發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及基于第一前導(dǎo)(lead)免疫球蛋白設(shè)計針對靶標(biāo)優(yōu)化的免疫球蛋白文庫、優(yōu)選抗體文庫的方法。本發(fā)明的多個方面進(jìn)一步涉及通過該方法設(shè)計的免疫球蛋白文庫，并且涉及選自該文庫的免疫球蛋白。發(fā)明背景通常通過優(yōu)化初始前導(dǎo)抗體來設(shè)計抗體治療劑，從而選擇所需特征，如結(jié)合親和力、kd、或缺乏免疫原性。通常在動物如表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中生成人抗體。在前導(dǎo)候選抗體的生成和分離之后，可以以多種方式優(yōu)化抗體。通常，對前導(dǎo)抗體進(jìn)行測序，并且序列用于生成變體的抗體文庫以用于進(jìn)一步篩選?？梢允褂霉押塑账針?gòu)建變體以向編碼區(qū)(例如，針對cdr中的一個或多個進(jìn)行編碼的區(qū)域)中引入簡并性(degeneracy)。寡核苷酸可以用于針對抗體進(jìn)行編碼的核酸的區(qū)域的pcr擴(kuò)增。這通常將會生成包含許多變體的大文庫，其中利用許多潛在置換來替換在前導(dǎo)中的每個氨基酸殘基。之后可以將文庫克隆至表達(dá)載體中，從而生成抗體本身?？梢允褂谜故鞠到y(tǒng)如核糖體、噬菌體或酵母展示系統(tǒng)。之后可以將由此制備的抗體過濾以用于所需性質(zhì)的改善。關(guān)于這些已知方法的缺點是，生成可能遠(yuǎn)比將會顯示出理想性質(zhì)的多的變體。這增加了生成文庫和選擇用所需特征的變體抗體所需的時間和資源。此外，優(yōu)化完整人抗體的重鏈和輕鏈二者增加了所需的工作量，并且對于抗體的性質(zhì)來說引入了另外的不確定性，尤其是對于當(dāng)組裝時具有重和輕免疫球蛋白鏈二者的抗體來說。本發(fā)明意在解決這些缺點中的至少一些，并且提供用于生成免疫球蛋白文庫的另外的方法。這通過借助因體細(xì)胞超突變(somatichypermutation)過程而得到的免疫動物本身的某些變體的有效預(yù)選擇而部分實現(xiàn)。在天然抗體生成期間，b細(xì)胞的增殖伴隨著在b細(xì)胞受體基因座(locus)中極高的體細(xì)胞突變率，這產(chǎn)生了所需的抗體多樣性。突變主要集中在某些體細(xì)胞超突變熱點處。本發(fā)明利用這種多樣性的天然產(chǎn)生，從而告知了免疫球蛋白文庫的設(shè)計。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種設(shè)計用于優(yōu)化第一前導(dǎo)免疫球蛋白的生物學(xué)性質(zhì)的免疫球蛋白文庫的方法，所述方法包括：a)鑒別一種或多種相關(guān)免疫球蛋白，所述一種或多種相關(guān)免疫球蛋白與第一前導(dǎo)免疫球蛋白相關(guān)，各免疫球蛋白針對靶抗原通過用靶抗原使包含人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物免疫而產(chǎn)生；b)比較第一前導(dǎo)免疫球蛋白和一種或多種相關(guān)免疫球蛋白的氨基酸序列；c)基于序列比較鑒別(i)第一前導(dǎo)免疫球蛋白和一種或多種相關(guān)免疫球蛋白之間，和/或(ii)在一種或多種相關(guān)免疫球蛋白是多種免疫球蛋白的情況下，多種免疫球蛋白之間，存在變體氨基酸殘基的一個或多個位點，其中存在變體氨基酸殘基的一個或多個位點包括用于修飾第一前導(dǎo)免疫球蛋白的潛在位點；d)基于序列比較選擇用于修飾以用相關(guān)免疫球蛋白中的一種或多種的相應(yīng)變體氨基酸替換第一前導(dǎo)免疫球蛋白的氨基酸的一個或多個位點；并且e)基于在選擇的用于修飾的位點中的一個或多個處修飾的第一前導(dǎo)免疫球蛋白的序列生成用于文庫的免疫球蛋白序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白包含cdr3。免疫球蛋白可以包含一組cdr：cdr1、cdr2和cdr3，優(yōu)選一組重鏈cdr：hcdr1、hcdr2、和hcdr3。免疫球蛋白可以由僅有重鏈抗體的組成或者包含僅有重鏈的抗體。免疫球蛋白可以由vh結(jié)構(gòu)域組成或者包含vh結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，一種或多種相關(guān)免疫球蛋白是常見譜系(lineage)的并且結(jié)合與第一前導(dǎo)免疫球蛋白相同的靶抗原，優(yōu)選地相比于前導(dǎo)免疫球蛋白在至少一個cdr區(qū)中具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。常見譜系意指免疫球蛋白來源于相同種系(germline)序列，例如免疫球蛋白可以通過在非人哺乳動物中的種系序列的體細(xì)胞超突變而獲得，尤其是在用靶抗原使非人哺乳動物免疫之后。通過將前導(dǎo)免疫球蛋白序列、例如前導(dǎo)vh序列與相同譜系的其他免疫球蛋白序列、例如vh序列進(jìn)行比對，可以鑒別在免疫應(yīng)答期間靶向的體細(xì)胞超突變熱點。一種或多種相關(guān)免疫球蛋白通常在cdr3中與前導(dǎo)免疫球蛋白具有至少70％的同源性，優(yōu)選在cdr3中與前導(dǎo)免疫球蛋白具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。一種或多種相關(guān)免疫球蛋白通常在cdr1和/或cdr2中與前導(dǎo)免疫球蛋白具有至少70％的同源性，優(yōu)選在cdr1和/或cdr2中與前導(dǎo)免疫球蛋白具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。一種或多種相關(guān)免疫球蛋白通常在構(gòu)架區(qū)中與前導(dǎo)免疫球蛋白具有至少70％的同源性，優(yōu)選種系構(gòu)架區(qū)中與前導(dǎo)免疫球蛋白具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。一種或多種相關(guān)免疫球蛋白可以包括多種相關(guān)免疫球蛋白，包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25種免疫球蛋白。步驟c)可以包括鑒別在免疫球蛋白序列的cdr內(nèi)的用于修飾的位點，其中如果在相關(guān)免疫球蛋白中的至少一個、兩個、三個、四個、或五個中存在變體氨基酸殘基，則在cdr內(nèi)的位點被認(rèn)為是用于修飾的位點。步驟c)還可以包括鑒別在免疫球蛋白序列的cdr外的用于修飾的位點，其中如果在相關(guān)免疫球蛋白中的至少20％中存在變體氨基酸殘基，則在cdr外的位點被認(rèn)為是用于修飾的位點。如果修飾本將被鑒定為是用于修飾的位點的潛在的用于修飾的位點(尤其是cdr外的潛在的用于修飾的位點)將會導(dǎo)致向修飾的免疫球蛋白中引入以下特征中的一個或多個，則所述位點不被鑒別為是用于修飾的位點：(i)未配對的半胱氨酸，(ii)氧化位點(游離甲硫氨酸)，(iii)糖基化位點，(iv)脫酰胺位點，和(v)異構(gòu)化位點。在步驟d)中選擇的序列可以包括反映在用于修飾的位點處的修飾的每種可能的組合的變體序列。在選擇的用于修飾的位點處的修飾可以僅包括保守性氨基酸置換。變體免疫球蛋白可以不包含在選擇的用于修飾的位點外的修飾。步驟e)還可以包括生成另外的變體免疫球蛋白的序列，其中所述序列在選擇的用于修飾的位點中的一個或多個處被進(jìn)一步修飾，以利用針對相應(yīng)變體氨基酸的保守性氨基酸替換來替換第一前導(dǎo)免疫球蛋白的氨基酸。