轉錄聚合酶連鎖反應(reversetranscription-polymerasechainreaction,rt-pcr)、酶免疫分析法(elisa)、免疫組織化學、免疫印跡(westernblotting)、免疫沉降(immunoprecipitation)、免疫熒光法(immunofluorescence)及流細胞分析法(facs)。并且，所述mmp或膠原的表達或活性水平的測量可包括對培養(yǎng)液中的分泌的mmp或膠原的含量的測量。所述培養(yǎng)液中膠原的含量測量可通過羥脯氨酸檢測進行測量。

將上述測量的mmp的表達或活性的水平與無處理對照組的水平進行比較，從而可以將促使mmp的表達或活性相對于對照組降低的物質作為mmp的表達或活性抑制劑物質或候選物質而進行挑選。所述促使mmp的表達或活性減少的物質或候選物質可以是皮膚老化改善劑或癌治療劑。并且，可將所述測量的膠原的表達或活性的水平與無處理對照組的水平進行比較，從而將使膠原的表達或活性比對照組增加的物質作為膠原的表達或活性抑制劑物質或候選物質而進行挑選。所述促使膠原的表達或活性減少的物質或者候選物質可以是皮膚老化改善劑或癌治療劑。

在一個具體例中，對于由成纖維細胞培養(yǎng)成的成纖維細胞集合體而言，膠原的表達或活性處于減少的狀態(tài)，或者mmp的表達或活性處于增加的狀態(tài)，因此根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體可有效地使用于篩選與膠原或mmp的表達或活性相關的物質。

在另一具體例中，本說明書包括具有一個以上的孔的孔板，在所述孔中提供一個以上的播種所述成纖維細胞集合體的藥物篩選裝置。關于所述成纖維細胞集合體的內容，如同上面的記載。

并且，提供一種藥物篩選方法，包括如下的步驟：在所述藥物篩選裝置的各個孔中注入包含有候選物質的溶液；將包含有注入了所述候選物質的孔的孔板進行培養(yǎng)；從所述孔板收集所述成纖維細胞集合體，或者從所述孔板回收培養(yǎng)液；由所述收集到的成纖維細胞執(zhí)行試驗，或者由所述培養(yǎng)液執(zhí)行試驗。所述候選物質可以是相同或不同的候選物質。對于所述培養(yǎng)而言，本領域技術人員可確定任意的培養(yǎng)時間和溫度。所述試驗例如可包括：由所述培養(yǎng)液使用elisa的mmp分泌試驗；或者由所述成纖維細胞集合體進行的免疫印跡方法；或者使用到免疫組織化學染色的ecm分泌試驗。

有益效果

根據(jù)基于一個形態(tài)的成纖維細胞集合體或者其制造方法，具有如下的技術效果：可在培養(yǎng)容器中短時間內容易地獲取大量的三維成纖維細胞集合體，并可將圍繞于細胞外基質的三維成纖維細胞集合體作為細胞源而以無纖維細胞損傷的方式利用注射制劑移植到生物體內。

根據(jù)另一形態(tài)的體外三維皮膚真皮模型及利用其篩選藥物的方法則具有如下的技術效果：由于由三維細胞集合體構成，因此能夠理想地模仿具有結構性、功能性方面的復雜性的皮膚的生物體內環(huán)境，不僅如此，可將包括mmp或膠原的與細胞外基質相關的物質高速(high-throughput)篩選。

附圖說明

圖1為示意性圖示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的制作過程的圖。

圖2是將根據(jù)一個具體例的成纖維細胞的細胞黏著率根據(jù)蛋白質量而予以定量化的圖表。

圖3為表示根據(jù)一個具體例的成纖維細胞的細胞形態(tài)熒光染色照片的圖。

圖4為表示根據(jù)一個具體例的成纖維細胞的fak的磷酸化活性的圖。

圖5為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的形成照片的圖。

圖6為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的形成照片的圖。

圖7為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合的h&e染色結果的圖。

圖8為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的第一型膠原免疫熒光學染色結果的圖。

圖9為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的vegf分泌量的圖。

圖10是用顯微鏡觀察根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的形成過程的照片。

圖11為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的細胞外基質相關基因的相對表達量的圖表。

圖12為表示將根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的膠原含量用羥脯氨酸試驗進行測量的結果的圖表。

圖13為表示將根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的膠原i型表達量用免疫染色進行測量的結果的圖。

