本發(fā)明是關于式(i)的新穎(r)-2-甲基-哌嗪衍生物及其作為醫(yī)藥的用途。本發(fā)明亦是關于相關方面，包括制備該等化合物的方法、含有一或多種式(i)化合物的醫(yī)藥組合物及尤其其作為cxcr3受體調(diào)節(jié)劑的用途。趨化因子受體是一組以高親和力結(jié)合肽趨化因子配體的g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)。趨化因子受體的主要功能是在休眠條件下以及在發(fā)炎期間引導白血球運動至淋巴器官及組織，但亦已識別某些趨化因子受體對非造血細胞及其祖先的作用。趨化因子受體cxcr3是結(jié)合至發(fā)炎性趨化因子cxcl9的g蛋白偶聯(lián)受體(初始稱為mig、干擾素-γ[inf-γ]誘導的單核因子)、cxcl10(ip-10，inf-γ-誘導蛋白10)及cxcl11(i-tac，inf-γ-誘導的t細胞α化學引誘劑)。cxcr3主要表現(xiàn)于活化t輔助細胞1型(th1)淋巴球，但亦存在于天然殺傷細胞、巨噬細胞、樹突細胞及b淋巴球的子組上。三種cxcr3配體主要在發(fā)炎性條件下表現(xiàn)，極少在健康組織中表現(xiàn)。例如暴露于發(fā)炎性細胞因子(例如干擾素-γ或tnf-α)后可表現(xiàn)cxcr3配體的細胞包括各種各樣的基質(zhì)細胞(例如內(nèi)皮細胞、纖維母細胞、上皮細胞、角質(zhì)細胞)，且亦包括造血細胞(例如巨噬細胞及單核球)。cxcr3與其配體(在下文中稱為cxcr3軸)的相互作用涉及引導受體攜載細胞至體內(nèi)的特定位置、具體地至發(fā)炎、免疫損傷及免疫功能失調(diào)的位點且亦與組織損害、細胞凋亡的誘導、細胞生長及血管生成抑制相關聯(lián)。cxcr3及其配體上調(diào)且高度表現(xiàn)于各種各樣的病理情況中，包括自體免疫病癥、發(fā)炎、感染、移植排斥、纖維化、神經(jīng)變性及癌癥。cxcr3軸在自體免疫病癥中的作用已由若干臨床前及臨床觀察結(jié)果證實。其中發(fā)炎性病變的組織學分析或患者的血清含量揭示cxcr3配體含量升高或cxcr3陽性細胞的數(shù)量增加的自體免疫病癥包括類風濕性關節(jié)炎(ra)、全身性紅斑狼瘡(sle)、狼瘡性腎炎、多發(fā)性硬化(ms)、發(fā)炎性腸病(ibd；包含克羅恩氏病(crohn’sdisease)及潰瘍性結(jié)腸炎)及i型糖尿病(groom,j.r.及l(fā)uster,a.d.immunolcellbiol2011,89,207；groom,j.r.及l(fā)uster,a.d.expcellres2011,317,620；lacotte,s.、brun,s.、muller,s.及dumortier,h.annnyacadsci2009,1173,310)。由于cxcr3配體的表現(xiàn)在健康組織中極低，因此上文所列舉的相關證據(jù)強烈地表明cxcr3在人類自體免疫疾病中的作用。利用cxcr3缺陷小鼠(缺乏cxcr3配體中的一者或使用阻斷cxcr3或其配體中的一者的功能的抗體的小鼠)的臨床前疾病模型進一步證實cxcr3軸在免疫病理學中的作用。例如，已顯示缺乏cxcr3或cxcr3配體cxcl9的小鼠在狼瘡性腎炎的模型中顯示降低的病理學(menke,j.等人，jamsocnephrol2008,19,1177)。在腎炎的另一形式間質(zhì)性膀胱炎的動物模型中，施用阻斷cxcl10功能的抗體顯示降低環(huán)磷酰胺誘導的膀胱炎的病理學(sakthivel,s.k.等人，jimmunebasedthervaccines2008,6,6)。類似地，在類風濕性關節(jié)炎的大鼠模型中利用抗體阻斷cxcl10降低病理學(mohan,k.及issekutz,t.b.jimmunol2007,179,8463)。類似地，在發(fā)炎性腸病的鼠科動物模型中，針對cxcl10的阻斷抗體將在治療性環(huán)境中防止病理學(singh,u.p.等人，jinterferoncytokineres2008,28,31)。此外，利用來自cxcr3缺陷小鼠的組織實施的實驗表明cxcr3在乳糜瀉(另一種自體免疫型病癥)中的作用(lammers,k.m.等人，gastroenterology2008,135,194)。與cxcr3軸的升高表現(xiàn)相關聯(lián)的發(fā)炎疾病包括慢性阻塞性肺病(copd)、氣喘、類肉瘤病、動脈粥樣硬化及心肌炎(groom,j.r.及l(fā)uster,a.d.immunolcellbiol2011,89,207；groom,j.r.及l(fā)uster,a.d.expcellres2011,317,620)。一個研究已顯示，在患有copd的吸煙者的肺中與健康個體相比cxcr3陽性細胞增加，且在患有copd的吸煙者的支氣管上皮呈現(xiàn)cxcr3-配體cxcl10的免疫反應性，但在吸煙及不吸煙對照個體的支氣管上皮中未呈現(xiàn)(saetta,m.等人，amjrespircritcaremed2002,165,1404)。該等發(fā)現(xiàn)表明，cxcr3軸可涉及患有copd的吸煙者的外周氣道中發(fā)生的免疫細胞募集。與該等觀察結(jié)果一致，copd的臨床前研究揭露在cxcr3缺陷小鼠中香煙煙霧誘導的急性肺炎衰減(nie,l.等人，respirres2008,9,82)。在動脈粥樣硬化的一個研究中，在動脈粥樣硬化病變內(nèi)在所有t細胞上皆發(fā)現(xiàn)cxcr3表現(xiàn)。cxcr3配體cxcl9、cxcl10及cxcl11皆在與該等病變相關的內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞中發(fā)現(xiàn)，此表明該等涉及在動脈粥樣硬化形成期間在血管壁病變內(nèi)觀察到的cxcr3陽性細胞、具體地活化t淋巴球的募集及滯留(mach,f.等人，jclininvest1999,104,1041)。臨床前研究進一步支持cxcr3在動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用。在缺乏apoe的小鼠中cxcr3遺傳缺失在腹部大動脈內(nèi)產(chǎn)生顯著降低的動脈粥樣硬化病變發(fā)展(veillard,n.r.等人，circulation2005,112,870)。cxcr3軸的關鍵作用亦已在器官移植后的排斥反應及骨髓移植相關毒性中表明(groom,j.r.及l(fā)uster,a.d.expcellres2011,317,620)。臨床前，cxcr3缺陷小鼠顯示顯著耐同種異體移植物排斥性(hancock,w.w.等人，jexpmed2000,192,1515)。cxcr3配體血漿濃度亦與各種各樣的肝臟病理(包括人類的肝硬化及纖維化)正相關(tacke,f.,等人，liverint2011,31,840)。在腫瘤學領域中，已建議阻斷cxcr3軸幫助限制癌癥細胞轉(zhuǎn)移擴散。例如，施用小分子cxcr3受體拮抗劑amg487可限制腫瘤細胞至肺的轉(zhuǎn)移(pradelli,e.等人，intjcancer2009,125,2586)。cxcr3在調(diào)控b細胞慢性淋巴球性白血病(cll)中的作用的功能證據(jù)已由trentin及合作者報導(trentin,l.等人，jclininvest1999,104,115)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，阻斷cxcr3軸可具有有益作用且防止神經(jīng)變性。cxcl10在cns中的表現(xiàn)增加已在局部缺血、阿茲海默氏病(alzheimer’sdisease)、多發(fā)性硬化(ms)及人類免疫缺陷病毒(hiv)-腦炎中證明。例如，離體實驗已顯示與源自野生型小鼠的組織相比，源自cxcr3或cxcl10缺陷小鼠的組織的神經(jīng)元細胞死亡在神經(jīng)毒性nmda治療之后減少(vanweering,h.r.等人，hippocampus2011,21,220)。在期望鑒別在亨廷頓氏病(huntington’sdisease)模型中提供對抗htt片段誘導的神經(jīng)變性的神經(jīng)保護的藥物類分子的研究，鑒別出兩種cxcr3受體拮抗劑(reinhart,p.h.等人，neurobioldis2011,43,248)。作為cxcr3受體調(diào)節(jié)劑的4-噻唑基-六氫吡啶衍生物已在wo2007/064553及wo2007/070433中揭示。作為cxcr3受體調(diào)節(jié)劑的不同1-(哌嗪-1-基)-2-雜芳基-乙酮衍生物已在wo2007/100610、wo2010/126811、wo2013/114332、wo2015/011099、wo2015/145322中及在海報展示上(a.prokopowicz等人，optimizationofabiarylseriesofcxcr3antagonists,第244屆acs國際會議,philadelphia,us,2012年8月19日至23日)揭示?，F(xiàn)已在hergq-patch分析中發(fā)現(xiàn)式(i)的(r)-2-甲基-哌嗪衍生物是具有驚奇地改良的性質(zhì)的有效cxcr3調(diào)節(jié)劑，該分析指示qt延長的風險有所降低。該等衍生物可用于治療經(jīng)由cxcr3軸介導或維持的疾病，包括自體免疫病癥(例如類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、發(fā)炎性腸病、全身性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、間質(zhì)性膀胱炎、乳糜瀉)、發(fā)炎性病癥(例如氣喘、copd、動脈粥樣硬化、心肌炎、類肉瘤病)、移植排斥、纖維化(例如肝硬化)、神經(jīng)變性及涉及神經(jīng)元死亡的病況(例如阿茲海默氏病、亨廷頓氏癥)及癌癥。1)在第一實施例中，本發(fā)明是關于式(i)的化合物其中r1表示(c1-4)烷基、(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基、羥基-(c1-4)烷基或-c(o)nh2；且r2表示(c3-6)環(huán)烷基、(c1-4)烷氧基、(c3-6)環(huán)烷氧基或(c1-2)氟烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。為避免任何疑問，式(i)化合物是在哌嗪環(huán)的不對稱碳原子處(r)-構(gòu)形的。除非另有明確闡釋的定義提供更廣或更窄的定義，否則本文所提供的定義意在統(tǒng)一適用于如實施例1)至23)中任一者所定義的式(i)化合物及經(jīng)適當變通后的整個說明書及申請專利范圍。應充分了解，術(shù)語的定義或較佳定義是獨立于(及加以組合)如本文所定義任一或所有其他術(shù)語的任一定義或較佳定義來定義且可代替相應術(shù)語。如實施例1)至23)中任一者所定義的式(i)的化合物可含有一或多個立體或異構(gòu)不對稱中心，例如一或多個不對稱碳原子。因此，式(i)的化合物可以立體異構(gòu)物的混合物或以立體異構(gòu)物富集形式、較佳作為純立體異構(gòu)物存在?？梢员绢I域技術(shù)人員已知的方式分離立體異構(gòu)物的混合物。應了解，在(例如)鏡像異構(gòu)物的上下文中使用的術(shù)語“經(jīng)富集”在本發(fā)明的上下文中尤其意指，相應鏡像異構(gòu)物是以相對于相應其他鏡像異構(gòu)物至少70:30的比率(經(jīng)適當變通后：純度)、且特別地至少90:10的比率(經(jīng)適當變通后：70％/90％的純度)存在。優(yōu)選，該術(shù)語是指相應基本上純的鏡像異構(gòu)物。應了解，在(例如)諸如“基本上純”等術(shù)語中使用的術(shù)語“基本上”在本發(fā)明的上下文中尤其意指，相應立體異構(gòu)物/組合物/化合物等中至少90重量％、尤其至少95重量％且特別地至少99重量％的量是由相應純立體異構(gòu)物/組合物/化合物等組成。