步驟e)還可以包括生成另外的變體免疫球蛋白的序列，其中所述序列在選擇的用于修飾的位點中的一個或多個處被進(jìn)一步修飾，以用未在相關(guān)免疫球蛋白的相應(yīng)殘基處發(fā)現(xiàn)的氨基酸來替換第一前導(dǎo)免疫球蛋白的氨基酸。在本文中所述的方法還可以包括步驟f)生成包含具有在步驟e)中生成的序列的免疫球蛋白的免疫球蛋白文庫?？梢允褂枚喾N在本領(lǐng)域中常規(guī)的方法生成文庫。本發(fā)明的方法還可以包括步驟g)篩選免疫球蛋白文庫以鑒別一種或多種具有所需生物學(xué)性質(zhì)的免疫球蛋白。所需的生物學(xué)性質(zhì)包括但不限于結(jié)合親和力、ic50、良好的表達(dá)特征、溶解性、穩(wěn)定性、缺乏免疫原性/抗藥物抗體(ada)生成的潛力。本發(fā)明的方法可以包括在步驟a)之前，生成并且測序包括第一前導(dǎo)免疫球蛋白和一種或多種相關(guān)免疫球蛋白在內(nèi)的多種免疫球蛋白的步驟α)。所述多種免疫球蛋白可以通過用靶抗原使非人哺乳動物、優(yōu)選小鼠或大鼠、優(yōu)選表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠免疫而生成。本發(fā)明的方法可以包括在步驟a)之前，鑒別第一前導(dǎo)免疫球蛋白的步驟β)?？梢曰谝环N或多種所需生物學(xué)性質(zhì)選擇第一前導(dǎo)免疫球蛋白，包括但不限于對靶抗原的適宜地高的結(jié)合親和力、對靶抗原的特異性、對靶抗原的選擇性、中和靶抗原的作用的能力、與來自其他物種的相應(yīng)靶抗原的所需的交叉反應(yīng)性、ic50、良好的表達(dá)特征、溶解性、穩(wěn)定性、缺乏免疫原性/ada的潛力。在本發(fā)明的方法中，免疫球蛋白可以是抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。免疫球蛋白可以包含僅有重鏈的抗體或者由僅有重鏈的抗體組成。免疫球蛋白可以包含抗體的vh結(jié)構(gòu)域或者由vh結(jié)構(gòu)域組成。本發(fā)明提供一種優(yōu)化前導(dǎo)免疫球蛋白的方法，所述方法包括：a)進(jìn)行上述本發(fā)明的方法；并且b)基于所述優(yōu)化的免疫球蛋白的所需生物學(xué)性質(zhì)從所述文庫中選擇一種或多種優(yōu)化的免疫球蛋白。本發(fā)明提供一種編碼多種免疫球蛋白的多核苷酸的文庫，其中根據(jù)上述本發(fā)明的方法設(shè)計所述多種免疫球蛋白的序列。本發(fā)明提供一種包含多種免疫球蛋白的文庫，其中根據(jù)上述本發(fā)明的方法設(shè)計所述多種免疫球蛋白的序列。本發(fā)明提供一種根據(jù)上述本發(fā)明的方法設(shè)計或選擇的分離免疫球蛋白。本發(fā)明提供一種包含編碼本發(fā)明的免疫球蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子。本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的免疫球蛋白的氨基酸序列的分離多肽。本發(fā)明提供一種載體，其包含本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明提供多種載體，其包含本發(fā)明的多核苷酸文庫。本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的一種載體或多種載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌，例如大腸桿菌(e.coli)；酵母、分離的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞系，例如cho或ns0細(xì)胞系。本發(fā)明提供一種獲得本發(fā)明的免疫球蛋白的方法，所述方法包括下列步驟：提供根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；允許宿主細(xì)胞表達(dá)由在載體中包含的核酸分子編碼的免疫球蛋白；并且將免疫球蛋白純化。所述方法還可以包括制備組合物，如包含所得到的免疫球蛋白的藥物制劑。本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的免疫球蛋白的嵌合或融合多肽。本發(fā)明提供一種綴合物，其包含與額外部分綴合或融合的本發(fā)明的免疫球蛋白或本發(fā)明的嵌合或融合多肽。額外部分可以包括對相同或不同靶抗原特異性的一種或多種vh結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選人vh結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞毒素，放射性核素，延長半衰期的部分，例如hsa或其變體、fc、peg或抗hsa結(jié)合分子，例如包含抗hsavh結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明提供組合物，如包含本發(fā)明的免疫球蛋白、本發(fā)明的嵌合多肽或本發(fā)明的綴合物的藥物制劑。附圖簡述圖1示出了抗il-17a克隆1.1vh家族以及僅有重鏈的前導(dǎo)抗體候選物克隆1.1(頂部行)的vh結(jié)構(gòu)域的序列以及相關(guān)抗體的那些。cdr部分以陰影表示。圖2示出了biacore數(shù)據(jù)，其顯示了分別針對靶標(biāo)人il-17a和il-17ra產(chǎn)生的(a)克隆1.1和(b)克隆2.1vh的結(jié)合動力學(xué)。圖3示出了基于針對標(biāo)記物(m)fermentas1k+梯運行的克隆1.1的用于構(gòu)建變體文庫的核酸區(qū)段的pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析。圖4示出了僅有重鏈的前導(dǎo)抗體候選物克隆2.1(頂部行)的vh結(jié)構(gòu)域的序列連同相關(guān)抗體的那些。cdr部分以陰影表示。圖5示出了基于針對標(biāo)記物(m)generuler100bp梯(thermosm0243)運行的克隆2.1的用于構(gòu)建變體文庫的核酸區(qū)段的pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析。圖6示出了biacore數(shù)據(jù)，其顯示了克隆1.1和克隆2.1vh的優(yōu)化的變體的結(jié)合動力學(xué)：(a)親本vh1.1，優(yōu)化的vh克隆1.10和1.6；(b)親本vh2.1和優(yōu)化的vh2.2。發(fā)明詳述現(xiàn)在將參照具體的實施方案進(jìn)一步描述本發(fā)明。應(yīng)理解的是，這些實施方案僅是說明本發(fā)明，并且本發(fā)明是如權(quán)利要求所限定的。此外，技術(shù)人員將會想到所描述的實施方案的改變和變化。通常，與在本文中所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和雜交結(jié)合使用的命名以及它們的技術(shù)是在本領(lǐng)域中公知和常用的那些。除非另外指出，本公開的方法和技術(shù)通常根據(jù)在本領(lǐng)域中公知的和如在整個說明書中引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法進(jìn)行。