具有改善的凝乳特性的凝乳酶共混物的制作方法
本發(fā)明涉及具有改善的干酪制造特性的凝結(jié)劑共混物和/或其混合物。
背景技術(shù)：
通過凝乳酶((如凝乳酶和胃蛋白酶)對(duì)乳的酶促凝結(jié)是干酪制造中最重要的工藝之一。酶促乳凝結(jié)是一個(gè)兩階段過程：第一階段，其中蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白酶攻擊κ-酪蛋白，產(chǎn)生酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的亞穩(wěn)態(tài)；和第二階段，其中乳隨后凝結(jié)并形成凝結(jié)物。
凝乳酶(ec3.4.23.4)和胃蛋白酶(ec3.4.23.1)(哺乳動(dòng)物胃的凝乳酶)是天冬氨酸蛋白酶，屬于一大類肽酶。
當(dāng)在胃粘膜細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，凝乳酶和胃蛋白酶分別作為酶促無活性的前凝乳酶原和前胃蛋白酶原出現(xiàn)。當(dāng)凝乳酶被分泌時(shí)，將n-末端肽片段，前體片段(信號(hào)肽)切下以產(chǎn)生包含原片段(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是基本上無活性形式的酶，然而，其在酸性條件下，通過自催化去除原片段而活化為活性凝乳酶。該活化發(fā)生在體內(nèi)胃腔內(nèi)的適當(dāng)?shù)膒h條件下，或體外酸性條件下。
牛(即bostaurus)前凝乳酶原、凝乳酶原和凝乳酶的結(jié)構(gòu)和功能特征已被廣泛研究。牛前凝乳酶原分子的前體部分包含16個(gè)氨基酸殘基并且相應(yīng)的凝乳酶原的原部分具有42個(gè)氨基酸殘基的長度?；钚耘Ｄ槊赴?23個(gè)氨基酸，其為兩種形式a和b的混合物，這兩者都是活性的。
凝乳酶在哺乳動(dòng)物種如牛、駱駝、山羊、水牛、綿羊、豬、人、猴和大鼠中天然產(chǎn)生。
牛凝乳酶已被奶品工業(yè)商業(yè)利用多年。
wo02/36752a2(ch.hansen)描述了駱駝凝乳酶的重組生產(chǎn)。
wo2013/174840a1(ch.hansen)描述了牛和駱駝凝乳酶的突變體/變體。
wo2013/164479a2(dsm)描述了牛凝乳蛋白的突變體。
以下列出的參考文獻(xiàn)在本上下文中可被視為描述凝乳酶突變體的參考文獻(xiàn)：
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上述現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)集中于分子結(jié)構(gòu)和其對(duì)凝乳酶的特異性或性能的影響。
所述參考文獻(xiàn)均未公開具有不同性質(zhì)和來自不同來源的不同凝乳酶的組合效應(yīng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)特定的凝結(jié)劑和/或其混合物可用于控制干酪形成期間的細(xì)菌酸化速率和酸化終點(diǎn)。
此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明允許通過提供凝乳酶的特定共混物在軟質(zhì)干酪熟化和儲(chǔ)存期間對(duì)其結(jié)構(gòu)發(fā)展進(jìn)行可行控制。
如本文工作實(shí)施例中所討論的，本發(fā)明人還鑒別出許多凝結(jié)劑共混物，它們顯示出超過預(yù)期性能的具有商業(yè)吸引力的特征，如例如加速的凝乳硬度發(fā)展。
基于對(duì)凝結(jié)劑共混物的比較分析，本發(fā)明人鑒別出許多從通過制備共混物可得到改善的且優(yōu)異的凝結(jié)劑性能的意義上來說在本文中重要的共混物。
定義
本文相關(guān)術(shù)語的所有定義均符合本領(lǐng)域技術(shù)人員關(guān)于本文相關(guān)技術(shù)背景所應(yīng)理解的。
術(shù)語“凝結(jié)劑”涉及用于在干酪制備過程中使乳凝結(jié)的酶。為了完整性起見，凝乳酶被認(rèn)為是凝結(jié)劑。