圖14為表示將根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的膠原i型表達量用免疫印跡試驗進行測量的結果的圖。

圖15為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的mmp1表達量及分泌量的圖表。

圖16為表示對根據(jù)一個具體例的對三維成纖維細胞集合體處理mmp1抑制劑之后的細胞的mmp1分泌量的圖。

圖17為表示為了誘導mmp1過表達而照射了紫外線的、在二維培養(yǎng)的成纖維細胞中處理mmp1抑制劑之后的細胞的mmp1分泌量的圖。

圖18為示意性圖示根據(jù)一個具體例的包含三維成纖維細胞集合體的藥物篩選裝置及使用該裝置篩選藥物的方法的圖。

具體實施方式

以下，對本發(fā)明的實施例進行更加詳細的說明。然而，這些實施例僅用于示例性地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實施例。

實施例1：三維成纖維細胞集合體的形成及其特性分析

在本實施例中，將成纖維細胞在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，從而形成了三維成纖維細胞集合體，所述培養(yǎng)容器具備涂覆有蛋白質的表面，所述蛋白質具有與成纖維細胞結合的活性。

圖1為示意性地表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的制作過程的圖。

參考圖1進行說明。將成纖維細胞播種到涂覆有mbp-fgf2的培養(yǎng)容器。然后，成纖維細胞在培養(yǎng)容器表面以二維方式被培養(yǎng)并脫附，且脫附或脫離的二維成纖維細胞集合體在培養(yǎng)容器中以浮游的狀態(tài)被繼續(xù)培養(yǎng)，從而在1日后開始形成三維成纖維細胞集合體。確認了如下的事實：根據(jù)一個具體例而形成的三維成纖維細胞集合體具有細胞外基質和血管內皮生長因子(vegf)分泌功能。以下，對圖1所示三維成纖維細胞集合體的形成過程及特性分析方法以及結果進行說明。

(1)成纖維細胞的細胞黏著特性及黏著后形態(tài)變化分析

為了構建誘導形成三維成纖維細胞集合體的培養(yǎng)方法，對成纖維細胞的細胞黏著特性、基于黏著基質的細胞黏著信號及細胞形態(tài)進行了分析。

(1.1)成纖維細胞的細胞黏著分析

在非-組織細胞培養(yǎng)用96-孔板(non-tissueculturetreated96-wellplate；"ntcp"；表面因聚苯乙烯材質而呈現(xiàn)疏水性；falcon公司)分別將ecm纖連蛋白(fibronectin)(20μg/ml)、mbp(10μg/ml)、mbp-vegf(10μg/ml)、mbp-hbd(100μg/ml)以及mbp-fgf2(10μg/ml)涂覆4小時，然后用pbs洗滌了3次。然后，利用100μg/mlbsa而密閉1小時，并用pbs洗滌了3次。針對每1孔5x10⁴cells/cm²的成纖維細胞而在無血清dmem培養(yǎng)基中懸浮，然后分別播種到涂覆有蛋白質的96孔板，從而在37℃培養(yǎng)基中溶解給定的1小時，然后觀察了細胞的形態(tài)。利用細胞溶解緩沖物將黏著的細胞溶解，然后借助于bca(bicinchoninicacid)試驗而測量蛋白質，從而將黏著的細胞定量。

圖2為將根據(jù)一個具體例的將成纖維細胞的細胞黏著率基于蛋白質的量而定量化的圖表。

如圖2所示，在利用bsa、mbp及mbp-vegf涂覆的ntcp中沒有出現(xiàn)細胞黏著。另外，在利用mbp-fgf2進行涂覆的ntcp中，在細胞播種之后過了一個小時后，表現(xiàn)出比與細胞膜的整合素結合的ecm-纖連蛋白而言更低的黏著率。

(1.2)基于成纖維細胞的黏著基質的細胞形態(tài)分析

在上述實施例1的(1.1)中，為了比較分別用纖連蛋白和mbp-fgf2涂覆的ntcp中培養(yǎng)的成纖維細胞的細胞形態(tài)，而將黏著之后經(jīng)過30分鐘、1小時、4小時的成纖維細胞利用鬼筆環(huán)肽(palloidin)進行了染色。