參見，例如，sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?molecularcloning:alaboratorymanual)(第2版，冷泉港實驗室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，冷泉港(coldspringharbor)，紐約(1989))。如在本領(lǐng)域中通常完成的或如在本文中所描述的，酶反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商說明書進(jìn)行。在本文中所述的與分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、以及藥物和制藥化學(xué)結(jié)合使用的命名以及它們的實驗室操作和技術(shù)是在本領(lǐng)域中公知和常用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成，化學(xué)分析，藥物制備、配制、和運輸，以及患者的治療。術(shù)語“抗體”廣義上是指由四個多肽鏈(兩個重(h)鏈和兩個輕(l)鏈)組成的任何免疫球蛋白(ig)分子或其抗原結(jié)合部分，或保持ig分子的必需的表位結(jié)合特征的任何功能片段、突變體、變體、或其衍生物。這樣的突變體、變體、或衍生物抗體形式是在本領(lǐng)域中已知的。在全長抗體中，每個重鏈由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為hcvr或vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3組成。每個輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為lcvr或vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域cl組成。vh和vl區(qū)可以進(jìn)一步分為被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的超變區(qū)，夾雜有被稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的更保守的區(qū)域。每個vh和vl由三個cdr和四個fr組成，其從氨基端到羧基端以下列順序設(shè)置：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、種類(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或子類的。如在本文中所描述的抗體也可以包含單一結(jié)構(gòu)域抗體或者由其組成，其中所述結(jié)構(gòu)域是vh免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。因此，抗體可以包含具有一個或多個vh結(jié)構(gòu)域但是沒有vl結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域抗體(svd、sdab或isv)或者由其組成。已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述了單一結(jié)構(gòu)域抗體；它們是其互補(bǔ)決定區(qū)是單一結(jié)構(gòu)域多肽的一部分的抗體。優(yōu)選地，一個或多個vh結(jié)構(gòu)域是人vh結(jié)構(gòu)域。如在本文中所使用的，術(shù)語vh或“可變重鏈結(jié)構(gòu)域”是指如由kabat等人，免疫學(xué)目的序列(sequencesofimmunologicalinterest)，第5版，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(u.s.dept.health&humanservices)，華盛頓特區(qū)(1991)所定義的免疫球蛋白可變重鏈結(jié)構(gòu)域。在可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的cdr氨基酸殘基的編號和定位是根據(jù)公知的kabat編號習(xí)慣。在本文中所述的抗體包含氨基酸序列，并且其優(yōu)選的序列和/或部分如cdr是在本文中限定的。術(shù)語“cdr”是指在抗體可變序列內(nèi)的互補(bǔ)決定區(qū)。在重鏈(和輕鏈，當(dāng)存在時)的可變區(qū)中的每一個中存在三個cdr，其對于可變區(qū)中的每一個來說表示為cdr1、cdr2和cdr3。術(shù)語“cdr組”是指在能夠結(jié)合抗原的單一可變區(qū)中出現(xiàn)的一組三個cdr。已經(jīng)根據(jù)不同的系統(tǒng)不同地限定了這些cdr的確切邊界。由kabat描述的系統(tǒng)是優(yōu)選的。術(shù)語“kabat編號”、“kabat定義”和“kabat標(biāo)記”在本文中可互換使用。在本領(lǐng)域中接受的這些術(shù)語是指對與抗體或其抗原結(jié)合部分的重和輕鏈可變區(qū)中的其他氨基酸殘基相比更可變(即高變)的氨基酸殘基進(jìn)行編號的系統(tǒng)(kabat等人，(1971)ann.nyacad.sci.190:382-391和kabat等人，(1991)免疫學(xué)目的蛋白的序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，第五版，美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(u.s.departmentofhealthandhumanservices)，nih出版號91-3242)。關(guān)于多肽或多核苷酸的比較的“同源性”通常是指，在對序列進(jìn)行比對并且在一些實施方案中引入空位(如果需要)以實現(xiàn)最大百分同源性并且不認(rèn)為任何保守性置換是序列同一性的一部分之后，在第一序列中與相應(yīng)第二多肽(或多核苷酸)的殘基相同的氨基酸(或核苷酸)殘基的百分比。無論是n端或c端延伸還是插入，都不應(yīng)被解釋為降低同一性或同源性。用于比對的方法和計算機(jī)程序是在本領(lǐng)域內(nèi)公知的?！氨Ｊ匦园被嶂脫Q”是在以下表中指出的那些：殘基保守性置換殘基保守性置換alaserleuile；valarglyslysarg；glnasngln；hismetleu；ileaspgluphemet；leu；tyrglnasnserthr；glycysserthrser；valgluasptrptyrglyprotyrtrp；phehisasn；glnvalile；leuileleu；val表1.保守性氨基酸置換術(shù)語“kd”是指“平衡解離常數(shù)”并且是指在滴定測量中在平衡時得到的值，或通過解離速率常數(shù)(koff)除以結(jié)合速率常數(shù)(kon)得到的值。“ka”是指親和性常數(shù)。結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和平衡解離常數(shù)用于表示抗體與抗原的結(jié)合親和力。用于確定結(jié)合和解離速率常數(shù)的方法是在本領(lǐng)域內(nèi)公知的。使用基于熒光的技術(shù)提供高靈敏度和在平衡時檢查生理緩沖液中的樣品的能力。可以使用其他實驗方法和儀器如(生物分子相互作用分析)。用于制備免疫球蛋白(假定是氨基酸序列或編碼氨基酸序列的核苷酸序列)的方法將會是對于技術(shù)人員來說已知的。