術(shù)語“高c/p凝結(jié)劑”或“高c/p比凝結(jié)劑”涉及c/p>4.5(如例如c/p>5，如例如c/p>6，如例如c/p>7或c/p為6到12)的凝結(jié)劑，如例如凝乳酶。高c/p凝結(jié)劑的市售示例包括chymaxm或chymaxm1000(hansena/s)和maxirenxds(dsm)。
術(shù)語“低c/p凝結(jié)劑”或“低c/p比凝結(jié)劑”涉及c/p<4,5(如例如c/p<4，如例如c/p<2，如例如c/p<1.5，如例如c/p<1，如例如c/p<0.5或c/p<0.1)的凝結(jié)劑，如例如凝乳酶。低c/p凝結(jié)劑的市售示例包括hannilase
術(shù)語“凝結(jié)劑共混物”涉及用于例如在干酪制備過程中使乳凝結(jié)的酶的共混物。
術(shù)語“凝乳酶”涉及ec3.4.23.4類別的酶。凝乳酶具有高特異性，并且其通過切割酪蛋白的κ鏈中的單個(gè)105-ser-phe-|-met-ala-108鍵來使凝乳。用于本領(lǐng)域中的替代名稱是凝乳酶。
術(shù)語“凝乳酶活性”涉及本領(lǐng)域技術(shù)人員在本上下文中所理解的凝乳酶的凝乳酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定本文相關(guān)的凝乳酶活性。
在本文的工作實(shí)施例2中提供了確定凝乳酶比活性-或者被稱為凝結(jié)活性或凝乳活性的標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)施例。作為示例，可使用remcat方法來確定凝結(jié)活性，該方法是由國際乳業(yè)聯(lián)合會(huì)開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)方法(idf方法)。
術(shù)語“分離的變體”意指由人工修飾的變體。
術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯或任何翻譯后修飾(如n末端加工、c末端截短、糖基化、磷酸化等)后呈最終形式的肽。在本上下文中，可將本文相關(guān)的成熟凝乳酶多肽視為活性凝乳酶多肽序列-即不含前體部分和/或原部分序列。
術(shù)語“親本”或“具有凝乳酶活性的親本多肽”意指對(duì)其進(jìn)行改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的多肽。親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體。
術(shù)語“序列同一性”涉及兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性，并且可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的方法計(jì)算。
術(shù)語“變體”意指包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))位置處的改變(即替換、插入和/或缺失)的具有凝乳酶活性的肽。替換意指用不同氨基酸替代占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸；以及插入意指鄰近占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸添加1-3個(gè)氨基酸。
術(shù)語“野生型”凝乳酶肽意指由天然存在的生物體(如例如在自然界中發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物(例如駱駝或牛))表達(dá)的凝乳酶。
術(shù)語“具有不同來源的凝結(jié)劑”涉及來源于不同生物體或者借助遺傳修飾獲得的凝結(jié)劑。因此，在本發(fā)明的上下文中，牛野生型凝乳酶和遺傳修飾的牛凝乳酶被認(rèn)為是具有不同來源的凝結(jié)劑。
附圖簡述
圖1：本文相關(guān)的不同凝乳酶序列的比對(duì)。所示的“牛_凝乳酶_b(bos_bovis_chymosin_b)”是本文中的seqidno:1的牛凝乳酶，并且所示的“單峰駱駝(camelus_dromedarius)”是本文中的seqidno:2的駱駝凝乳酶。使用seqidno:1的牛凝乳酶作為如本文所述的參照序列，可以例如看出，牛凝乳酶在第10位具有“v”，并且駱駝凝乳酶在同一第10位具有“a”。例如還可以看出，牛/大鼠在第352位具有“q”，并且駱駝/雙峰駱駝(c._bactrianus)在同一第352位具有“e”。