術(shù)語“烷基”單獨或組合使用時是指含有1至4個碳原子的直鏈或具支鏈飽和烴鏈。術(shù)語“(cx-y)烷基”(x及y各自是整數(shù))是指如前文所定義含有x至y個碳原子的烷基。例如，(c1-4)烷基含有1至4個碳原子。(c1-4)烷基的實例是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基及叔丁基。(c1-2)烷基的實例是甲基及乙基。在r1表示“(c1-4)烷基”的情形下，該術(shù)語意指甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基及叔丁基；優(yōu)選指甲基、乙基、正丙基、異丙基及叔丁基；且更優(yōu)選乙基及異丙基。術(shù)語“烷氧基”單獨或組合使用時是指其中烷基是如前文所定義的烷基-o-基團。術(shù)語“(cx-y)烷氧基”(x及y各自是整數(shù))是指如前文所定義含有x至y個碳原子的烷氧基。例如，(c1-4)烷氧基意指其中術(shù)語“(c1-4)烷基”具有先前給定意義的式(c1-4)烷基-o-的基團。(c1-4)烷氧基的實例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基及叔丁氧基。(c1-2)烷氧基的實例是甲氧基及乙氧基。在r2表示“(c1-4)烷氧基”的情形下，該術(shù)語意指甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基及叔丁氧基且優(yōu)選乙氧基。術(shù)語“羥基-(c1-4)烷基”單獨或組合使用時是指如前文所定義含有1至4個碳原子的烷基，其中一個氫原子經(jīng)羥基代替。該等基團的實例是羥基-甲基、1-羥基-乙基、2-羥基-乙基、1-羥基-丙-1-基、2-羥基-丙-1-基、3-羥基-丙-1-基、1-羥基-丙-2-基、2-羥基-丙-2-基、1-羥基-丁-1-基、2-羥基-丁-1-基、3-羥基-丁-1-基、4-羥基-丁-1-基、1-羥基-丁-2-基、2-羥基-丁-2-基、3-羥基-丁-2-基、4-羥基-丁-2-基、1-羥基-2-甲基-丙-1-基、2-羥基-2-甲基-丙-1-基、3-羥基-2-甲基-丙-1-基,及2-羥基-1,1-二甲基-乙-1-基。在“r1”表示“羥基-(c1-4)烷基”的情形下，該術(shù)語意指羥基-甲基、1-羥基-乙基、2-羥基-乙基、1-羥基-丙-1-基、2-羥基-丙-1-基、3-羥基-丙-1-基、1-羥基-丙-2-基、2-羥基-丙-2-基、1-羥基-丁-1-基、2-羥基-丁-1-基、3-羥基-丁-1-基、4-羥基-丁-1-基、1-羥基-丁-2-基、2-羥基-丁-2-基、3-羥基-丁-2-基、4-羥基-丁-2-基、1-羥基-2-甲基-丙-1-基、2-羥基-2-甲基-丙-1-基、3-羥基-2-甲基-丙-1-基，及2-羥基-1,1-二甲基-乙-1-基。優(yōu)選是羥基-甲基、1-羥基-乙基及2-羥基-丙-2-基且更優(yōu)選是1-羥基-乙基。術(shù)語“(cxa-ya)烷氧基-(cx-y)烷氧基”(x、xa、y及ya各自為整數(shù))是指如前文所定義含有x至y個碳原子的烷氧基，其中一個氫原子經(jīng)如前文所定義含有xa至ya個碳原子的(cxa-ya)烷氧基代替。例如，“(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基”是指如前文所定義含有一或兩個碳原子的(c1-2)烷基，其中一個氫原子經(jīng)如前文所定義含有一或兩個碳原子的(c1-2)烷氧基代替。(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基的實例是甲氧基-甲基、1-甲氧基-乙基、2-甲氧基-乙基、乙氧基-甲基、1-乙氧基-乙基及2-乙氧基-乙基。在“r1”表示“(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基”的情形下，該術(shù)語意指甲氧基-甲基、1-甲氧基-乙基、2-甲氧基-乙基、乙氧基-甲基、1-乙氧基-乙基及2-乙氧基-乙基且優(yōu)選甲氧基-甲基。術(shù)語“氟烷基”是指如前文所定義含有一或兩個碳原子的烷基，其中一或多個(且可能所有)氫原子經(jīng)氟代替。術(shù)語“(cx-y)氟烷基”(x及y各自是整數(shù))是指如前文所定義含有x至y個碳原子的氟烷基。例如，(c1-2)氟烷基含有一或兩個碳原子，其中1至5個氫原子經(jīng)氟代替。(c1-2)氟烷基的代表性實例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟乙基、1,1-二氟乙基、2-氟乙基、2,2-二氟乙基及2,2,2-三氟乙基。在r2表示“(c1-2)氟烷基”的情形下，該術(shù)語優(yōu)選意指氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟乙基、1,1-二氟乙基、2-氟乙基、2,2-二氟乙基及2,2,2-三氟乙基，且更優(yōu)選三氟甲基。術(shù)語“環(huán)烷基”單獨或組合使用時是指含有3至6個碳原子的飽和碳環(huán)。術(shù)語“(cx-y)環(huán)烷基”(x及y各自是整數(shù))是指如前文所定義含有x至y個碳原子的環(huán)烷基。例如，(c3-6)環(huán)烷基含有3至6個碳原子。(c3-6)環(huán)烷基的實例是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基及環(huán)己基。在“r2”表示“(c3-6)環(huán)烷基”的情形下，該術(shù)語意指環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基及環(huán)己基且優(yōu)選環(huán)丙基。術(shù)語“環(huán)烷氧基”單獨或組合使用時是指環(huán)烷基-o-基團，其中環(huán)烷基是如前文所定義。術(shù)語“(cx-y)環(huán)烷氧基”(x及y各自是整數(shù))是指如前文所定義含有x至y個碳原子的環(huán)烷氧基。例如，(c3-6)環(huán)烷氧基意指式(c3-6)環(huán)烷基-o-基團，其中術(shù)語“(c3-6)環(huán)烷基”具有先前給定的意義。(c3-6)環(huán)烷氧基的實例是環(huán)丙基氧基、環(huán)丁基氧基、環(huán)戊基氧基及環(huán)己基氧基。在r2表示“(c3-6)環(huán)烷氧基”的情形下，該術(shù)語意指環(huán)丙基氧基、環(huán)丁基氧基、環(huán)戊基氧基及環(huán)己基氧基且優(yōu)選環(huán)丁基氧基。2)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示(c1-4)烷基、(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基或羥基-(c1-4)烷基；且r2表示(c3-6)環(huán)烷基、(c1-4)烷氧基或(c1-2)氟烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。3)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示(c1-4)烷基；且r2表示(c3-6)環(huán)烷基、(c1-4)烷氧基或(c1-2)氟烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。4)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、甲氧基-甲基、羥基-甲基、1-羥基-乙基、2-羥基-丙-2-基或-c(o)nh2；且r2表示環(huán)丙基、乙氧基、環(huán)丁基氧基或三氟甲基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。5)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、甲氧基-甲基或1-羥基-乙基；且r2表示環(huán)丙基、乙氧基或三氟甲基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。6)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示乙基、正丙基、異丙基或叔丁基；且r2表示環(huán)丙基、乙氧基或三氟甲基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。7)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示(c1-4)烷基或(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基；且r2表示(c3-6)環(huán)烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。8)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示乙基、異丙基或叔丁基；且r2表示環(huán)丙基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。9)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示(c1-4)烷基或(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基；且r2表示(c1-4)烷氧基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。10)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示乙基、異丙基或叔丁基；且r2表示乙氧基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。11)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示(c1-4)烷基、(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基、羥基-(c1-4)烷基或-c(o)nh2；且r2表示(c1-2)氟烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。12)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、甲氧基-甲基、羥基-甲基、1-羥基-乙基、2-羥基-丙-2-基或-c(o)nh2；且r2表示三氟甲基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。13)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)的式(i)化合物，其中r1表示乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、甲氧基-甲基或1-羥基-乙基；且r2表示三氟甲基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。14)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)、2)、7)、9)或11)中任一者的式(i)化合物，其中r1表示(c1-4)烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。