某些技術(shù)可以用于促進(jìn)所制備的免疫球蛋白或免疫球蛋白文庫的篩選；例如，可以在噬菌體、噬菌粒、核糖體或適合的微生物(如酵母)上展示氨基酸序列的文庫，如促進(jìn)篩選。用于展示和篩選氨基酸序列(的組、集合或文庫)的適合的方法、技術(shù)和宿主生物將會是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說清楚的(參見例如，肽和蛋白質(zhì)的噬菌體展示：實驗室手冊(phagedisplayofpeptidesandproteins:alaboratorymanual)，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)；第1版(1996年10月28日)briank.kay,jillwinter,johnmccafferty)?？梢栽谵D(zhuǎn)基因嚙齒類動物中表達(dá)在本文中提及的免疫球蛋白。轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物，例如小鼠，具有降低的表達(dá)內(nèi)源性抗體基因的能力。在一個實施方案中，嚙齒類動物具有降低的表達(dá)內(nèi)源性輕和/或重鏈抗體基因的能力。因此嚙齒類動物可以包含額外修飾以干擾內(nèi)源性輕和/或重鏈抗體基因的表達(dá)，從而不制備功能性內(nèi)源性輕和/或重鏈。嚙齒類動物可以是小鼠。小鼠可以包含非功能性λ輕鏈基因座。因此，小鼠不產(chǎn)生功能性內(nèi)源性λ輕鏈。λ輕鏈基因座可以部分或完全缺失或者通過插入使其成為非功能性的。例如，至少恒定區(qū)基因c1、c2和c3可以缺失或者通過插入使其成為非功能性的?？梢詫⒒蜃δ苌铣聊瑥亩∈蟛划a(chǎn)生功能性λ輕鏈。此外，小鼠可以包含非功能性κ輕鏈基因座。因此，小鼠不產(chǎn)生功能性內(nèi)源性κ輕鏈。κ輕鏈基因座可以部分或完全缺失或者通過插入使其成為非功能性的。例如，具有功能上沉默的內(nèi)源性λ和κl鏈基因座的小鼠可以根據(jù)在wo2003/000737中公開的做出，其通過整體引用結(jié)合于此。此外，小鼠可以包含非功能性重鏈基因座。因此，小鼠不產(chǎn)生功能性內(nèi)源性重鏈。例如，如在wo2004/076618(通過整體引用結(jié)合于此)中描述的，所有8個內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)免疫球蛋白基因(μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α)均不存于小鼠中或者部分不存在達(dá)到它們?yōu)榉枪δ苄缘某潭?，或者基因δ、?、γ1、γ2a、γ2b和ε不存在并且側(cè)翼基因(flankinggene)μ和α部分不存在達(dá)到使它們成為非功能性的程度，或者基因μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε不存在并且α部分不存在達(dá)到使其成為非功能性的程度，或者δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α不存在并且μ部分不存在達(dá)到使其成為非功能性的程度。部分缺失意指，例如通過插入，內(nèi)源性基因座基因序列已經(jīng)缺失或破壞至沒有由基因座編碼功能性內(nèi)源性基因產(chǎn)物的程度，即沒有由基因座表達(dá)功能性產(chǎn)物。在另一個實施方案中，基因座是功能上沉默的。在一個實施方案中，小鼠包含非功能性重鏈基因座、非功能性λ輕鏈基因座和非功能性κ輕鏈基因座。因此小鼠不產(chǎn)生任何功能性內(nèi)源性輕或重鏈。因此，小鼠是三敲除(tripleknockout,tko)小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠包含編碼并且表達(dá)異源重鏈基因座的載體。yac是可以用于酵母中非常大的dna插入物的克隆的載體。除了包含具有與天然酵母染色體一樣的行為所必需的所有三個順式作用結(jié)構(gòu)元件(自主復(fù)制序列(ars)、著絲粒(cen)和兩個端粒(tel))之外，它們接受大dna插入物的能力使得它們能夠達(dá)到類似染色體的穩(wěn)定性和在酵母細(xì)胞中的運輸?shù)谋Ｕ嫘?fidelity)所需的最小尺寸(150kb)。yac的構(gòu)建和使用是在本領(lǐng)域內(nèi)公知的(例如，bruschi,c.v.和gjuracic,k.酵母人工染色體(yeastartificialchromosomes)，生命科學(xué)百科(encyclopediaoflifesciences)2002macmillanpublishersltd,naturepublishinggroup)?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠。用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的兩個最具有特點的途徑是通過遺傳物質(zhì)向新受精的卵母細(xì)胞中的原核顯微注射或者通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞向桑葚胚(morula)或胚泡(blastocyst)階段胚胎中的引入。無論如何引入遺傳物質(zhì)，都將被處理的胚胎轉(zhuǎn)移至其中懷孕繼續(xù)并且候選轉(zhuǎn)基因幼崽出生的假懷孕的雌性接受者。這些廣泛方法之間的主要差異是可以在它們用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物之前對es克隆進(jìn)行大規(guī)模篩選。相比之下，原核顯微注射依賴于在其引入之后整合至宿主基因組的遺傳物質(zhì)，并且一般來說，直到幼崽出生之后才能確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的成功結(jié)合。在本領(lǐng)域中已知存在許多既輔助又確定轉(zhuǎn)基因的成功整合是否發(fā)生的方法。可以通過多種手段產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，包括構(gòu)建體向基因組中的隨機(jī)整合、位點特異性整合、或同源重組。存在多種可以用于既驅(qū)動又選擇轉(zhuǎn)基因整合和后續(xù)修飾的工具和技術(shù)，包括抗藥性標(biāo)記物的使用(陽性選擇)、重組酶、重組介導(dǎo)的表達(dá)盒(cassette)交換、陰性選擇技術(shù)、和提高重組效率的核酸酶。這些方法中的大多數(shù)常用于es細(xì)胞的修飾中。然而，這些技術(shù)中的一些可以具有增強(qiáng)通過原核注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的效用。進(jìn)一步的改進(jìn)可以用于得到在所需背景中轉(zhuǎn)基因品系的更有效的產(chǎn)生。如上所述，在優(yōu)選實施方案中，將內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白表達(dá)沉默以允許將引入的轉(zhuǎn)基因僅用于表達(dá)可以用于藥物發(fā)現(xiàn)的僅有重鏈的組成成分?？梢匀缟纤鍪褂没蛱幚淼男∈螅玑槍λ袃?nèi)源性免疫球蛋白基因座(小鼠重鏈、小鼠κ鏈和小鼠λ鏈)沉默的tko小鼠?？梢酝ㄟ^繁殖實現(xiàn)任何引入的轉(zhuǎn)基因向這種tko背景的轉(zhuǎn)移(常規(guī)的或者包括ivf步驟以給出該過程的有效測量)。