圖3為表示根據(jù)一個具體例的成纖維細胞的細胞形態(tài)熒光染色照片的圖。

如圖3所示，可以確認黏著于mbp-fgf2的成纖維細胞比起黏著于纖連蛋白的成纖維細胞而言，細胞骨架并未激活。這意味著黏著于mbp-fgf的成纖維細胞的黏著比黏著于纖連蛋白的成纖維細胞而言，將作為存在于細胞膜的細胞黏著分子的整合素(integrin)作為媒介的細胞黏著活性受限。

(1.3)基于成纖維細胞的黏著基質的細胞黏著信號分析

在所述實施例1的(1.1)中，為了比較分別用纖連蛋白和mbp-fgf2涂覆的ntcp中培養(yǎng)的成纖維細胞的細胞黏著信號，測量了黏著斑激酶(focaladhesionkinase；fak)的磷酸化。為了測量fak的磷酸化，針對黏著后經(jīng)過30分鐘、1小時、4小時的成纖維細胞而利用抗磷酸化-fak-抗體(cellsignalling公司)而執(zhí)行了免疫印跡分析。

圖4為表示根據(jù)一個具體例的成纖維細胞的fak的磷酸化活性的圖。

如圖4所示，可以確認，黏著于mbp-fgf2的成纖維細胞比起黏著于纖連蛋白的成纖維細胞而言，fak的磷酸化未得到激活。這意味著在黏著于mbp-fgf2的成纖維細胞中將整合素作為媒介的細胞黏著活性較低。

(2)三維成纖維細胞集合體的形成

基于實施例1的(1.3)至(1.3)的結果，構建了用于形成三維成纖維細胞集合體的培養(yǎng)方法。

針對成纖維細胞，將用含有高濃度葡萄糖dmem培養(yǎng)基(fgm培養(yǎng)基)的mbp-fgf2涂覆的聚苯乙烯表面可移動的12、24、48及96-孔ntcp的各個孔中以0.5×10⁴細胞/cm²至1.5×10⁵細胞/cm²的細胞濃度進行播種，然后在37℃的靜置培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)了1、2、3日。在培養(yǎng)初期，以片形態(tài)存在的成纖維細胞隨著時間的經(jīng)過而從培養(yǎng)表面脫附，從而在1日之后開始以細胞體形式存在，于是可以在沒有胰蛋白酶之類的酶處理的情況下借助于移液器而容易回收。

圖5為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的形成照片的圖。

如圖5所示，可確認在利用fgm進行培養(yǎng)時，在1.25×10⁵細胞/cm²以上的細胞濃度下誘導高效的三維成纖維細胞集合體的形成。在更低的細胞濃度下，為了細胞-細胞間相互作用而所需的細胞間的距離沒有充分靠近，因此細胞集合體可能無法良好地形成。在并非fgm的培養(yǎng)基中，細胞集合體雖然形成，然而可能需要比在fgm的細胞集合體形成濃度更高的條件。

圖6為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體形成照片的圖。

如圖6所示，可確認，根據(jù)孔大小，在用mbp-fgf2涂覆的表面中形成可通過肉眼檢測的400至1000μm以上大小的三維球形細胞集合體。

(3)三維成纖維細胞集合體的分泌功能分析

(3.1)細胞外基質(ecm)分泌功能分析

在實施例1的(2)中，在用多樣的種類的mbp-fgf2涂覆的孔--ntcp(12、24、48、96-孔)中以1.25×10⁵cells/cm²的細胞濃度播種而形成三維細胞集合體，并利用pbs洗滌數(shù)次，且將4％多聚甲醛在室溫下處理30分鐘而予以固定化。然后，利用多樣的濃度的乙醇(50～100％)而脫水，然后利用石蠟進行了包埋。針對制造的石蠟塊，利用超薄切片機而以4μm厚度切割，并固定于載玻片，然后執(zhí)行了h&e染色及針對纖連蛋白和膠原1型的免疫學染色。膠原1型的染色執(zhí)行了熒光免疫染色。在上述處理中，首先將制備的載玻片在bsa(4％)中處理了1小時，然后浸泡在包含有一次抗體的pbs中而徹夜反應，然后用pbs洗滌了3次，再將其在暗室中與二次抗體反應1小時。在利用dapi而額外執(zhí)行核染色之后，利用共聚焦顯微鏡進行了分析。對照組并未使用一次抗體而執(zhí)行了相同的處理，并進行分析。