15)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)至5)、7)、9)或11)至13)中任一者的式(i)化合物，其中r1表示乙基、正丙基、異丙基或叔丁基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。16)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)、2)、7)、9)或11)中任一者的式(i)化合物，其中r1表示(c1-2)烷氧基-(c1-2)烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。17)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)、2)或11)中任一者的式(i)化合物，其中r1表示羥基-(c1-4)烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。18)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)、2)、3)或14)至17)中任一者的式(i)化合物，其中r2表示(c3-6)環(huán)烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。19)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)、2)、3)或14)至17)中任一者的式(i)化合物，其中r2表示(c1-4)烷氧基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。20)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)或14)至17)中任一者的式(i)化合物，其中r2表示(c3-6)環(huán)烷氧基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。21)本發(fā)明的另一實施例是關于根據(jù)實施例1)、2)、3)或14)至17)中任一者的式(i)化合物，其中r2表示(c1-2)氟烷基；且是關于該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。22)如實施例1)中所定義的式(i)化合物的實例是選自由以下各項組成的群：1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；2-(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-乙酮；1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；1-(2-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-2-氧代-乙基)-1h-[1,2,4]三唑-3-甲酰胺；2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；2-(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；2-(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；2-(3-羥甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-2-(3-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；2-[3-(1-羥基-乙基)-[1,2,4]三唑-1-基]-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；2-[3-(1-羥基-1-甲基-乙基)-[1,2,4]三唑-1-基]-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丁氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；2-(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-乙酮；1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；2-(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮；及1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；或該等化合物的鹽(具體而言醫(yī)藥上可接受的鹽)。23)因此，本發(fā)明是關于如實施例1)中所定義的式(i)化合物，及進一步受實施例2)至22)中的任一者的特征限制的該等化合物，其皆在對其相應依賴性的考慮下；是關于其醫(yī)藥上可接受的鹽；且是關于該等化合物作為藥劑的用途，其尤其用于治療與cxcr3受體的功能失調(diào)或藉助cxcr3進行信號傳導的配體的功能失調(diào)的病癥，尤其例如自體免疫病癥、發(fā)炎疾病、傳染病、移植排斥、纖維化、神經(jīng)變性病癥及癌癥。因此，尤其地以下與式(i)化合物相關的實施例是可能的且意欲以個別化形式且以個別化形式具體揭示于此：1、2+1、3+1、4+1、5+1、6+1、7+1、8+1、9+1、10+1、11+1、12+1、13+1、14+1、14+2+1、14+7+1、14+9+1、14+11+1、15+1、15+2+1、15+3+1、15+4+1、15+5+1、15+7+1、15+9+1、15+11+1、15+12+1、15+13+1、16+1、16+2+1、16+7+1、16+9+1、16+11+1、17+1、17+2+1、17+11+1、18+1、18+2+1、18+3+1、18+14+1、18+14+2+1、18+14+7+1、18+14+9+1、18+14+11+1、18+15+1、18+15+2+1、18+15+3+1、18+15+4+1、18+15+5+1、18+15+7+1、18+15+9+1、18+15+11+1、18+15+12+1、18+15+13+1、18+16+1、18+16+2+1、18+16+7+1、18+16+9+1、18+16+11+1、18+17+1、18+17+2+1、18+17+11+1、19+1、19+2+1、19+3+1、19+14+1、19+14+2+1、19+14+7+1、19+14+9+1、19+14+11+1、19+15+1、19+15+2+1、19+15+3+1、19+15+4+1、19+15+5+1、19+15+7+1、19+15+9+1、19+15+11+1、19+15+12+1、19+15+13+1、19+16+1、19+16+2+1、19+16+7+1、19+16+9+1、19+16+11+1、19+17+1、19+17+2+1、19+17+11+1、20+1、20+14+1、20+14+2+1、20+14+7+1、20+14+9+1、20+14+11+1、20+15+1、20+15+2+1、20+15+3+1、20+15+4+1、20+15+5+1、20+15+7+1、20+15+9+1、20+15+11+1、20+15+12+1、20+15+13+1、20+16+1、20+16+2+1、20+16+7+1、20+16+9+1、20+16+11+1、20+17+1、20+17+2+1、20+17+11+1、21+1、21+2+1、21+3+1、21+14+1、21+14+2+1、21+14+7+1、21+14+9+1、21+14+11+1、21+15+1、21+15+2+1、21+15+3+1、21+15+4+1、21+15+5+1、21+15+7+1、21+15+9+1、21+15+11+1、21+15+12+1、21+15+13+1、21+16+1、21+16+2+1、21+16+7+1、21+16+9+1、21+16+11+1、21+17+1、21+17+2+1、21+17+11+1、22+1及23+1；在以上列表中，數(shù)字是指根據(jù)其上文所提供編號的實施例，而“+”指示依賴于另一實施例。不同的個別實施例由逗號分開。換言的，例如，“14+2+1”是指依賴于實施例2)、依賴于實施例1)的實施例14)，即實施例“14+2+1”對應于進一步受實施例2)及14)的特征限制的實施例1)的化合物。倘若使用化合物、鹽、醫(yī)藥組合物、疾病或諸如此類的復數(shù)形式，則此亦欲指單一化合物、鹽、醫(yī)藥組合物、疾病或諸如此類。若適當且方便，如在實施例1)至23)中任一者中所定義對式(i)的化合物的任何提及均應理解為亦提及該等化合物的鹽(且尤其醫(yī)藥上可接受的鹽)。術(shù)語“醫(yī)藥上可接受的鹽”是指保留目標化合物的期望生物活性且展現(xiàn)最小不期望毒物學效應的鹽。該等鹽包括無機或有機酸及/或堿加成鹽，此取決于目標化合物中的存在的堿性及/或酸性基團。對于參考文獻，例如參見“handbookofpharmaceuticalsalts.properties,selectionanduse.”,p.heinrichstahl、camilleg.wermuth(編輯),wiley-vch,2008；及“pharmaceuticalsaltsandco-crystals”,johanwouters及l(fā)ucquéré(編輯),rscpublishing,2012。本發(fā)明亦包括經(jīng)同位素標記、尤其2h(氘)標記的式(i)化合物，該等化合物與式(i)化合物相同，只是一或多個原子已各自由具有相同原子數(shù)但具有與在自然界中通常發(fā)現(xiàn)的原子量不同的原子量的原子代替。經(jīng)同位素標記、尤其經(jīng)2h(氘)標記的式(i)的化合物及其鹽在屬本發(fā)明的范圍內(nèi)。用較重同位素2h(氘)取代氫可使得代謝穩(wěn)定性提高，從而使得(例如)活體內(nèi)半衰期延長或劑量要求降低，或可使得對細胞色素p450酶的抑制降低，從而使得(例如)安全特性改良。在本發(fā)明的一個實施例中，式(i)的化合物未經(jīng)同位素標記，或其僅經(jīng)一或多個氘原子標記。在子實施例中，式(i)的化合物完全未經(jīng)經(jīng)同位素標記。可以類似于下文中所述的方法、但使用適宜試劑或起始材料的適當同位素變化形式來制備經(jīng)同位素標記的式(i)的化合物。當使用詞語“介于……之間”闡述數(shù)值范圍時，應了解所指示范圍的端點明確地包括在該范圍中。例如：若將溫度范圍闡述為介于40℃與80℃之間，則此意指端點40℃及80℃包含在該范圍中；或若將變量定義為介于1與4之間的整數(shù)，則此意指變量為整數(shù)1、2、3或4。除非所用關于溫度，否則置于數(shù)值“x”前的術(shù)語“約”(或“大約”)在本申請案中是指自x-10％x延伸至x+10％x的區(qū)間，且較佳是指自x-5％x延伸至x+5％x的區(qū)間。在溫度的特定情形下，置于溫度“y”前的術(shù)語“約”(或“大約”)在本申請案中是指自溫度y-10℃延伸至y+10℃的區(qū)間，且較佳是指自y-5℃延伸至y+5℃的區(qū)間。此外，本文所用術(shù)語“室溫”是指約25℃的溫度。實施例1)至23)中任一者所定義的式(i)化合物及其醫(yī)藥上可接受的鹽可用作藥劑，例如呈經(jīng)腸(例如尤其口服)或非經(jīng)腸(包括局部施加或吸入)施用的醫(yī)藥組合物形式。醫(yī)藥組合物的產(chǎn)生可以任一本領域技術(shù)人員所熟悉的方式(參見例如remington,thescienceandpracticeofpharmacy，第21版(2005)，第5部分，“pharmaceuticalmanufacturing”[由lippincottwilliams&wilkins出版])藉由所述式(i)化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽(視情況與其他有治療價值的物質(zhì)組合)連同適宜的無毒、惰性、治療上兼容性固體或液體載劑物質(zhì)及(若需要)常用醫(yī)藥佐劑制成蓋侖(galenical)施用形式來實現(xiàn)。