然而，也可以在轉(zhuǎn)基因操作期間包括tko背景。例如，對于顯微注射來說，卵母細(xì)胞可以來源于tko供體。類似地，可以得到來自tko胚胎的es細(xì)胞以用于轉(zhuǎn)基因。本文所述的免疫球蛋白可以與另一個部分綴合。該部分可以選自毒素、酶或放射性同位素；或延長半衰期的部分如hsa或peg或抗hsaig，例如抗hsavh。該部分可以選自細(xì)胞毒性分子如化療藥物、細(xì)菌和植物毒素以及放射性核素。在結(jié)合分子與腫瘤細(xì)胞結(jié)合以及藥物部分的細(xì)胞毒活性的釋放和/或活化時發(fā)生腫瘤細(xì)胞殺傷。通過藥物綴合物得到的選擇性使對正常細(xì)胞的毒性最小化，從而增強(qiáng)患者中藥物療法的耐受性。在本文中所述的是組合物，例如包含免疫球蛋白的藥物組合物。藥物組合物通常包含一種或多種活性劑(在這種情況下，是免疫球蛋白)和藥用載體。組合物可以根據(jù)所需的施用途徑來配制。施用途徑的實例包括但不限于局部施用，包括向或通過皮膚的皮膚施用，皮下或靜脈內(nèi)施用，口服、局部、腸胃外、舌下、直腸、陰道、眼部、和鼻內(nèi)施用。腸胃外施用包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。組合物可以采取一個或多個劑量單位的形式。技術(shù)人員將會知曉用于制備藥物制劑的適合的方法。藥用載體可以是微粒，從而組合物是例如片劑或粉劑形式的，例如是凍干的，以用于在使用之前重構(gòu)。一種或多種載體可以是液態(tài)的，并且組合物是，例如可注射液體。此外，一種或多種載體可以是氣態(tài)的，從而提供可用于例如吸入施用的氣霧劑組合物。術(shù)語“載體”是指稀釋劑、佐劑或賦形劑，組合物的活性劑與其一起施用。這樣的藥物載體可以是液體，當(dāng)靜脈內(nèi)施用在本文中所述的藥物組合物時，水或生理鹽水是優(yōu)選的載體。也可以使用鹽水溶液和葡萄糖和甘油水溶液作為液體載體，尤其是對于可注射溶液來說。如果需要，組合物還可以含有少量的潤濕或乳化劑、ph緩沖劑、或提高配制物的穩(wěn)定性和溶解性的試劑。組合物可以是液體的形式的，例如溶液、乳液或懸浮液。液體可以用于通過注射或靜脈內(nèi)輸注來遞送。在用于局部向皮膚施用或通過注射或輸注施用的組合物中，還可以包含表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖液、穩(wěn)定劑和等滲劑中的一種或多種。在本文中所描述的液體組合物，無論它們是溶液、懸浮液還是其他類似形式，還可以包含以下中的一種或多種：無菌稀釋劑如注射用水，鹽水溶液優(yōu)選生理鹽水、林格氏溶液(ringer'ssolution)、等滲氯化鈉，非發(fā)揮性油如合成的甘油單酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、或其他溶劑；抗菌劑如芐醇或?qū)αu苯甲酸甲酯；和用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖?？梢詫⒛c胃外組合物封裝在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃、塑料或其他材料制成的多劑量小藥瓶中。在本文中所述的免疫球蛋白的在特定病癥或病況的治療中有效/活性的量將會取決于病癥或病況的性質(zhì)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。此外，可以任選采用體外或體內(nèi)測定以幫助鑒別最佳的劑量范圍。在組合物中采用的精確劑量還將會取決于給藥途徑和疾病或病癥的嚴(yán)重性，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)從業(yè)人員的判斷和每位患者的情況確定。正確的劑量還將會根據(jù)特定的配制物、應(yīng)用方式、以及其特定的位置、宿主和被治療的疾病而變化。應(yīng)當(dāng)考慮其他因素，比如年齡、體重、性別、飲食、施用時間、排泄率、宿主的情況、藥物組合、反應(yīng)靈敏度和疾病的嚴(yán)重程度?？梢栽谧畲竽褪軇┝績?nèi)連續(xù)地或周期地進(jìn)行施用。實施例在針對內(nèi)源性重鏈和輕鏈產(chǎn)生沉默但是表達(dá)外源性人重鏈的轉(zhuǎn)基因三敲除小鼠中針對抗原il-17a和il-17ra產(chǎn)生包含vh的僅有重鏈的抗體。得到兩個前導(dǎo)抗體，克隆1.1和克隆2.1，并且在后續(xù)優(yōu)化步驟中使用。以下材料和方法部分提供了所使用的小鼠平臺和前導(dǎo)抗體的生成的簡要情況。優(yōu)化步驟和分析在實施例中描述。材料和方法用于免疫的tg/tko小鼠根據(jù)之前描述的(wo2004/076618和wo2003/000737,ren等genomics,84,686,2004；zou等,j.immunol.,170,1354,2003)，構(gòu)建攜帶在針對內(nèi)源性重鏈和輕鏈抗體表達(dá)沉默的背景下的種系構(gòu)型中的重鏈抗體轉(zhuǎn)基因基因座的小鼠(三敲除，或tko)。在具有包含與缺少ch1結(jié)構(gòu)域的小鼠免疫球蛋白恒定區(qū)基因、小鼠增強(qiáng)子和調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合的多種人vh、d和j基因的酵母人工染色體(yac)的新受精卵母細(xì)胞的原核顯微注射之后，得到轉(zhuǎn)基因(tg)小鼠。酵母人工染色體(yac)是可以用于酵母中非常大的dna插入物的克隆的載體。除了包含具有與天然酵母染色體一樣的行為所必需的所有三個順式作用結(jié)構(gòu)元件(自主復(fù)制序列(ars)、著絲粒(cen)和兩個端粒(tel))之外，它們接受大dna插入物的能力使得它們能夠達(dá)到類似染色體的穩(wěn)定性和在酵母細(xì)胞中的運輸?shù)谋Ｕ嫘运璧淖钚〕叽?150kb)。yac的構(gòu)建和使用是在本領(lǐng)域內(nèi)公知的(例如，bruschi,c.v.和gjuracic,k.酵母人工染色體(yeastartificialchromosomes)，生命科學(xué)百科(encyclopediaoflifesciences)2002macmillanpublishersltd,naturepublishinggroup/www.els.net)。所使用的yac為約340kb或572kb，包含其天然構(gòu)型中的10個人或23個重鏈v基因、人重鏈d和j基因、鼠cγ1基因和鼠3’增強(qiáng)子基因。其缺乏ch1外顯子。將轉(zhuǎn)基因祖先小鼠與缺少內(nèi)源性免疫球蛋白表達(dá)的動物回交以構(gòu)建在所描述的免疫研究中使用的tg/tko品系。用于免疫的抗原免疫使用重組的純化蛋白。重組人il-17a購自peprotech(peprotech,目錄號af-200-17)。還使用重組人il-17a。也可以使用其他免疫原并且包括如dna、粗蛋白和轉(zhuǎn)染細(xì)胞之類的材料。免疫方案向tg/tko施用重組蛋白。簡而言之，8-12周齡的小鼠各自接受在完全弗氏佐劑(completefreund’sadjuvant)中乳化并且皮下遞送的總計10μg的重組蛋白，接著進(jìn)行在不完全弗氏佐劑中乳化、也皮下施用、在初始啟動以各種間隔提供的1-10μg的重組蛋白的強(qiáng)化免疫。在磷酸鹽緩沖鹽水中，在不存在佐劑的情況下，腹膜內(nèi)施用最后劑量的抗原。也可以采用備選的免疫途徑和操作。例如，可以使用不同的佐劑或免疫增強(qiáng)操作代替弗氏佐劑。dna免疫通常肌內(nèi)遞送或通過基因槍遞送。