圖7為表示對根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體進行h&e染色的結果的圖。

如圖7所示，可確認，在培養(yǎng)1日后在所有孔中以相同的濃度處理的成纖維細胞形成了細胞集合體。

圖8為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的第一型膠原免疫熒光學染色結果的圖。

如圖8所示，可確認膠原在三維成纖維細胞集合體內得到全面染色，據(jù)此可知形成細胞集合體時大量分泌膠原。

(3.2)血管內皮生長因子(vegf)分泌量分析

在實施例1的(2)中，將以1.25×10⁵cells/cm²細胞濃度用mbp-fgf2涂覆的96-孔ntcp進行播種而形成三維細胞集合體回收，從而測量了血管內皮細胞生長因子(vegf)分泌量。

具體而言，將形成的三維細胞集合體以10個為單位聚集而轉移到6-孔ntcp，然后用pbs洗滌了1次。額外地，利用不含有fbs的alphamem(lonza公司)洗滌了1次，然后投入alphamem(1.5ml)，并在靜置培養(yǎng)基中培養(yǎng)了1日。然后，每當?shù)搅祟A先設定的日期則收取培養(yǎng)液，并投入了新的培養(yǎng)液。利用elisa套件(r&d公司)對收取的培養(yǎng)液內存在的vegf進行了定量。套件使用方法則根據(jù)供應公司的方案進行。圖9為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的vegf分泌量的圖。

圖9為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的vegf分泌量的圖。

如圖9所述，可知三維成纖維細胞集合體比起以二維方式培養(yǎng)的細胞而言，vegf量增加了兩倍以上。

實施例2：體外(invitro)三維人工真皮模型的制造及其特性分析

(1)體外三維人工真皮模型的制造

為了制造體外三維人工真皮模型，首先培養(yǎng)了成纖維細胞。具體而言，針對人類真皮成纖維細胞，利用組織培養(yǎng)圓底燒瓶而在37℃、5％co2及95％o2的大氣條件下用高葡萄糖達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(highglucosedulbecco'smodifiedeagle'smedium)(dmem；weljen；韓國大邱)進行了培養(yǎng)。將傳代數(shù)為5的人類真皮成纖維細胞應用于所有實驗。

然后，用于成纖維細胞的三維培養(yǎng)的培養(yǎng)容器以如下方式制作。在非-組織細胞培養(yǎng)用96-孔板(non-tissueculturetreated96-wellplate,"ntcp"；由聚苯乙烯材料形成且表面呈現(xiàn)疏水性；falcon公司)中將mbp(麥芽糖結合蛋白質)-fgf(成纖維細胞生長因子)(20μg/ml)在常溫下涂覆了4小時。然后，用pbs洗滌了3遍，從而去除了沒有結合的mbp-fgf。關于所述培養(yǎng)容器的詳細的制造方法記載于韓國公開專利第10-2010-0122778號，所述文獻的全部作為參考而包含于本說明書。

在所述培養(yǎng)容器播種所述成纖維細胞而制造了三維成纖維細胞集合體。具體而言，以每1孔1.25x10⁵cells/cm²的濃度將成纖維細胞播種到成纖維細胞生長培養(yǎng)基(fgm,lonza)中的所述96孔板，并在37℃下培養(yǎng)。成纖維細胞在培養(yǎng)容器表面以二維方式得到培養(yǎng)并脫附，且脫附或脫離的二維成纖維細胞集合體在培養(yǎng)容器中以浮游狀態(tài)繼續(xù)得到培養(yǎng)，從而在24小時以內自發(fā)形成三維成纖維細胞集合體。將形成的三維成纖維細胞集合體在培養(yǎng)第一日(1day)、第三日(3day)及第五日(5day)分別收集，并將黏著性成纖維細胞的三維成纖維細胞集合體的形成過程用相位差顯微鏡(carlzeiss；德國)進行了觀察，其結果示于圖10。以下，將所述三維成纖維細胞集合體表示為“3dcm”。

并且，作為比較例，以二維方式培養(yǎng)了所述成纖維細胞。具體而言，在組織細胞培養(yǎng)用96-孔板(tcp)中接種每孔對應1.25x10⁵cells/cm²的脂肪干細胞，然后在成纖維細胞生長培養(yǎng)基(fgm,lonza)中進行了培養(yǎng)，為了與所述三維細胞集合體相同地進行人工真皮模型特性分析，在培養(yǎng)第一天(1day)、第三天(3day)及第五天(5day)收集了細胞。以下，將所述以二維方式培養(yǎng)的細胞表示為“2d”。