本發(fā)明亦關于預防或治療本文所提及疾病或病癥的方法，其包含向個體施用醫(yī)藥活性量的如實施例1)至23)中任一者所定義的式(i)化合物。在本發(fā)明的一個較佳實施例中，所施用量包含介于每天1mg與1000mg之間、特別介于每天5mg與500mg之間、更特別介于每天25mg與400mg之間、尤其介于每天50mg與200mg之間。為避免任何疑問，若將化合物闡述為可用于預防或治療某些疾病，則該等化合物同樣適用于制備用來預防或治療該等疾病的藥劑。本發(fā)明的另一方面是關于預防或治療患者中下文所提及疾病或病癥的方法，其包含向該患者施用醫(yī)藥活性量的如實施例1)至23)中任一者所定義的式(i)化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽。如實施例1)至23)中任一者所定義的式(i)化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽可用于預防或治療與cxcr3受體的功能失調(diào)或藉助cxcr3進行信號傳導的配體的功能失調(diào)相關的病癥。該等與cxcr3受體或其配體的功能失調(diào)相關的病癥是需要cxcr3受體調(diào)節(jié)劑的疾病或病癥。以上所提及的病癥尤其可定義為包含自體免疫病癥、發(fā)炎疾病、傳染病、移植排斥、纖維化、神經(jīng)變性病癥及癌癥。自體免疫病癥可定義為包含類風濕性關節(jié)炎(ra)；多發(fā)性硬化(ms)；發(fā)炎性腸病(ibd；包含克羅恩氏病及潰瘍性結(jié)腸炎)；全身性紅斑狼瘡(sle)；牛皮癬；牛皮癬性關節(jié)炎；狼瘡性腎炎；間質(zhì)性膀胱炎；乳糜瀉；抗磷脂綜合征；甲狀腺炎，例如橋本氏甲狀腺炎(hashimoto’sthyroiditis)；淋巴球性甲狀腺炎；重癥肌無力；i型糖尿病；葡萄膜炎；上鞏膜炎；鞏膜炎；川崎病(kawasaki'sdisease)、葡萄膜視網(wǎng)膜炎；后葡萄膜炎；與貝塞特氏病(behcet'sdisease)相關聯(lián)的葡萄膜炎；葡萄膜腦膜炎綜合征；變應性腦脊髓炎；異位性疾病，例如鼻炎、結(jié)膜炎、皮膚炎；及感染后自體免疫性疾病，包括風濕熱及感染后腎小球腎炎。發(fā)炎疾病可定義為包含氣喘；copd；動脈粥樣硬化；心肌炎；干眼綜合征(包含修格連氏干眼綜合征(dryeyesyndrome))；肌病變(包含發(fā)炎性肌病變)；類肉瘤??；尤其與類肉瘤病相關聯(lián)的肺動脈高血壓；及肥胖癥。傳染病可定義為包含由各種感染物介導的疾病及由其產(chǎn)生的并發(fā)癥；例如瘧疾、腦型瘧、麻瘋、結(jié)核病、流行性感冒、弓蟲病、登革熱(dengue)、b型及c型肝炎、單純性皰疹、利什曼原蟲病(leishmania)、砂眼衣原體、萊姆病(lymedisease)、西尼羅河病毒(westnilevirus)。移植排斥可定義為包含移植器官(例如腎臟、肝臟、心臟、肺、胰臟、角膜及皮膚)的排斥；移植物對抗宿主疾?。患奥酝N異體移植血管病變。纖維化可定義為包含肝硬化(包含原發(fā)性膽汁性肝硬化(pbc)及自體免疫性肝炎)、特發(fā)性肺纖維化、腎纖維化、心肌內(nèi)膜纖維化、全身性硬化癥及關節(jié)纖維化。神經(jīng)變性病癥可定義為包含神經(jīng)變性及涉及神經(jīng)元死亡的病況，例如多發(fā)性硬化(包括復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化及進行性多發(fā)性硬化)、阿茲海默氏病、帕金森氏病(parkinson'sdisease)、亨廷頓氏舞蹈癥、hiv相關癡呆、朊病毒介導的神經(jīng)變性、癲癇、中風、大腦局部缺血、大腦性麻痹、視神經(jīng)脊髓炎、臨床孤立綜合征、阿爾珀氏病(alpers'disease)、肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(als)、老年性癡呆、路易體(lewybodies)癡呆、雷特氏綜合征(rettsyndrome)、脊髓創(chuàng)傷、創(chuàng)傷性腦損傷、三叉神經(jīng)痛、慢性發(fā)炎去髓鞘型多發(fā)性神經(jīng)病變、格-巴二氏綜合征(guillain-barrésyndrome)、嗜睡病、舌咽神經(jīng)痛、輕度認知功能減退、認知功能減退、脊髓性肌肉萎縮癥及腦型瘧。癌癥可定義為包含所有種類的癌癥，例如大腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、膽管癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、子宮頸癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、血液腫瘤、嗜堿性腺癌、催乳素瘤、高乳促素血癥、腺瘤、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌；慢性淋巴球性白血病(cll)；且尤其彼等癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。特定而言，根據(jù)實施例1)至23)中任一者的式(i)的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽適用于預防或治療選自以下疾病及病癥的群中的一者、若干或所有的疾?。?)選自以下的自體免疫病癥：類風濕性關節(jié)炎(ra)；多發(fā)性硬化(ms)；發(fā)炎性腸病(ibd；包含克羅恩氏病及潰瘍性結(jié)腸炎)；全身性紅斑狼瘡(sle)；牛皮癬；狼瘡性腎炎；及i型糖尿??；2)選自以下的發(fā)炎疾病：copd；干眼綜合征(包含修格連氏干眼綜合征)；肌病變(包含發(fā)炎性肌病變)；及類肉瘤?。?)選自移植物抗宿主疾病的移植排斥；4)選自肝硬化(包含原發(fā)性膽汁性肝硬化(pbc)及自體免疫性肝炎)的纖維化；及5)選自格-巴二氏綜合征的神經(jīng)變性病癥。式(i)化合物的制備本發(fā)明的另一方面是制備式(i)化合物的方法。本發(fā)明的式(i)化合物可自市售或熟知起始材料根據(jù)實驗部分中所闡述的方法；藉由類似方法；或根據(jù)下文所列示反應的一般順序來制備，其中r1及r2是如針對式(i)所定義。本文所用的其他縮寫經(jīng)明確地定義，或者如實驗章節(jié)中所定義。在一些情況中，一般基團r1及r2可能與闡釋于下述方案中的裝配不兼容，且因此將需要使用保護基團(pg)。保護基團的使用為業(yè)內(nèi)所熟知(例如，參見“protectivegroupsinorganicsynthesis”,t.w.greene,p.g.m.wuts,wiley-interscience,1999)。出于本討論的目的，將假設該等保護基團視需要處于適當位置。所獲得的化合物亦可以本身已知的方式轉(zhuǎn)化成鹽、尤其其醫(yī)藥上可接受的鹽。一般制備途徑：方案1式(i)化合物可自中間體(1)開始來制備，將該中間體在標準條件下(例如，naoh水溶液于meoh中)皂化，以得到結(jié)構(gòu)(2)的化合物(方案1)。在rt下使用于thf中的(二乙酰氧基碘)苯及l(fā)ibr將結(jié)構(gòu)(2)的化合物中的羧酸基團轉(zhuǎn)化為相應溴(3)?？墒褂媒Y(jié)構(gòu)(4)(其中r表示氫或(c1-4)烷基)的偶合配體使用用于鈴木反應(suzukireaction)的標準條件、如使用適宜堿(例如na2co3水溶液)、適宜鈀催化劑(例如pd(pph3)2cl2)及適宜溶劑(例如mecn)、優(yōu)選在大約80℃的溫度下加熱實施鈴木偶合。隨后可在適宜溶劑(例如二噁烷)中并在約rt的溫度下在酸性條件下、優(yōu)選使用hcl裂解所獲得中間體(5)的boc保護基團，從而得到結(jié)構(gòu)(6)的化合物?？稍谧詈蟛襟E中藉由使用標準肽偶合方法(例如hatu)優(yōu)選在約rt的溫度下在適宜堿(例如dipea或net3)存在下及在適宜溶劑(例如dcm或dmf)中與羧酸衍生物(7)進行酰胺偶合獲得式(i)化合物。方案2結(jié)構(gòu)(1)的化合物可遵循方案2中所列示的反應順序來合成。在大約-78℃的溫度下利用于thf中的正丁基鋰及溴處理市售2-(三氟甲基)噻唑-4-甲酸。所得溴化化合物可使用于meoh中的硫酸并在大約70℃的溫度下加熱進行酯化。使用市售哌嗪衍生物(8)在適宜堿(例如dipea)存在下在適宜溶劑(例如mecn)中且在大約80℃的溫度下進行的親核芳香族取代提供結(jié)構(gòu)(1)的化合物。式(7)化合物是市售的或可遵循方案3中顯示的途徑來合成。方案3可在諸如mecn等適宜溶劑中及在約rt的溫度下在諸如cs2co3等堿存在下使用式x-ch2-coo(pg)的乙酸衍生物(其中x是離去基團(例如溴)且pg是適于酸官能基的保護基團(例如芐基))烷基化結(jié)構(gòu)(9)的三唑。中間體(10)在h2下使用pd/c作為催化劑且etoh作為溶劑在大約rt的溫度下的去保護(例如芐基去保護)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)(7)的化合物。其他適宜酸官能基保護基團及保護以及去保護方法已為本領域技術(shù)人員熟知(特別地參見“protectivegroupsinorganicsynthesis”,greenet.w.及wutsp.g.m.,wiley-interscience,1999)。結(jié)構(gòu)(4)的化合物是市售的或可以與本領域技術(shù)人員已知的方法類似的方法(例如相應5-溴-嘧啶衍生物與硼酸三異丙酯及n-buli在thf及甲苯中在約-78℃的溫度下的反應)來制備。式(i)化合物可自其他式(i)化合物或其類似物藉由r1位的取代基至另一取代基r1的互相轉(zhuǎn)化獲得。例如，可藉由以下將其中r1表示溴的式(i)類似物轉(zhuǎn)變?yōu)槠渲衦1表示(c2-4)烷基的式(i)化合物：(i)使用相應(c2-4)烯基硼酸酯衍生物(例如異丙烯基硼酸頻哪醇酯)在諸如pd(pph3)2cl2等鈀催化劑存在下進行鈴木反應，及(ii)在pd/c存在下在諸如meoh等溶劑中使用例如氫進行氫化。可藉由在諸如dcm等溶劑中使用濃h2so4水解相應腈制備其中r1表示-c(o)nh2的式(i)化合物。此外，可藉由在諸如dcm等溶劑中使用bbr3進行去甲基化自其中r1表示甲氧基-(c1-4)烷基的相應化合物或藉由利用nabh4進行還原自其中r1表示-c(o)-(c1-3)烷基的相應酮獲得其中r1表示羥基-(c1-4)烷基的式(i)化合物。每當以鏡像異構(gòu)物的混合物獲得式(i)化合物時，可使用本領域技術(shù)人員已知的方法來分離鏡像異構(gòu)物：例如藉由形成并分離非鏡像異構(gòu)物鹽或藉由在手性固定相(例如daicelchiralpakic(5μm)管柱)上進行hplc。手性hplc的典型條件是洗脫劑a(etoh或iproh，在諸如net3或dea等胺存在或不存在下)及洗脫劑b(己烷或mecn)的等梯度混合物、以0.8ml/min至16ml/min的流速。實驗部分：縮寫(此處及上文說明中所用)：aq.水性boc叔丁氧基羰基bsa牛血清白蛋白bu丁基cc硅膠上管柱層析cho中國倉鼠卵巢cv管柱體積dcm二氯甲烷dea二乙胺dipean-乙基二異丙基胺dmf二甲基甲酰胺dmso二甲亞砜ea乙酸乙酯edta乙二胺四乙酸egta乙二醇四乙酸et乙基fbs胎牛血清flipr熒光成像板讀取器fluo-4-am2-{[2-(2-{5-[雙(羧基甲基)氨基]-2-甲基苯氧基}乙氧基)-4-(2,7-二氟-6-羥基-3-氧代-3h-呫噸-9-基)苯基](羧基甲基)氨基}乙酸g418(2r,3s,4r,5r,6s)-5-氨基-6-[(1r,2s,3s,4r,6s)-4,6-二氨基-3-[(2r,3r,4r,5r)-3,5-二羥基-5-甲基-4-甲基氨基噁烷-2-基]氧基-2-羥基環(huán)己基]氧基-2-(1-羥基乙基)噁烷-3,4-二醇h小時hatu2-(7-氮雜-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓hep庚烷hepes4-(2-羥基乙基)-哌嗪-1-乙烷磺酸hv高真空hplc高效液相層析ipr異丙基lc液相層析法m多重峰m摩爾濃度[moll-1]me甲基ms質(zhì)譜法min分鐘nmr核磁共振譜org.