盡管并非專門地，通常腹膜內(nèi)施用轉(zhuǎn)染細(xì)胞或來自這樣的細(xì)胞的膜制劑。來自免疫小鼠的文庫的生成和抗體vh的克隆a)處理組織、rna提取和cdna制造將脾、腹股溝和肱淋巴結(jié)從免疫的動物中收集至rnalatertm中。對于每只動物，單獨處理1/3的脾和4個淋巴結(jié)。首先，將組織均化；在將組織轉(zhuǎn)移至裂解基質(zhì)d珠管(lysingmatrixdbeadtube)(mpbio目錄號116913100)之后，加入600μl的含有β-巰基乙醇的rlt緩沖液(來自qiagenrneasy試劑盒，目錄號74104)，之后使用6m/s40秒的周期在mpbiofastprep均化器(目錄號116004500)中均化。將含有均化組織的管轉(zhuǎn)移至冰上，并且通過以10g微量離心5分鐘將碎片沉淀。將上清液的400μl的樣品移除并且用于rt-pcr。首先，遵循制造商規(guī)程使用qiagenrneasy試劑盒目錄號74104提取rna。之后將每個rna樣品用于使用superscriptiiirt-pcr高保真試劑盒(invitrogen目錄號12574-035)制備cdna。對于每個脾和lnrna樣品來說，進(jìn)行5次rt-pcr反應(yīng)，各自使用與用于vh1、vh2、vh3、vh4或vh6家族的引物結(jié)合的vh_j/f(長)引物。引物的詳情如下。表2.引物。加粗的殘基與pucg3具有同源性?；谝韵鹿芊磻?yīng)組分，為rt-pcr反應(yīng)制備主混合物(mastermix)。12.5μl2x反應(yīng)混合物0.5μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl酶混合物500ng-1μgrna用水達(dá)到25μl在熱循環(huán)器中使用以下條件進(jìn)行rt-pcr反應(yīng)：通過凝膠電泳確認(rèn)在370bp范圍內(nèi)的產(chǎn)物。對于每個小鼠，針對來自1/3脾的給定家族和4個淋巴結(jié)中的每一個對vh產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，并且之后集中以利用根據(jù)廠商說明書使用的thermo/fermentasgenejetpcr純化試劑盒(目錄號k0702)純化，并且將產(chǎn)物在50ul的水中洗脫。b.克隆至噬菌粒載體中在這些研究中采用噬菌粒載體pucg3。如所指出的，可以使用包括用ncoi和xhoi進(jìn)行限制性酶消化、連接和轉(zhuǎn)化的常規(guī)方法將vh克隆至pucg3中。備選地，可以使用基于pcr的方法構(gòu)建vh噬菌粒文庫。這兩種操作都用于由擴(kuò)增的vh序列生成文庫。在本領(lǐng)域中廣泛使用前一種方法并且可以找到詳情。對于基于pcr的方法來說，使用以下操作：使用pcr構(gòu)建pucg3的線性化形式；引物：pucg3-f3ctcgagggtggcggtagccatcaccaccatc(seqidno:65)pucg3-r3tccatggccatcgccggctgggccgcgag(seqidno:66)將具有g(shù)c緩沖液的phusion高保真pcr主混合物(目錄號f532l，neb)用于包含以下試劑的pcr反應(yīng)；所使用的循環(huán)條件是使用fermentasgenejet凝膠純化試劑盒(目錄號k0691)，根據(jù)廠商說明書，利用在40μl的洗脫緩沖液中的最終洗脫，將pcr產(chǎn)物(3152bp)凝膠純化?；谝韵路磻?yīng)，采用純化的vhrt-pcr產(chǎn)物作為具有線性化pucg3的大引物(megaprimer)，得到噬菌粒產(chǎn)物以用于轉(zhuǎn)化和文庫創(chuàng)建：pcr如下進(jìn)行；在1％瓊脂糖凝膠上分析pcr的產(chǎn)物。使用fermentaspcr純化試劑盒(目錄號k0702)，根據(jù)廠商說明書，并且最終洗脫在25μlh2o中的情況下，將各種家族vh/噬菌粒產(chǎn)物純化，并且用于使用biorad10×1mm比色杯(biorad目錄號165-2089)、eppendorfeporator和預(yù)熱的恢復(fù)培養(yǎng)基(lucigen，專用混合物)通過電穿孔將tg1大腸桿菌(lucigen，目錄號：60502-2)轉(zhuǎn)化。將2μl的純化產(chǎn)物加入至25μl的細(xì)胞中以用于電穿孔，并且以1800v對每個vh/噬菌粒產(chǎn)物進(jìn)行高達(dá)10次電穿孔。在以150rpm振蕩的情況下在37℃溫育1小時的50mlfalcon管中，集中并且回收電穿孔的細(xì)胞。進(jìn)行10倍稀釋系列的試樣量的轉(zhuǎn)化，并且接種在含有補(bǔ)充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素(ampicillin)的2xty瓊脂的佩特里培養(yǎng)皿(petridish)中。使用在這些培養(yǎng)皿上的所得克隆估算文庫大小。將其余部分的轉(zhuǎn)化接種在含有補(bǔ)充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2xty瓊脂的大號生物測定培養(yǎng)皿上。將所有瓊脂平板在30℃下溫育過夜。將10ml的2xty培養(yǎng)基加入至大號生物測定培養(yǎng)皿中，并且刮取菌落，并且測量od600(1.0的od＝5×108個細(xì)胞/ml)。將試樣在加入50％v/v甘油溶液(50％)之后在-80℃下儲存在冷凍小瓶(cryovial)中或者直接在噬菌體選擇過程中使用。抗體的選擇從免疫的小鼠中獲得多種僅有重鏈的抗體，并且通過結(jié)合elisa、生物化學(xué)抑制測定、基于細(xì)胞的抑制測定、和測定的組合，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，篩選對免疫原(il-17a或il-17ra)的結(jié)合親和力、抑制il-17a/il-17ra相互作用的能力、和結(jié)合動力學(xué)。從這些篩選中，選擇兩種抗體作為前導(dǎo)抗體——針對il-17a產(chǎn)生的克隆1.1和針對il-17ra產(chǎn)生的克隆2.1。biacore測定在biacoret200儀器上測量vh抗體的結(jié)合動力學(xué)。將靶標(biāo)(重組il-17a或il-17ra)在ph5.5的乙酸鹽緩沖液(biacore，目錄號br-100-52)中稀釋至1μg/ml并且使用胺偶聯(lián)化學(xué)(nhs-edc胺偶聯(lián)試劑盒，目錄號br-1000-50)和biacore固定wizard軟件與cm5系列s芯片(目錄號br-1006-68)偶聯(lián)。以這種方式，將100ru的靶標(biāo)固定，并且還制備空白表面(無靶標(biāo))以用于參比差減(referencesubtraction)。通過單循環(huán)動力學(xué)確定vh抗體的結(jié)合動力學(xué)。在稀釋系列(通常為以在最高濃度的100nmvh開始的1:3稀釋系列)中制備vh抗體，并且之后在涂布有抗原的表面以及空白表面上注射，以vh的最低濃度開始并且之后逐步工作多至最高濃度。之后根據(jù)(減去空白的)傳感圖描記圖使用1:1結(jié)合模型和biaevaluation軟件確定vh結(jié)合動力學(xué)。實施例1.含有體細(xì)胞超突變的組合的誘變的vh的生成a.含有體細(xì)胞超突變的組合的克隆1.1vh(抗il-17avh)變體的生成使用新型優(yōu)化策略以增加從免疫的小鼠分離的vh的結(jié)合親和力。