圖10是用顯微鏡觀察根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的形成過程的照片。

如圖10所示，可確認，形成了肉眼可檢測的400至1000μm以上大小的三維球形細胞集合體。

(2)體外三維人工真皮模型的特性分析

為了對如上所述地制作的三維成纖維細胞集合體的作為人工真皮模型的特性進行分析，執(zhí)行了如下的實驗。

(2.1)三維成纖維細胞集合體的細胞外基質(ecm)基因表達分析

為了對作為細胞外基質相關基因的膠原、纖連蛋白及彈性蛋白的基因表達量進行分析，使用了qrt-pcr(quantitativereal-timepolymerasechainreaction)。

具體而言，在不同的時間(第一天、第三天及第五天)使用qiagenminiprep套件(qiageninc；美國)而根據(jù)制造公司的指示從3dcm和2d提取了總rna。將提取的rna溶解于核酸酶-無添加水中，并使用nanodropnd1000分光光度計(thermofisherscientific)而將rna濃度進行了定量化。使用maximertpremix(intron；韓國)而根據(jù)制造公司的指示執(zhí)行互補dna合成。所有靶引物序列均從bioneer(韓國)購入。使用abiprism7500(appliedbiosystems)而執(zhí)行了所有聚合連鎖反應，使用sybrpremixextaq(takara；日本)而定量化了基因表達水平。使用相對ct方法(comparativectmethod)而計算了相對基因表達水平，其結果示于圖11。

圖11為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的細胞外基質相關基因的相對表達量的圖表。

如圖11所示，可確認膠原1型和纖連蛋白的表達量比2d而言在3dcm中幾乎低了3倍左右，對于彈性蛋白而言，表達量比起2d而言在3dcm中有所增加。尤其，對于彈性蛋白而言，培養(yǎng)第一日的2d與3dcm的表達量類似，然而從培養(yǎng)第三日開始有顯著增加。由于上述結果，根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體模擬了膠原和纖連蛋白的表達減少，且彈性蛋白的表達增加的皮膚真皮的環(huán)境而可知能夠將其有效地使用于將其作為靶的物質的開發(fā)中。

(2.2)三維成纖維細胞集合體的膠原表達量分析

為了分析三維成纖維細胞集合體的膠原，執(zhí)行了羥脯氨酸試驗(hydroxyprolineassay)、免疫染色及免疫印跡。

具體而言，為了羥脯氨酸試驗，使用ripa緩沖器(sigma-aldrich)而在不同的時間(第一日、第三日及第五日)收集了2d、3dcm(3x10⁶細胞)，并在120℃下歷時3小時執(zhí)行了借助12nhcl溶液的水解。試驗通過使用羥脯氨酸試劑套件(sigma-aldrich)而根據(jù)制造商的指示進行。吸光度則使用multisakn(thermo)而在560nm下測量，其結果示于圖12。

為了免疫染色而將在不同的時間收集的所述3dcm和2d用pbs洗滌了三遍，并用4％pfa固定化30分鐘。然后，包埋于oct化合物(optimalcuttingtemperaturecompound)(tissue-tek^￠c4583；sakurafinetekusa,inc.)，并在-28℃下凍結，且以6μm厚度切割。為了避免非特異性結合，將切片在常溫下在bsa(4％)中培養(yǎng)1小時。然后，在4℃下利用針對膠原i的一次抗體(rabit,abicam)而培養(yǎng)一夜。然后，利用pbs洗滌了試料，并用1％bsa內的相應的熒光共軛二次抗體(donkeyanti-rabbit)(lifetechnologies)歷時1小時而在常溫下進行了培養(yǎng)。并且，將dapi(4,5-二氨基-2-苯基吲哚)(vectorlaboratories)使用于核染色。對照組則在相同的條件下以無一次抗體的方式執(zhí)行，并利用共聚焦顯微鏡(carlzeiss)觀察，其結果示于圖13。