關(guān)于圖1中所示的凝乳酶序列，綿羊與牛seqidno:1具有94.5％的序列同一性；雙峰駱駝與牛seqidno:1具有83.2％的序列同一性；單峰駱駝(seqidno:2的駱駝凝乳酶)與牛seqidno:1具有84％的序列同一性；豬與牛seqidno:1具有80.3％的序列同一性，并且大鼠與牛seqidno:1具有71.9％的序列同一性。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本上下文中所理解的，例如綿羊、雙峰駱駝、駱駝、豬或大鼠凝乳酶的成熟多肽序列與seqidno:1的成熟多肽(牛凝乳酶-即seqidno:1第59到381位的氨基酸)的本文相關(guān)序列同一性百分比與上述序列同一性百分比相對(duì)類似。
圖2：用不同的凝結(jié)劑共混物制成的布里干酪的硬度。
圖3：用不同的凝結(jié)劑共混物制成的布里干酪的粘度。
圖4：在利用不同的凝結(jié)劑共混物制成的布里干酪的脫模步驟的ph值。
圖5：在利用不同的凝結(jié)劑共混物制成的布里干酪的脫模步驟的干物質(zhì)(dm)。
圖6：本發(fā)明特別關(guān)注的凝結(jié)劑的選擇的相對(duì)蛋白質(zhì)水解作用特異性。
圖7：三種不同凝結(jié)劑溶液的凝結(jié)速度和硬度發(fā)展：以紅色實(shí)線標(biāo)示的駱駝凝乳酶(
具體實(shí)施方式
如本文所詳細(xì)例示的，本發(fā)明涉及包含兩種或更多種不同凝結(jié)劑的組合物。
在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明涉及用于凝結(jié)乳的組合物，所述組合物包含兩種或更多種具有不同來源的凝結(jié)劑的共混物。
在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中兩種或更多種凝結(jié)劑具有不同的c/p比和/或凝結(jié)活性，如例如至少三倍的差異。
在一個(gè)相關(guān)方面，從用0.5g/l氯化鈣溶液(ph≈6.5)由低熱低脂乳粉制備的標(biāo)準(zhǔn)乳基質(zhì)的可見絮凝所需的時(shí)間確定凝乳活性。將凝乳酶樣品的凝結(jié)時(shí)間與具有已知的凝乳活性并且具有與樣品相同的酶組成(通過idf標(biāo)準(zhǔn)110b確定)的參照標(biāo)準(zhǔn)物的凝結(jié)時(shí)間進(jìn)行比較。在相同的化學(xué)和物理?xiàng)l件下測量樣品和參照標(biāo)準(zhǔn)物。使用84mm乙酸ph5.5緩沖液將變體樣品調(diào)節(jié)到大約3imcu/ml。此后，向置于能夠在恒定攪拌下維持32℃±1℃的恒溫的水浴中的玻璃試管中的10ml預(yù)熱乳(32℃)中添加200μl酶。
相對(duì)于具有與根據(jù)下式的樣品相同的酶組成的標(biāo)準(zhǔn)物以國際凝乳單位(imcu)/ml計(jì)算凝乳酶的總凝乳活性(強(qiáng)度)：
s標(biāo)準(zhǔn)物：凝乳酶的國際參照標(biāo)準(zhǔn)物的凝乳活性。
t標(biāo)準(zhǔn)物：針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物稀釋物獲得的凝結(jié)時(shí)間(秒)。
d樣品：樣品的稀釋因子
d標(biāo)準(zhǔn)物：標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋因子
t樣品：針對(duì)稀釋的凝乳酶樣品獲得的從添加酶到絮凝時(shí)間的凝結(jié)時(shí)間(秒)
總蛋白質(zhì)含量的確定
使用來自thermoscientific的piercebca蛋白質(zhì)測定試劑盒，依照提供商的說明確定總蛋白質(zhì)含量。
凝結(jié)比活性的計(jì)算
通過將凝結(jié)活性(imcu/ml)除以總蛋白質(zhì)含量(mg總蛋白質(zhì)/ml)來確定凝結(jié)比活性(imcu/mg總蛋白質(zhì))。
在本文的工作實(shí)施例3中提供了確定蛋白質(zhì)水解活性的標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)施例。