將前導(dǎo)vh與相同譜系的其他成員進(jìn)行比對以鑒別在免疫應(yīng)答期間靶向的體細(xì)胞超突變熱點(圖1)。在這些位置處的氨基酸的選擇構(gòu)成了新的重組文庫方法的基礎(chǔ)，并且導(dǎo)致了以選擇在每個突變熱點處具有最佳氨基酸的較高親和力的vh為目標(biāo)的新的文庫的設(shè)計。作為il-17a的實例，將克隆1.1直接從如上所述的免疫的tg/tko小鼠中分離。顯示這種vh以高親和力與il-17a結(jié)合(圖2)。vh克隆1.1與相同譜系的其他成員的比對鑒別了許多在免疫應(yīng)答期間突變的氨基酸位置，并且vh-cdr和vh構(gòu)架區(qū)二者均受影響(圖1)。之后使用該信息設(shè)計旨在鑒別vh克隆1.1的較高親和力的變體的新的克隆1.1重組文庫。表3.引物將具有hf緩沖液的phusion高保真pcr主混合物(目錄號f531l，thermo)用于針對每個引物配對如下設(shè)置的pcr反應(yīng)：pcr如下進(jìn)行；在1％瓊脂糖凝膠上分析每個pcr的產(chǎn)物(圖3(a))。之后使用fermentaspcr純化試劑盒(k0701)將每個產(chǎn)物純化至40μl洗脫緩沖液中。之后設(shè)置裝配(assembly)pcr以重建完整vh序列：pcr如下進(jìn)行；將0.5μl的引物v3/pelb(長)和vh_j/f(長)(二者均為10μm)加入至反應(yīng)中，并且之后在以上條件下繼續(xù)額外10個pcr循環(huán)。將pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分析(圖3(b))并且使用fermentaspcr純化試劑盒純化至40μl洗脫緩沖液中。之后使用pcr產(chǎn)物作為大引物以用于如在實施例2中描述的文庫構(gòu)建。b.含有體細(xì)胞超突變的組合的克隆2.1vh(抗il-17ra)變體的生成也將相似的重組文庫方法用于以vh克隆2.1為名的抗il-17ra譜系。顯示這種vh以高親和力與il-17ra結(jié)合(圖2)?？寺?.1與相同譜系的其他成員的比對鑒別了許多在免疫應(yīng)答期間突變的氨基酸位置(圖4)。之后使用該信息設(shè)計旨在鑒別克隆2.1的較高親和力的變體的新的克隆2.1重組文庫。表4.引物將phusion高保真dna聚合酶(目錄號f518，thermo)用于針對每個引物配對如下設(shè)置的pcr反應(yīng)：pcr如下進(jìn)行；在1％瓊脂糖凝膠上分析每個pcr的產(chǎn)物(圖5(a))。之后使用fermentaspcr純化試劑盒(k0701)將每個產(chǎn)物純化。之后設(shè)置裝配(assembly)pcr以重建完整vh序列：將pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分析(圖5(b))并且使用fermentaspcr純化試劑盒純化至40μl洗脫緩沖液中。之后使用pcr產(chǎn)物作為大引物以用于如在實施例2中描述的文庫構(gòu)建。實施例2.誘變的克隆1.1和克隆2.1vh的噬菌體展示文庫的生成使用基于pcr的方法構(gòu)建含有克隆1.1和克隆2.1誘變序列的vh噬菌粒文庫?；谝韵路磻?yīng)，采用純化的vh裝配pcr產(chǎn)物(來自實施例1)作為具有線性化pucg3噬菌粒載體的大引物，得到產(chǎn)物以用于轉(zhuǎn)化和文庫創(chuàng)建；pcr如下進(jìn)行；使用fermentaspcr純化試劑盒(目錄號k0702)，根據(jù)廠商說明書，并且最終洗脫在25μlh2o中的情況下，將vh/噬菌粒pcr產(chǎn)物純化。將純化的vh/噬菌粒pcr產(chǎn)物用于使用biorad10×1mm比色杯(biorad目錄號165-2089)、eppendorfeporator和預(yù)熱的恢復(fù)培養(yǎng)基(lucigen，專用混合物)通過電穿孔將tg1大腸桿菌(lucigen，目錄號：60502-2)轉(zhuǎn)化。將2μl的純化產(chǎn)物加入至25μl的細(xì)胞中以用于電穿孔，并且以1800v對每個vh/噬菌粒產(chǎn)物進(jìn)行高達(dá)10次電穿孔。在以150rpm振蕩的情況下在37℃溫育1小時的50mlfalcon管中，集中并且回收電穿孔的細(xì)胞。進(jìn)行10倍稀釋系列的試樣量的轉(zhuǎn)化，并且接種在含有補(bǔ)充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素(ampicillin)的2xty瓊脂的佩特里培養(yǎng)皿(petridish)中。使用在這些培養(yǎng)皿上的所得克隆估算文庫大小。將其余部分的轉(zhuǎn)化接種在含有補(bǔ)充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2xty瓊脂的大號生物測定培養(yǎng)皿上。將所有瓊脂平板在30℃下溫育過夜。將10ml的2xty培養(yǎng)基加入至大號生物測定培養(yǎng)皿中，刮取菌落，并且測量od600(1.0的od＝5×108個細(xì)胞/ml)。將試樣在加入50％v/v甘油溶液(50％)之后在-80℃下儲存在冷凍小瓶(cryovial)中或者直接在噬菌體展示選擇中使用。在一些實例中，直接挑取克隆并且確定序列，得到文庫的多樣性的預(yù)估。對于克隆1.1和克隆2.1二者，構(gòu)建具有大于1e8(1x108)的重組體的噬菌體展示文庫以完全捕獲通過誘變pcr反應(yīng)產(chǎn)生的vh多樣性。實施例3.誘變的克隆1.1和克隆2.1vh文庫的噬菌體展示選擇根據(jù)公開的方法(抗體改造(antibodyengineering)，bennylo編，第8章，161-176頁，2004年)進(jìn)行文庫噬菌體儲備物的制備和噬菌體展示選擇。在大多數(shù)情況中，使用與淘選(panning)方法組合的噬菌體展示將結(jié)合vh結(jié)構(gòu)域分離。然而，在本領(lǐng)域中充分描述了各種不同的選擇方法，包括可溶性選擇、在應(yīng)力(例如，熱)下進(jìn)行的選擇和競爭性選擇，其中作為競爭加入過量的抗原或抗原反應(yīng)性vh結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)高親和力vh結(jié)構(gòu)域的恢復(fù)或者使選擇偏離特定的表位。對于克隆1.1和克隆2.1重組文庫二者來說，進(jìn)行一輪淘選選擇(將50μl體積在pbs中10ug/ml的抗原固定在maxisorb平板(nunc443404)上)，接著使用在后續(xù)幾輪選擇時降低量的抗原進(jìn)行2-3輪的可溶性選擇(1nm到低至100pm的生物素化抗原)。實施例4.具有改善的結(jié)合親和力的vh的鑒別使用biacoret200儀器篩選來自不同選擇的vh以鑒別具有改善的結(jié)合親和力的vh。將重組il-17a(peprotechaf-200-17)在ph5.5的乙酸鹽緩沖液(biacore，目錄號br-100-52)中稀釋至1μg/ml并且與cm5系列s芯片(目錄號br-1006-68)偶聯(lián)，使用胺偶聯(lián)化學(xué)(nhs-edc胺偶聯(lián)試劑盒，目錄號br-1000-50)和biacore固定wizard軟件。以這種方式，將100ru的il-17a固定，并且還制備空白表面(無il-17a)以用于參比差減(referencesubtraction)。對于il-17ra來說，首先通過在ph4的乙酸鹽緩沖液(biacore，目錄號br-100-49)中將蛋白質(zhì)g稀釋至20μg/ml來制備蛋白質(zhì)g芯片，并且之后使用胺偶聯(lián)化學(xué)將1200ru與cm5系列s芯片偶聯(lián)。