為了進行免疫印跡，將通過與如上所述的方法相同的方法培養(yǎng)的細胞與蛋白酶抑制劑混合物(proteaseinhibitorcocktail)一起以ripa緩沖物(sigma-aldrich)進行了可溶化。然后，將所述溶解物在4℃溫度下歷時30分鐘而以15,000g離心分離，并稀釋到包含有2％sds和5％(v/v)2-巰基乙醇的laemmli試料，且在90℃下歷時5分鐘進行了加熱。針對蛋白質，與10％分離膠(resolvinggel)的使用一起用scd-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)進行了分離，并移置于硝化纖維膜(bio-rad；美國)。針對所述膜，與膠原i型(colla1,bosterbioco.ltd)和β-肌動蛋白(santancruzbiotechnology)相關一次抗體一起在4℃下培養(yǎng)了一夜。為了檢測，將所述膜在常溫下歷時1小時而與過氧物酶-共軛抗體(santacruzbiotechnology)一起進行了培養(yǎng)。利用圖像分析器(lsa3000,fujifilm)形成化學發(fā)光圖像而執(zhí)行了掃描，其結果示于圖14。

圖12為表示通過羥脯氨酸試驗測量出根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的膠原含量的結果的圖表。

圖13為表示通過免疫染色測量出根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體的膠原表達量的結果的圖。

圖14為表示通過免疫印跡法測量出根據(jù)一個具體例的成纖維細胞集合體的膠原表達量的結果的圖。

如圖12所示，可確認由3dcm分泌的總膠原量隨著培養(yǎng)時間的變長而增加，且可以確認比起2d而言有所減少。可知上述結果與所述實施例2的(2.1)的結果一致。

而且，如圖13所示，在3dcm中培養(yǎng)的期間內膠原i型染色減少，相反地在2d中卻并不減少。上述結果表示膠原i型在三維培養(yǎng)系統(tǒng)內在培養(yǎng)的期間內分解。

并且，如圖14所示，可確認，與圖12的結果一致地，在3dcm中培養(yǎng)的期間內膠原i型片段化，相反在2d卻并不是那樣。

基于上述結果，可知，根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體中膠原的表達減少，從而能夠在促使膠原的含量增加的候選物質的篩選中有效地使用。

(2.3)三維成纖維細胞集合體的mmp表達分析

為了三維成纖維細胞集合體的基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase:mmp)1的表達分析，執(zhí)行了rt-pcr。rt-pcr以與所述實施例2的(2.1)相同的方法得到執(zhí)行，其結果示于圖15a。

而且，為了分析總mmp-1的分泌量，執(zhí)行了elisa。具體而言，將培養(yǎng)基從2d、3dcm中分別在不同的時間(第一天、第三天及第五天)制造。試驗則使用quantikineelisa人類總mmp1套件(r&dsystem)而根據(jù)制造商的指示執(zhí)行。吸光度則使用multisakn(thermo)而在560nm下測量，其結果示于圖15b。

圖15為表示根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的mmp1表達量及分泌量的圖表。

如圖15所示，可以確認在3dcm中mmp1基因的表達量比2d而言顯著增加。并且，如同elisa分析那樣，mmp1的分泌量也在3dcm中比起2d而言顯著增加。基于上述結果，可知根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體處于mmp的表達顯著增加的狀態(tài)，因此可將其有效地用于將其作為靶的物質的開發(fā)中。

(3)利用三維成纖維細胞集合體的mmp抑制劑的抑制功能評估

在本實施例中，為了額外地確認所述三維成纖維細胞集合體是否可使用于mmp抑制劑的篩選，對目前已知的mmp抑制劑進行了處理，從而確認了mmp的分泌量。

具體而言，在所述實施例2的(1)中制作的培養(yǎng)第一日的三維成纖維細胞集合體中接種了稀釋到成纖維細胞生長培養(yǎng)基(fibroblastgrowthmedia,fgm,lonza公司)的維甲酸(retinoicacid)(10mm)、松香酸(abieticacid)(100mm)、變形生長因子-β1(transforminggrowthfactor-b1,tgf-b1)(5ng/ml)。然后，額外地，37℃2日、4日之后，在靜置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液回收，從而測量了基質金屬蛋白分解酶-1(matrixmetalloproteinase-1,mmp1)的分泌量。測量則利用了elisa套件(r&d公司)進行定量，使用方法則根據(jù)供應商的方案進行，其結果示于圖16。