有機pbs磷酸鹽緩沖鹽水pd/c碳載鈀pg保護基團ph苯基prep制備型rpm每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)rt室溫s單峰sat.飽和tfa三氟乙酸t(yī)hf四氫呋喃tlc薄層層析tr保留時間uplc超高效液相層析法i.化學以下實例說明本發(fā)明生物活性化合物的制備，但完全不限制其范圍。通常：所有溫度皆以攝氏度(℃)陳述。除非另有說明，否則反應于rt下在氬氣氛下實施且在配備有磁力攪拌棒的火焰干燥的圓底燒瓶中進行。所用的表征方法：使用以下洗脫條件獲得lc-ms保留時間：i)lc-ms(a)：zorbaxsb-aq,3.5μm,4.6×50mm管柱于40℃下恒溫。兩種洗脫溶劑是如下：溶劑a＝水+0.04％tfa；溶劑b＝mecn。洗脫劑流速為4.5ml/min且洗脫混合物比例隨自洗脫開始的時間t而變的特性曲線匯總于下表中(在兩個連續(xù)時間點之間使用線性梯度)：t(min)01.01.451.55溶劑a(％)955595溶劑b(％)595955ii)lc-ms(b):使用來自waters且于acquityuplc管柱管理器(管柱manager)(60℃)中恒溫的acquityuplcbehc181.7μm2.1×50mmid管柱。兩種洗脫溶劑如下：溶劑a＝水+0.05％甲酸；溶劑b＝mecn+0.045％甲酸。洗脫劑流速為1ml/min且洗脫混合物比例隨自洗脫開始的時間t而變的特性曲線匯總于下表中(在兩個連續(xù)時間點之間使用線性梯度)：t(min)01.41.81.92.0溶劑a(％)9852298溶劑b(％)29598982藉由nmr光譜(brukeravanceii400mhzultrashieldtm或brukerascendtm500，配備有5mmdch冷凍器)、1h(400mhz或500mhz)、19f(376mhz)進一步證實化合物純度及一致性。化學位移是以相對于四甲基硅烷(tms)或三氯氟甲烷的百萬分率(ppm)報告，且多重性是以s(單峰)或m(多重峰)給出。使用下文所述的條件實施藉由制備型lc-ms的純化。i)制備型lc-ms(i)：使用x-bridge管柱(watersc18,10μmobd,30×75mm)。兩種洗脫溶劑如下：溶劑a＝水+0.5％nh4oh(25％)；溶劑b＝mecn。洗脫劑流速為75ml/min且洗脫混合物比例隨自洗脫開始的時間t而變的特性曲線匯總于下表中(在兩個連續(xù)時間點之間使用線性梯度)：ii)制備型lc-ms(ii)：使用x-bridge管柱(watersc18,10μmobd,30×75mm)。兩種洗脫溶劑如下：溶劑a＝水+0.5％nh4oh(25％)；溶劑b＝mecn。洗脫劑流速為75ml/min且洗脫混合物比例隨自洗脫開始的時間t而變的特性曲線匯總于下表中(在兩個連續(xù)時間點之間使用線性梯度)：t(min)00.013.56.06.26.6溶劑a(％)7070557070溶劑b(％)303095953030iii)制備型lc-ms(iii)：使用x-bridge管柱(watersc18,10μmobd,30×75mm)。兩種洗脫溶劑如下：溶劑a＝水+0.5％甲酸；溶劑b＝mecn。洗脫劑流速為75ml/min且洗脫混合物比例隨自洗脫開始的時間t而變的特性曲線匯總于下表中(在兩個連續(xù)時間點之間使用線性梯度)：t(min)00.014.06.06.26.6溶劑a(％)8080558080溶劑b(％)202095952020iv)制備型lc-ms(iv)：使用atlantis管柱(waterst3,10μmobd,30×75mm)。兩種洗脫溶劑如下：溶劑a＝水+0.5％甲酸；溶劑b＝mecn。洗脫劑流速為75ml/min且洗脫混合物比例隨自洗脫開始的時間t而變的特性曲線匯總于下表中(在兩個連續(xù)時間點之間使用線性梯度)：t(min)00.014.06.06.26.6溶劑a(％)8080558080溶劑b(％)202095952020v)制備型lc-ms(v)：使用x-bridge管柱(watersc18,10μmobd,30×75mm)。兩種洗脫溶劑如下：溶劑a＝水+0.5％nh4oh(25％)；溶劑b＝mecn。洗脫劑流速為75ml/min且洗脫混合物比例隨自洗脫開始的時間t而變的特性曲線匯總于下表中(在兩個連續(xù)時間點之間使用線性梯度)：t(min)00.014.06.06.26.6溶劑a(％)9090559090溶劑b(％)101095951010所用制備型手性hplc方法：藉由制備型手性hplc的純化是使用下文所闡述的條件實施。i)制備型手性hplc(i)：使用chiralpakib管柱(5μm,30×250mm)。洗脫溶劑為hep/etoh60/40，運行9min且流速為40ml/min。ii)制備型手性hplc(ii)：使用(r,r)whelk-01管柱(10μm,50×250mm)。洗脫溶劑為hep/etoh70/30，運行16.3min且流速為100ml/min。iii)制備型手性hplc(iii)：使用chiralpakib管柱(5μm,30×250mm)。洗脫溶劑為hep/etoh50/50，運行8min且流速為34ml/min。iv)制備型手性hplc(iv)：使用chiralpakib管柱(5μm,20×250mm)。洗脫溶劑為hep/etoh50/50,0.1％dea，運行18.7min且流速為16ml/min。v)制備型手性hplc(v)：使用chiralpakib管柱(5μm,30×250mm)。洗脫溶劑為hep/etoh70/30，運行11.8min且流速為34ml/min。vi)制備型手性hplc(vi)：使用chiralpakoz-h管柱(5μm,20×250mm)。洗脫溶劑是hep/etoh50/50,0.1％dea，運行11min且流速為19ml/min。實例1：1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-乙基-5-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮1.1.5-溴-2-三氟甲基-噻唑-4-甲酸經(jīng)15分鐘在氬下向冷卻至-78℃的2-(三氟甲基)噻唑-4-甲酸(3.2g)于無水thf(60ml)中的溶液中逐滴添加n-buli(1.6m于己烷中，21.3ml)，以使得內(nèi)部溫度不會升高超過-60℃。然后逐滴添加br2(0.92ml)于環(huán)己烷(8ml)中的溶液，以保持內(nèi)部溫度低于-60℃。將所得混合物于-78℃下攪拌2h并藉由添加水(50ml)小心驟冷。添加檸檬酸(10％)直至ph＝2為止且用ea萃取混合物。用鹽水洗滌有機層，干燥(mgso4)，過濾并蒸發(fā)至干燥，以獲得4.15g褐色固體，其未經(jīng)進一步純化即使用。lc-ms(a)：tr＝0.67min。f-nmr(cd3od)：-63.57ppm(s)。1.2.5-溴-2-三氟甲基-噻唑-4-甲酸甲酯向中間體1.1(12g)于meoh(130ml)中的溶液中添加h2so4(96％,6.5ml)并將混合物于70℃下攪拌3h。冷卻后，用na2co3飽和水溶液驟冷反應混合物并部分地蒸發(fā)掉溶劑。用dcm稀釋殘余物并用飽和水溶液na2co3(1×)、水(1×)及鹽水(1×)洗滌，且用dcm(2×)萃取水相。將合并的有機層經(jīng)mgso4干燥，過濾，蒸發(fā)并在hv下干燥，以獲得12g褐色樹脂狀物。lc-ms(a)：tr＝0.83min。f-nmr(cd3od)：-63.59ppm(s)。1.3.(r)-4-(4-甲氧基羰基-2-三氟甲基-噻唑-5-基)-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯于rt下向中間體1.2(10g)于mecn(250ml)中的溶液中添加(r)-1-n-boc-2-甲基哌嗪(7.19g)及dipea(8.85ml)。在80℃下將反應混合物攪拌43h。冷卻后，用ea稀釋反應混合物并用水及鹽水洗滌。用ea萃取水層。將合并的有機層經(jīng)mgso4干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。藉由cc(biotage,snap340g,溶劑a：hep；溶劑b：ea；b％的梯度：10超過5cv，10至30超過5cv，30超過5cv)純化粗制物，以獲得9.14g黃色樹脂狀物。lc-ms(a)：tr＝0.97min；[m+h]+：410.0。1.4.(r)-4-(4-羧基-2-三氟甲基-噻唑-5-基)-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯于rt下向中間體1.3(4.25g)于etoh(40ml)中的溶液中添加1mnaoh(40ml)并將反應混合物攪拌1h20。將溶劑蒸發(fā)并藉由添加檸檬酸水溶液(10％)將殘余物酸化至ph2。將水層用dcm(3×)萃取且合并的有機層經(jīng)na2so4干燥并濃縮至干燥，以獲得4.1g橙色固體。lc-ms(a)：tr＝0.88min；[m+h]+：395.9。1.5.(r)-4-(4-溴-2-三氟甲基-噻唑-5-基)-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯于rt下向中間體1.4(10.17g)于thf(210ml)中的溶液中添加libr(2.26g)及(二乙酰氧基碘)苯(8.45g)。將所得懸浮液于rt下攪拌1h30。用h2o稀釋反應混合物并用dcm(3×)萃取。將合并的有機層經(jīng)mgso4干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。藉由cc(biotage,snap340g筒，溶劑a：hep；溶劑b：ea；b％的梯度：5于5cv，5至10超過3cv)純化粗制物，以獲得9.63g黃色固體。lc-ms(a)：tr＝1.04min；[m+h]+：429.2。1.6.(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯將中間體1.5(1.63g)、2-乙氧基嘧啶-5-硼酸(778mg)、pd(pph3)2cl2(152mg)、1mna2co3(12ml)于mecn(12ml)中的混合物于80℃下在氬下劇烈攪拌過夜。使反應混合物冷卻至rt，用h2o稀釋并用dcm(3×)萃取。將合并的有機層經(jīng)mgso4干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。藉由cc(biotage,snap50g筒，溶劑a：hep；溶劑b：ea；％b的梯度：10于5cv，10至30超過5cv，30于3cv)純化粗制物，以獲得1.35g淺黃色樹脂狀物。lc-ms(a)：tr＝1.04min；[m+h]+:473.9。1.7.2-乙氧基-5-[5-((r)-3-甲基-哌嗪-1-基)-2-三氟甲基-噻唑-4-基]-嘧啶于rt下向中間體1.6(1.32g)于dcm(45ml)中的溶液中添加tfa(4.28ml)。將所得混合物于rt下攪拌過夜。將反應混合物用1mnaoh處理至ph＝14并用dcm(3×)萃取。將合并的有機層經(jīng)mgso4干燥，過濾，蒸發(fā)并在hv下干燥，以獲得1.01g淺褐色固體。lc-ms(a)：tr＝0.64min；[m+h]+：374.0。1.8.(3-溴-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸鋰鹽向(3-溴-1h-1,2,4-三唑-1-基)乙酸乙酯(200mg)于thf(0.75ml)及etoh(0.75ml)中的溶液中添加h2o(0.5ml)，隨后2mlioh(0.47ml)。