之后使用該表面從溶液中捕獲il-17rafc融合蛋白：以30μl/分鐘流量注射10秒的在hbs中的10μg/ml的il-17ra將會將大約100-150ru的il-17ra捕獲至蛋白質(zhì)g表面上。通過單循環(huán)動力學(xué)確定優(yōu)化的克隆1.1(抗il-17a)和克隆2.1(抗il-17ra)vh的結(jié)合動力學(xué)。在稀釋系列(通常為以在最高濃度的100nmvh開始的1:3稀釋系列)中制備vh，并且之后在涂布有抗原的表面以及空白表面上注射，以vh的最低濃度開始并且之后逐步工作多至最高濃度。之后根據(jù)(減去空白的)傳感圖描記圖使用1:1結(jié)合模型和biaevaluation軟件確定vh結(jié)合動力學(xué)。在biacore分析之后，從重組文庫中分離對il-17a具有高達(dá)10倍提高的親和力的克隆1.1的變體(例如，克隆1.10和克隆1.6，圖6(a))。類似地，對于克隆2.1來說，分離新型變體(克隆2.2)，其對il-17ra的親和力提高了5倍(圖6(b))。序列表信息vh核酸序列1.1gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttattcgatgtactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtttctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaaatactacccctccactttgactactggggccagggaaccctggtcactgtctcctca(seqidno:9)1.6gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttatagcatgtactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccgagataaagcaagatggaagtgagcaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaaatactacccctctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca(seqidno:10)1.10gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttatcgcatgtactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccagcatagaacaagatggaagtgaggaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaagtcactgtttctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaaatactacccctctactttgactactggggccagggaaccctggtcactgtctcttca(seqidno:11)2.1caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggataccccttcaccagttatgatatcaattgggtgcgacaggccacaggacaaagccttgagtggatgggatggatgaaccctaacagtggtgacacagtctatgcacagaaattccagggcagagtcaccatgaccaggaatacctccataagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtatttttgtgcgagaggcagaagggatgactggaagaacaattattggggccagggaaccctggtcactgtctcctca(seqidno:12)2.2caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggataccccttcaccagttatgatatcaattgggtgcgacaggccacaggacgaagccttgagtggatgggatggatgaaccctaccaatggtaacacagtctatgcacagaaattccaggacagagtcaccatgaccaggaatacctccataagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtatttttgtgcgagaggcagaagggatgactggaagaacaattattggggccagggaaccctggtcactgtctcctca(seqidno:13)表5.vh氨基酸序列序列表<110>克雷森多生物制劑有限公司<120>用于制備優(yōu)化的治療分子的方法<130>pc927560wo<150>gb1500464.1<151>2015-01-12<160>66<170>bissap1.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1ggattgttattactcgcggcccag24<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>11<223>/note="n=a,c,t或g"<400>2ctggtgaaggngtatccagaagccttgc28<210>3<211>93<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>18<223>/note="n=a,c,t或g"<220><221>misc_feature<222>28<223>/note="g或c"<220><221>misc_feature<222>31<223>/note="a或t"<220><221>misc_feature<222>64<223>/note="a或g"<400>3gcaaggcttctggatacnccttcaccanttntgatatcaattgggtgcgacaggccacag60gacnaagccttgagtggatgggatggatgaacc93<210>4<211>70<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>20<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>41<223>/note="a或c或t"<220><221>misc_feature<222>44<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>46<223>/note="c或g或t"<220><221>misc_feature<222>47<223>/note="c或g或t"<220><221>misc_feature<222>48<223>/note="c或t"<400>4cctggtcatggtgactctgncctggaatttctgtgcatagncantnnnagggttcatcca60tcccatccac70<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5ggcagagtcaccatgaccaggaa23<210>6<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>12<223>/note="c或t"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