作為示例，可使用熒光標(biāo)記的bodipy-fl酪蛋白(enzchek；molecularbioprobes，e6638)作為底物來測量總體蛋白質(zhì)水解活性。用ph不敏感的綠色熒光bodipy-fl大量標(biāo)記的酪蛋白衍生物導(dǎo)致綴合物熒光的幾乎完全淬滅。蛋白酶催化的水解釋放熒光bodipy-fl。該方法非常敏感，這對(duì)于該實(shí)驗(yàn)是必不可少的，因?yàn)榕c低c/p凝結(jié)劑相比，高c/p凝結(jié)劑經(jīng)常具有低的總體蛋白質(zhì)水解活性。
所述測定在調(diào)節(jié)到期望ph值且最終底物濃度為0.04mg/ml的0.2m磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。在將1份底物與1份酶(二者均在磷酸鹽緩沖液中制備)混合之前，將所有酶變體歸一化為50imcu/ml(根據(jù)實(shí)施例2)。將底物和酶在96孔nuncfluoro微量滴定板中混合，密封并在32℃培育60分鐘。在培育后，去除密封，并在熒光計(jì)中記錄熒光。
如本領(lǐng)域已知的，通過將凝結(jié)比活性(c)(imcu/ml)除以蛋白質(zhì)水解活性(p)(mu/ml)來確定本文相關(guān)的被稱為的c/p比。
如本領(lǐng)域已知的，較高的c/p比通常意味著由于非特異性蛋白質(zhì)降解而導(dǎo)致的例如干酪制造期間蛋白質(zhì)的損失減少，即干酪的產(chǎn)量提高，并且在成熟期間干酪苦味的產(chǎn)生減少。
本發(fā)明的另一方面涉及包含兩種或更多種不同凝乳酶的組合物，其中所述組合物帶來了凝結(jié)硬度和凝結(jié)速度方面的有益性質(zhì)。
測量它的一種方式是使用
該軟件測量凝乳中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的組織速度。將乳密度的變化和凝乳粘彈性的變化以用戶友好的圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，其可用于凝結(jié)劑表征或定義最佳凝乳剪切時(shí)間。
對(duì)于乳的制備，準(zhǔn)備含有500g根據(jù)目標(biāo)乳組合物的乳的容器并在添加凝乳酶前1小時(shí)將其在38℃的水浴中加熱到凝乳溫度。在使用乳之前，控制ph值并記錄下來。優(yōu)選的乳組合物的示例是：
具有3.8％蛋白質(zhì)、在90℃高溫處理30s的強(qiáng)化乳，
凝乳時(shí)的ph值：38℃，6.18以及4℃，6.28。
凝乳溫度：38℃。這種乳類型對(duì)應(yīng)于生產(chǎn)軟質(zhì)干酪乳類型時(shí)使用的乳組合物。
優(yōu)選的凝結(jié)劑制備如下：測試3種凝結(jié)劑溶液：駱駝凝乳酶(
可將每種凝結(jié)劑溶液添加到乳中(對(duì)于500g乳為1ml，因此為40imcu/1l)。在添加凝結(jié)劑后，通過上下翻轉(zhuǎn)將樣品混合30秒。在上下翻轉(zhuǎn)后，將10ml每種凝結(jié)劑溶液添加到chymograph中。
如本領(lǐng)域已知的，從不同哺乳動(dòng)物種(如牛、駱駝、綿羊、豬或大鼠)獲得的不同天然野生型凝乳酶多肽序列具有相對(duì)高的序列相似性/同一性。
在本文的圖1中，通過本文相關(guān)的不同凝乳酶序列的比對(duì)來例示。
在本上下文中，如圖1中所示的天然獲得的野生型凝乳酶(如牛凝乳酶或駱駝凝乳酶)在本文中可以是親本多肽，即對(duì)其進(jìn)行改變以產(chǎn)生本發(fā)明的變體凝乳酶多肽的親本多肽的示例。
在又一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中兩種或更多種凝結(jié)劑以不同的速率形成αs1和/或β-酪蛋白。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中兩種或更多種凝結(jié)劑具有不同的普通蛋白質(zhì)水解活性，如例如至少三倍的差異。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如上所述的組合物，其中所述組合物包含至少一種具有超過5imcu/mu的c/p比的凝結(jié)劑和具有在0.05到1.5imcu/mu范圍的c/p比的至少第二凝結(jié)劑。