將反應混合物在rt下攪拌過夜，蒸發(fā)掉并在hv下干燥殘余物，從而得到201mg白色固體。lc-ms(a)：tr＝0.29min；[m+h]+：205.9。1.9.2-(3-溴-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-乙酮將中間體1.7(120mg)、中間體1.8(76mg)、hatu(159mg)及dipea(82μl)于dcm(4ml)及dmf(1ml)中的混合物在rt下攪拌過夜。藉由蒸發(fā)去除dcm并藉由制備型lc-ms(iv)純化粗制物，從而得到102mg白色固體。lc-ms(a)：tr＝0.9min；[m+h]+：561.0。1.10.1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙烯基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮將中間體1.9(40mg)、異丙烯基硼酸頻哪醇酯(15.1mg)、pd(pph3)2cl2(2.8mg)、1mna2co3(1ml)于mecn(1ml)中的混合物在80℃下在氬下劇烈攪拌2h。使反應混合物冷卻至rt并蒸發(fā)至干燥。藉由制備型lc-ms(i)純化粗制物。lc-ms(a)：tr＝0.9min；[m+h]+：523.2。1.11.1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮將于meoh(1ml)中含有中間體1.10(g)、pd/c(1.5mg)的燒瓶抽真空并用氬(3×)回填，之后抽真空并用h2(3×)回填并將反應混合物于rt下攪拌過夜。經(jīng)注射器過濾器過濾反應混合物并將濾液蒸發(fā)至干燥。藉由制備型lc-ms(iv)純化粗制物，從而獲得7mg白色固體。lc-ms(b)：tr＝1.11min；[m+h]+：525.2。實例2：1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮2.1.(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯向3-乙基-1h-1,2,4-三唑(2g)于mecn(125ml)中的溶液中添加cs2co3(6.37g)，隨后溴乙酸芐基酯(3.23ml)。將反應混合物于rt下攪拌過夜并蒸發(fā)至干燥。將殘余物吸收于ea中并用水洗滌。用ea(2×)萃取水層，將合并的有機層經(jīng)na2so4干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。藉由cc(biotage,snap100g筒，溶劑a：dcm；溶劑b：dcm/meoh8:2；b％的梯度：15于4cv，15至100超過4cv，100于1cv)純化殘余物，從而得到3.89g作為第一洗脫成分(兩種三唑區(qū)域異構(gòu)物的混合物)及309mg作為第二洗脫成分((3-乙基-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸芐基酯)。藉由制備型手性hplc(i)純化區(qū)域異構(gòu)物的混合物。第一洗脫成分：(5-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯：1.39g黃色油狀物。lc-ms(a)：tr＝0.72min；[m+h]+:246.2。在2.72ppm處的ch2ch3與4.93ppm處的ch2co2之間觀察到roesy信號。第二洗脫成分：(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯：2.08g黃色固體。lc-ms(a)：tr＝0.71min；[m+h]+：246.2。在8.08ppm處的ch(三唑)與4.96ppm處的ch2co2之間觀察到roesy信號。2.2.(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸將于etoh(20ml)中含有步驟2.1的(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯(2.06g)、pd/c(445mg)的燒瓶抽真空并利用氬(3×)回填，之后抽真空并利用h2(3×)回填并將反應混合物在rt下攪拌9h。經(jīng)硅藻土塞過濾反應混合物并將濾液蒸發(fā)至干燥，以得到1.27g白色固體。lc-ms(a)：tr＝0.25min；[m+h]+:156.2。2.3.1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮于rt下將中間體1.7(50mg)、中間體2.2(21mg)、hatu(66mg)及net3(28μl)于dcm(1.5ml)中的混合物攪拌過夜。將反應混合物蒸發(fā)至干燥并藉由制備型lc-ms(i)純化粗制物，以獲得15mg白色固體。lc-ms(b)：tr＝1.05min；[m+h]+：511.2。實例3：2-(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-乙酮3.1.(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯此化合物是使用類似于實例2步驟2.1的方法且用3-叔丁基-1h-1,2,4-三唑代替3-乙基-1h-1,2,4-三唑來制備。在cc后獲得期望化合物，呈單一區(qū)域異構(gòu)物。lc-ms(a)：tr＝0.73min；[m+h]+：274.1。3.2.(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸此化合物是使用類似于實例2步驟2.2的方法且用中間體3.1代替(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯來制備。lc-ms(a)：tr＝0.36min；[m+h]+：184.3。3.3.2-(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體3.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化期望化合物。lc-ms(a)：tr＝0.84min；[m+h]+：539.1。實例4：1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮4.1.(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯此化合物是使用類似于實例2步驟2.1的方法且用3-(甲氧基甲基)-1h-1,2,4-三唑代替3-乙基-1h-1,2,4-三唑來制備。粗制物藉由兩種cc(1.biotage,snap10g筒，溶劑a：dcm；溶劑b：dcm/meoh8:2；b％的梯度：5于7cv，5至15超過3cv，15于3cv；2.biotage,snap10g筒，溶劑a：dcm；溶劑b：dcm/meoh8:2；b％的梯度：5于5cv，5至10超過3cv，10于3cv，10至15于3cv)純化，得到兩種區(qū)域異構(gòu)物：第一洗脫成分：(5-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯：無色油狀物。lc-ms(a)：tr＝0.71min；[m+h]+：262.2。第二洗脫成分：(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯：無色油狀物。lc-ms(a)：tr＝0.67min；[m+h]+：262.1。在8.17ppm的ch(三唑)與5.01ppm的nch2co2之間觀察到roesy信號。4.2.(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸此化合物是使用類似于實例2步驟2.2的方法且用步驟4.1的(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯代替(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯來制備。lc-ms(a)：tr＝0.24min；[m+h]+:172.0。4.3.1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體4.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化期望化合物。lc-ms(b)：tr＝1.02min；[m+h]+：527.2。實例5：1-(2-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-2-氧代-乙基)-1h-[1,2,4]三唑-3-甲酰胺5.1.(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯此化合物是使用類似于實例1步驟1.6的方法且用2-(三氟甲基)嘧啶-5-基-硼酸代替2-乙氧基嘧啶-5-硼酸來制備。lc-ms(a)：tr＝1.06min；[m+h]+：497.9。5.2.5-[5-((r)-3-甲基-哌嗪-1-基)-2-三氟甲基-噻唑-4-基]-2-三氟甲基-嘧啶鹽酸鹽將中間體5.1(2.3g)于hcl(10.2ml,4m于二噁烷中)中的混合物在rt下攪拌3h。過濾白色懸浮液，用et2o洗滌濾液并在hv下干燥，從而得到1.6g白色固體。lc-ms(a)：tr＝0.72min；[m+h++ch3cn]+：438.9。5.3.1-(2-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-2-氧代-乙基)-1h-[1,2,4]三唑-3-甲腈此化合物是使用實例2步驟2.3類似于的方法且用2-(3-氰基-1h-1,2,4-三唑-1-基)乙酸代替中間體2.2且用中間體5.2代替中間體1.7來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化期望化合物。lc-ms(b)：tr＝1.19min；[m+h]+：532.1。5.4.1-(2-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-2-氧代-乙基)-1h-[1,2,4]三唑-3-甲酰胺向中間體5.3(18mg)于dcm(0.1ml)中的溶液中添加濃h2so4(0.1ml)，并將所得乳液劇烈攪拌4h15。將反應混合物逐滴添加至nh4oh(25％)及冰中的混合物，并用dcm(5×)萃取水層。用鹽水洗滌合并的有機層，經(jīng)mgso4干燥，蒸發(fā)并在hv下干燥。藉由制備型tlc(dcm/meoh95:5)純化，得到9mg白色固體。lc-ms(a)：tr＝0.82min；[m+h]+：550.0。實例6：2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體5.2代替中間體1.7來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化期望化合物。lc-ms(a)：tr＝0.89min；[m+h]+：535.0。實例7：2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮7.1.(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯及(5-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯該等化合物是使用類似于實例3步驟3.1的方法且用3-異丙基-1h-1,2,4-三唑代替3-乙基-1h-1,2,4-三唑來制備。藉由制備型手性hplc(ii)純化區(qū)域異構(gòu)物的混合物。