作為三維成纖維細胞集合體的對照組，為了利用以二維方式培養(yǎng)的成纖維細胞的mmp抑制劑的抑制功能進行比較，使用了照射紫外線b的成纖維細胞。具體而言，在組織細胞培養(yǎng)用6-孔板(tissueculturetreated6-wellplate)中以2.5x10⁵細胞/cm²細胞濃度將懸浮的成纖維細胞播種到高濃度葡萄糖dmem培養(yǎng)基，然后在37℃靜置培養(yǎng)基中培養(yǎng)了1日。然后，用pbs反復洗滌了3次，并投入無血清mem培養(yǎng)基，且在37℃靜置培養(yǎng)基中歷時1小時培養(yǎng)。另外，利用pbs反復洗滌了3次，然后為了誘導mmp1的過表達而照射了紫外線b(20mj/cm²)。在照射紫外線之后，接種了稀釋到成纖維細胞生長培養(yǎng)基(fibroblastgrowthmedia,fgm,lonza公司)的多種濃度的維甲酸(2,10,40mm)、松香酸(20,100,400mm)、tgf-b1(1,5,20,ng/ml)，然后額外地在37℃下在靜置培養(yǎng)基中培養(yǎng)了2日，然后將培養(yǎng)液回收，從而測量出mmp1分泌量。測量則利用elisa套件(r&d公司)而定量化，使用方法則按照供應商的方案而進行，其結果示于圖17。

圖16為表示對根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體處理了mmp1抑制劑之后的細胞的mmp1分泌量的圖。

圖17為表示對為了誘導mmp1過表達而照射了紫外線的、以二維方式培養(yǎng)的成纖維細胞處理了mmp1抑制劑之后的細胞的mmp1分泌量的圖。

如圖16所示，對于沒有處理mmp1抑制劑的成纖維細胞集合體而言，隨著培養(yǎng)時間經(jīng)過2、4日，mmp1的分泌量分別增加了2.1倍、2.4倍。相反地，對于處理了維甲酸和松香酸的成纖維細胞而言，相對于對照組而言分別表現(xiàn)出約為80％、81％的分泌量，處理了tgf-b1的組的分泌量則表現(xiàn)為60％左右。

如圖17所示，以二維方式培養(yǎng)的照射了紫外線b的成纖維細胞比起未照射的成纖維細胞而言大致表現(xiàn)出高出1.3倍左右的mmp1分泌量。然而，處理了維甲酸的成纖維細胞則比對照組而言mmp1分泌量約減少為30％，且與tgf-b1處理組比較時，根據(jù)處理量而減少為25～35％。尤其，對于處理了松香酸的成纖維細胞而言，在20mm處理時減少了約一半的分泌量，然而對于處理了100mm以上的情形而言，卻比起對照組而言表現(xiàn)出約為2％的分泌量。與利用3dcm評估的結果相比，抑制劑處理時分泌量減少的傾向相同。然而，相比2d的mmp抑制劑的對照組而言減少的幅度與3dcm相比而言，維甲酸處理組表現(xiàn)為高出2.7倍，tgf-b1表現(xiàn)為高出1.7至2.4倍，松香酸表現(xiàn)為高出1.7至40倍。

基于上述結果，對于2d而言，對于藥物的細胞的靈敏度顯著高，因此不適合于藥物篩選，并可知3dcm能夠在包含mmp抑制劑的藥物的篩選中有效地使用。

圖18是將包含根據(jù)一個具體例的三維成纖維細胞集合體的藥物篩選裝置及利用該裝置而篩選藥物的方法示意性地表示的圖。參考圖18而進行說明。提供一種如下的藥物篩選裝置，包括具有一個以上的孔的孔板，所述孔中播種有根據(jù)一個以上的具體例的三維成纖維細胞集合體。所述三維成纖維細胞集合體中，各個細胞集合體可分別包括3.0×10⁵至1.0×10⁶個的細胞。并且，細胞集合體的直徑可以是300至2000μm，形狀則可以是球形(包括球體)或片狀。所述藥物即候選物質相關內容如上文所述。并提供一種如下的藥物篩選方法，包括如下的步驟：將包含候選物質的溶液注入到所述藥物篩選裝置的各個孔；將包含有上述注入了候選物質的孔的孔板進行培養(yǎng)；從所述孔板收集所述三維成纖維細胞集合體，或者從所述孔板中回收培養(yǎng)液；由所述收集的成纖維細胞執(zhí)行試驗，或者由所述培養(yǎng)液執(zhí)行試驗。所述候選物質可以是相同或不同的候選物質。關于所述培養(yǎng)，本領域技術人員可任意地確定培養(yǎng)時間和溫度。所述試驗例如可包括由所述培養(yǎng)液使用elisa的mmp分泌試驗、或者由所述三維成纖維細胞集合體使用免疫印跡方法或免疫組織化學染色的ecm分泌試驗。