例如，所述組合物可包含至少50w/w％一種具有超過5imcu/mu的c/p比的凝結(jié)劑和至少15w/w％具有在0.05到1.5imcu/mu范圍的c/p比的第二凝結(jié)劑，其中所述w/w％指示一種凝結(jié)劑相對(duì)于凝結(jié)劑總量的濃度。在又一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含至少70w/w％一種具有超過5imcu/mu的c/p比的凝結(jié)劑和15w/w％到30w/w％具有在0.05到1.5imcu/mu范圍的c/p比的第二凝結(jié)劑，其中所述w/w％指示一種凝結(jié)劑相對(duì)于凝結(jié)劑總量的濃度。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物包含來源于兩種或更多種不同的動(dòng)物種或動(dòng)物屬或微生物種或微生物屬的兩種或更多種凝結(jié)劑的共混物。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物包含兩種或更多種為相同親本凝結(jié)劑的變體的凝結(jié)劑的共混物。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中兩種或更多種不同的屬或種選自由奶牛、水牛、駱駝、豬、大鼠、綿羊或毛霉菌組成的列表。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中兩種或更多種不同的凝結(jié)劑中的至少一種來源于源自奶牛、水牛、駱駝、豬、大鼠、綿羊和/或毛霉菌的凝結(jié)劑。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物包含乳，如例如豆乳、綿羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、羊駝乳、駱駝乳或牛乳；和
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物是牛凝結(jié)劑和非牛凝結(jié)劑的共混物，或者是駱駝凝結(jié)劑和非駱駝凝結(jié)劑的共混物。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物包含相對(duì)于凝結(jié)劑的總量10-50％(如例如20％)的非牛凝結(jié)劑或非駱駝凝結(jié)劑。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物包含高c/p比的凝結(jié)劑和低c/p比的凝結(jié)劑。在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物包含相對(duì)于凝結(jié)劑的總量10-50％(如例如20％)的低c/p比的凝結(jié)劑。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如上所述的兩種或更多種凝結(jié)劑的共混物的食品或飼料組合物。食品或飼料組合物可以是軟質(zhì)干酪，如例如布里干酪或卡蒙貝爾干酪。
在再一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及如本文所公開的組合物，其中所述組合物用于制備軟質(zhì)干酪，例如布里干酪或卡蒙貝爾干酪，任選地，所述軟質(zhì)干酪是表面熟化的軟質(zhì)干酪。
此外，本發(fā)明涉及根據(jù)本文的任何方面所述的組合物在用于制備軟質(zhì)干酪的方法中的用途?？稍谔砑右环N或多種起子培養(yǎng)物后不遲于20分鐘，如例如不遲于15分鐘，如例如不遲于10分鐘，如例如不遲于5分鐘添加如本文的各方面所述的組合物。
如果適用的話，可增加獲得基于乳的產(chǎn)品的進(jìn)一步制造步驟。
例如，本發(fā)明提供用于制備發(fā)酵乳產(chǎn)品的方法，其包括以下步驟：
(a)將起子培養(yǎng)物添加到乳中并在28到42℃的溫度溫育所述培養(yǎng)物至少5分鐘；
(b)以總濃度為2000imcu/100l到3500imcu/100l添加包含兩種或更多種不同凝結(jié)劑的組合物；
(c)在28到42℃的溫度進(jìn)一步溫育所述培養(yǎng)物至少3小時(shí)；
(d)分離所述乳清以獲得干酪。
所述方法可有利地用于制備軟質(zhì)干酪，如例如布里干酪或卡蒙貝爾干酪。