第一洗脫成分：(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯。lc-ms(a)：tr＝0.76min；[m+h]+：260.2。在4.96ppm處的ch2與8.08ppm處的ch(三唑)之間觀察到roesy信號。第二洗脫成分：(5-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯。lc-ms(a)：tr＝0.76min；[m+h]+：260.2。在4.96ppm處的ch2與2.97ppm處的ch(異丙基)之間觀察到roesy信號。7.2.(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸及(5-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸是使用類似實例2步驟2.2的方法且用步驟7.1的(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯代替中間體2.1來制備。lc-ms(a)：tr＝0.30min；[m+h]+：170.2?；蛘?，使用步驟7.1的區(qū)域異構(gòu)物的混合物得到(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸及(5-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸的混合物。7.3.2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體5.2代替中間體1.7且用步驟7.2中區(qū)域異構(gòu)物的混合物代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(iv)、隨后制備型手性hplc(vi)純化期望的化合物。制備型手性hplc的第一洗脫成分：2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮。lc-ms(b)：tr＝1.17min；[m+h]+：549.2。實例8：2-(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體5.2代替中間體1.7且用中間體3.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(ii)純化期望化合物。lc-ms(b)：tr＝1.23min；[m+h]+：563.2。實例9：2-(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體5.2代替中間體1.7且用中間體4.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(i)純化期望化合物。lc-ms(b)：tr＝1.09min；[m+h]+：551.2。實例10：2-(3-羥甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮在-30℃下在氬下向?qū)嵗?(25mg)于dcm(1ml)中的溶液中添加bbr3(58μl；1mindcm)并將所得懸浮液在0℃下攪拌3h。用h2o驟冷反應混合物，用飽和nahco3水溶液稀釋并用ea(3×)萃取。用鹽水洗滌合并的有機層，經(jīng)mgso4干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。制備型lc-ms(iv)得到5mg白色粉末狀物。lc-ms(a)：tr＝0.81min；[m+h]+：537.1。實例11：1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-2-(3-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮11.1.(3-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯該等化合物是使用類似于實例2步驟2.1且用3-丙基-1h-1,2,4-三唑代替3-乙基-1h-1,2,4-三唑的方法來制備。藉由制備型手性hplc(iii)純化區(qū)域異構(gòu)物的混合物。第一洗脫成分：(5-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯。lc-ms(a)：tr＝0.77min；[m+h]+：260.1。在4.95ppm處的ch2co2與2.65ppm處的ch2ch2ch3之間觀察到roesy信號。第二洗脫成分：(3-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯。lc-ms(a)：tr＝0.76min；[m+h]+：260.1。在4.96ppm處的ch2co2與8.08ppm處的ch(三唑)之間觀察到roesy信號。11.2.(3-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸該等化合物是使用類似于實例2步驟的方法2.2且用步驟11.1的(3-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯代替中間體2.1來制備。lc-ms(a)：tr＝0.35min；[m+h]+：170.4。11.3.1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-2-(3-丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體5.2代替中間體1.7且用中間體11.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(i)純化期望化合物。lc-ms(b)：tr＝1.17min；[m+h]+：548.9。實例12：2-[3-(1-羥基-1-乙基)-[1,2,4]三唑-1-基]-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮12.1.(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯此化合物是使用類似于實例2步驟2.1的方法且用1-(1h-1,2,4-三唑-5-基)乙酮代替3-乙基-1h-1,2,4-三唑來制備。藉由cc(biotage,snap10g筒，溶劑a：hep；溶劑b：ea；b％的梯度：30于4cv，30至70超過4cv，70于2cv，70至100超過2cv，100于2cv)純化粗制物，從而得到期望三唑區(qū)域異構(gòu)物作為第二份。lc-ms(a)：tr＝0.7min；[m+h]+：260.1。在8.28ppm處的ch(三唑)與5.1ppm處的ch2之間觀察到roesy信號。12.2.(3-乙?；?[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸此化合物是使用類似于實例2步驟2.2的方法且用中間體12.1代替中間體2.1來制備。lc-ms(a)：tr＝0.25min；[m+h]+:170.0。12.3.2-(3-乙?；?[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體5.2代替中間體1.7且用中間體12.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(i)純化期望化合物。lc-ms(a)：tr＝0.89min；[m+h]+：549.0。12.4.2-[3-(1-羥基-乙基)-[1,2,4]三唑-1-基]-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮在0℃下在氬下向中間體12.3(40mg)于thf(0.75ml)及etoh(0.25ml)中的淺黃色溶液中添加nabh4(1.4mg)并將反應混合物在0℃下攪拌1h30。然后，添加第二排nabh4(0.7mg)并將混合物再攪拌2h20。將反應混合物蒸發(fā)至干燥，將殘余物懸浮于ea中并添加飽和nh4cl水溶液并在rt下允許攪拌30min。分離各層并用1×鹽水洗滌有機層。用ea(2×)再萃取水層。將合并的有機層經(jīng)mgso4干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。藉由制備型tlc(dcm/meoh95/5)純化，得到10mg白色固體。lc-ms(a)：tr＝0.82min；[m+h]+：551.1。實例13：2-[3-(1-羥基-1-甲基-乙基)-[1,2,4]三唑-1-基]-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮在-20℃下向中間體12.3(40mg)于et2o(0.75ml)中的懸浮液中添加memgbr(48μl；3m于et2o中)并將所得懸浮液在rt下攪拌1h30。藉由添加飽和nh4cl水溶液驟冷反應混合物并用ea(3×)萃取水層。將合并的有機層經(jīng)mgso4干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。藉由制備型lc-ms(iv)純化，得到7mg白色粉末狀物。lc-ms(a)：tr＝0.84min；[m+h]+：565.1。實例14：1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丁氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮14.1.(r)-4-[4-(2-環(huán)丁氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯此化合物是使用類似于實例1步驟1.6的方法且用2-(環(huán)丁氧基)嘧啶-5-硼酸代替2-乙氧基嘧啶-5-硼酸來制備。藉由制備型lc-ms(ii)代替cc純化粗制物。lc-ms(a)：tr＝1.08min；[m+h]+：500.1。14.2.作為鹽酸鹽的2-環(huán)丁氧基-5-[5-((r)-3-甲基-哌嗪-1-基)-2-三氟甲基-噻唑-4-基]-嘧啶此化合物是使用類似于實例5步驟5.2的方法且用中間體14.1代替中間體5.1來制備。lc-ms(a)：tr＝0.71min；[m+h]+：400.1。14.3.1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丁氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-二甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體14.2代替中間體1.7且用步驟7.2中的區(qū)域異構(gòu)物混合物代替中間體2.2來制備。藉由cc(dcm/meoh97:3)隨后制備型lc-ms(i)及制備型手性hplc(iv)純化粗制物。第二洗脫成分(制備型手性hplc)：1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丁氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮：lc-ms(b)：tr＝1.21min；[m+h]+：551.3。在5.14-5.37ppm處的ch2與8.36ppm處的ch(三唑)之間觀察到roesy信號。實例15：1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮15.1.(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯此化合物是使用類似于實例1步驟1.6的方法且用2-環(huán)丙基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)嘧啶代替2-乙氧基嘧啶-5-硼酸來制備。lc-ms(a)：tr＝1.06min；[m+h]+：470.3。15.2.作為鹽酸鹽的2-環(huán)丙基-5-[5-((r)-3-甲基-哌嗪-1-基)-2-三氟甲基-噻唑-4-基]-嘧啶此化合物是使用類似于實例5步驟5.2的方法且用中間體15.1代替中間體5.1來制備。lc-ms(a)：tr＝0.6min；[m+h]+：370.1。15.3.1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-乙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體15.2代替中間體1.7來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化粗制物。lc-ms(b)：tr＝1.07min；[m+h]+：507.2。實例16：1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體15.2代替中間體1.7且用步驟7.2的(3-異丙基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化粗制物。lc-ms(a)：tr＝0.8min；[m+h]+：521.2。實例17：2-(3-叔丁基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體15.2代替中間體1.7且用中間體3.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化粗制物。lc-ms(b)：tr＝1.18min；[m+h]+：535.2。實例18：1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲氧基甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮；此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體15.2代替中間體1.7且用中間體4.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(iv)純化粗制物。lc-ms(a)：tr＝0.75min；[m+h]+：523.2。實例19：1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮19.1.(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯此化合物是使用類似于實例2步驟2.1的方法且用3-甲基-1h-1,2,4-三唑代替3-乙基-1h-1,2,4-三唑來制備。藉由制備型手性hplc(v)純化區(qū)域異構(gòu)物的混合物。第一洗脫成分：(5-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯。lc-ms(a)：tr＝0.68min；[m+h]+：232.16。1h-nmr(cdcl3)：7.83(s,1h)；7.40-7.33(m,5h)；5.23(s,2h)；4.93(s,2h)；2.43(s,3h)。在4.93ppm處的ch2co2與2.43ppm處的ch3之間觀察到roesy信號。第二洗脫成分：(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯。lc-ms(a)：tr＝0.67min；[m+h]+：232.16。1h-nmr(cdcl3)：8.05(s,1h)；7.40-7.30(m,5h)；5.23(s,0.95h,ch2)；4.93-4.88(3s,2h)；2.42(s,3h)。在8.05ppm處的ch(三唑)與4.93-4.88ppm處的ch2co2之間觀察到roesy信號。19.2.(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸此化合物是使用類似于實例2步驟2.2的方法且用步驟19.1的(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸芐基酯代替中間體2.1來制備。lc-ms(a)：tr＝0.18min；[m+h]+：142.22。19.3.1-{(r)-4-[4-(2-乙氧基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體19.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(v)純化粗制物。lc-ms(a)：tr＝0.81min；[m+h]+：497.1。實例20：2-(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-1-{(r)-2-甲基-4-[2-三氟甲基-4-(2-三氟甲基-嘧啶-5-基)-噻唑-5-基]-哌嗪-1-基}-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體5.2代替中間體1.7且用中間體19.2代替中間體2.2來制備。使用dipea代替net3。藉由制備型lc-ms(iii)純化粗制物。lc-ms(a)：tr＝0.87min；[m+h]+：521.0。實例21：1-{(r)-4-[4-(2-環(huán)丙基-嘧啶-5-基)-2-三氟甲基-噻唑-5-基]-2-甲基-哌嗪-1-基}-2-(3-甲基-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酮此化合物是使用類似于實例2步驟2.3的方法且用中間體15.2代替中間體1.7且用中間體19.2代替中間體2.2來制備。藉由制備型lc-ms(v)純化粗制物。lc-ms(a)：tr＝0.81min；[m+h]+：493.1。ii.生物學分析a)flipr分析：在熒光成像板讀取器(flipr：moleculardevices)中使用表現(xiàn)偶合至g蛋白(galpha(16))的人類cxcr3a(基因庫：ay242128)的經(jīng)改造cho-k1細胞測試化合物的生物活性。在生物分析的前一天將細胞平鋪于補充有10％fbs以及g418及潮霉素(hygromycin)抗生素的f12培養(yǎng)基中以維持重組選擇。在生物分析當天，將細胞洗滌并用于經(jīng)20mmph7.4的hepes及碳酸氫鈉(0.038％)緩沖且含有5mm丙磺舒(probenecid)的漢克氏平衡鹽溶液(hanksbalancedsaltsolution)(invitrogen)中的fluo-4-am(invitrogen)將染料加載1小時。此不含有染料且含有濃度為2.5mm的丙磺舒的緩沖液亦用于洗滌步驟(洗滌緩沖液)；或不含染料及丙磺舒但補充有0.1％bsa的緩沖液用于化合物稀釋步驟(稀釋緩沖液)。細胞經(jīng)洗滌不含過量染料并添加60微升洗滌緩沖液。測試化合物的原液是由10mm于dmso中的濃度構(gòu)成，且在稀釋緩沖液中連續(xù)稀釋至為抑制劑量反應曲線所需的濃度。在37℃下的10分鐘培育時段后，根據(jù)制造商的說明書在flipr儀器中將10微升每一化合物稀釋液自化合物板轉(zhuǎn)移至含有重組細胞的板。在基礎讀取之后，再次使用flipr儀器添加10微升濃度為20nm的cxcl10拮抗劑(來自peprotech)。監(jiān)測在添加測試化合物之前及之后的熒光變化。在基線減除之后輸出cxcl10添加之后超過基線位準的發(fā)射峰值。b)受體內(nèi)化分析(ria)：測試化合物的原液是由10mm于dmso中的濃度構(gòu)成，且在含有0.5％bsa的pbs中連續(xù)稀釋至為抑制劑量反應曲線所需的濃度。然后，將經(jīng)稀釋化合物與等體積的在pbs中稀釋的cxcl10(peprotech)混合?？鼓o脈人類全血添加至混合物中，然后將其在co2培育箱中在37℃下培育以允許配體介導的受體內(nèi)化(最終cxcl10濃度為9nm)。30min后，將血液與熒光標記的cxcr3及cd4特異性抗體(bectondickinson)混合并在冰上培育10分鐘。然后，將試樣與bdfacs溶解溶液(bectondickinson)混合以便消除紅血球。在用含有0.5％bsa的pbs洗滌細胞之后，然后在流式細胞計數(shù)器(facscantoii,bectondickinson)中分析試樣。為使用facsdiva軟件(bectondickinson)進行數(shù)據(jù)分析，對cd4陽性細胞測定對應于cxcr3細胞表面表現(xiàn)的平均熒光。所計算ic50值可端視每天分析性能而波動。本領域技術(shù)人員已知此類波動。在已針對同一化合物測定ic50值若干次的情形下，給出平均值。flipr分析的數(shù)據(jù)顯示于表1中且受體內(nèi)化分析(ria)的數(shù)據(jù)顯示于表2中。表1實例編號flipr：ic50(nm)實例編號flipr：ic50(nm)12.3120.921.6133.231.0141.2413152.5512160.762.0174.671.3183.181.6191.892.7201.6105.2215.2114.4表2c)hergq-patch分析：使用穩(wěn)定表現(xiàn)herg基因(登錄號u04270,bsys,witterswil,瑞士)的cho細胞及qpatch機器人平臺(sophion,ballerup,denmark)以單細胞模式在室溫下評估化合物對hergk通道的阻斷。使細胞在培養(yǎng)燒瓶中于37℃下在5％co2中在補充有9％(v/v)胎牛血清、0.9％青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin)(10,000u/ml,invitrogen15140148)、100μg/ml潮霉素b(invitrogen10687010)的培養(yǎng)基(ham的f-12營養(yǎng)混合物，invitrogen21765-029)中生長。當細胞約80％鋪滿(每2-3天)時，將其分裂用于進一步培養(yǎng)或用于電生理學分析。對于進一步培養(yǎng)，將細胞用0.25％胰蛋白酶edta溶液(invitrogen25200-056)分離并將一部分細胞(10-30％)重新接種于培養(yǎng)基中。對于電生理學，在實驗當天，用0.25％胰蛋白酶edta溶液分離細胞并將所有細胞皆懸浮于補充有20mmhepes及0.04mg/ml胰蛋白酶抑制劑的懸浮培養(yǎng)基(293sfmii,invitrogen11686-029)中。將細胞于32-35℃下在qpatch機器人中保持于懸浮培養(yǎng)基中直至使用，使用時將等份試樣轉(zhuǎn)移至含有0.3％v/vdmso的細胞外溶液(以mm計：nacl150；kcl4；cacl21.2；mgcl21；hepes10；ph7.4，含有naoh)并施加至測試板。利用膜片電壓鉗技術(shù)以全細胞構(gòu)形利用內(nèi)部溶液(以mm計：kcl,140；nacl,10；mgcl2,1；hepes,10；egta,5；ph＝7.2，含有koh)量測k+電流。使用qpatch機器人的內(nèi)部bessel濾波器以2khz的截止頻率低通過濾電流并在10khz下進行數(shù)字化。自-80mv的保持電壓藉由500-ms去極化至+20mv、隨后500-ms重新極化至-40mv產(chǎn)生k+尾電流；在重新極化至-40mv結(jié)束時量測尾電流幅值。脈沖模式是在實驗期間每10sec重復，在細胞外溶液中3min之后量測基線k+電流，然后施加含化合物的測試溶液，并在施加至細胞3分鐘后量測在化合物存在下的k+電流。相應測試溶液是藉由以下制備：(1)將測試化合物溶解于純凈dmso中，(2)于細胞外溶液中稀釋此dmso溶液，及(3)進一步添加dmso，使得最終測試溶液的濃度為300nm或3000nm測試化合物且含有0.3％v/vdmso。藉由在化合物存在下的電流除以基線電流將化合物效應量化為阻斷％；每一化合物實施兩次或三次實驗且最終值表示每一實驗結(jié)果的平均值。當前第1頁12