再次，如所本文的任何方面所述的組合物可作為一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案在添加一種或多種起子培養(yǎng)物后不遲于20分鐘，如例如不遲于15分鐘，如例如不遲于10分鐘，如例如不遲于5分鐘添加。
確定目標(biāo)凝乳酶的氨基酸位置
如上所述，在本文中使用本文seqidno:1所公開的公知的牛凝乳酶序列作為用于確定本文相關(guān)的目標(biāo)凝乳酶多肽(例如駱駝、綿羊、牛等)的氨基酸位置的參照序列。
通過使用如上所述的熟知的計(jì)算機(jī)程序，確定在相應(yīng)凝乳酶中本文相關(guān)的目標(biāo)凝乳酶多肽(例如駱駝、綿羊、牛等)的氨基酸位置是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作。
用于制備分離的凝乳酶多肽變體的方法
如上所述，如本領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于其公知常識(shí)常規(guī)地生產(chǎn)和純化凝乳酶和凝乳酶變體。換句話說，一旦本領(lǐng)域技術(shù)人員擁有具有目標(biāo)凝乳酶活性的本文相關(guān)親本多肽(例如來自牛、駱駝、綿羊、豬或大鼠)，則制備此類目標(biāo)親本凝乳酶的變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作。
生產(chǎn)和分離凝乳酶(變體或親本)的適合方法的示例可以是眾所周知的，例如如例如wo02/36752a2(chr.hansen)中所述的基于真菌重組表達(dá)/生產(chǎn)的技術(shù)。
如本領(lǐng)域已知的，凝乳酶活性可通過所謂的c/p比來確定，所述c/p比通過將凝結(jié)比活性(c)除以蛋白質(zhì)水解活性(p)來確定。
在本文的工作實(shí)施例2中描述了確定凝結(jié)比活性(c)的適合方法，并且在本文的工作實(shí)施例3中描述了確定蛋白質(zhì)水解活性(p)的適合方法。
如上所述，在本文中使用本文seqidno:1所公開的公知的牛凝乳酶序列作為用于確定本文相關(guān)的目標(biāo)凝乳酶多肽(例如駱駝、綿羊、牛等)的氨基酸位置的參照序列。
如上所述，基于例如本文討論的計(jì)算機(jī)序列比對(duì)程序，確定本文相關(guān)的目標(biāo)凝乳酶多肽(例如駱駝、綿羊、牛等)的本文相關(guān)氨基酸位置是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本上下文中所理解的，具有凝乳酶活性的本文相關(guān)親本多肽可能已經(jīng)例如是例如相應(yīng)的野生型凝乳酶的變體。例如，與seqidno:2的野生型駱駝凝乳酶多肽相比，具有例如5-10個(gè)改變(例如替換)的駱駝凝乳酶變體仍是具有與seqidno:1的成熟多肽(牛)至少65％序列同一性的親本多肽，如例如本文第一方面所要求的。
換句話說，本文相關(guān)的分離的凝乳酶多肽變體可包含除例如本文第一方面的位置以外的其它位置的改變(例如替換)。
一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的凝乳酶多肽變體，其中所述改變包括在對(duì)應(yīng)于例如本文第一方面的任何位置的至少一個(gè)氨基酸位置的替換、缺失或插入。
可能優(yōu)選的是，所述肽的至少一個(gè)改變中存在的凝乳酶的差異是替換物，即本文中相關(guān)的凝結(jié)劑涉及分離的牛凝乳酶多肽變體，如例如其中所述改變包括在對(duì)應(yīng)于成熟牛凝乳酶親本序列中的第51位和/或第221位的任何一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸位置的替換(優(yōu)選a51v和k221m)的變體。
優(yōu)選地，親本多肽與seqidno:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少70％的序列同一性，更優(yōu)選地，親本多肽與seqidno:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少75％的序列同一性。
作為示例，本文適合的相關(guān)親本多肽可例如是牛凝乳酶a，如本領(lǐng)域已知的，與本文的seqidno:1的牛凝乳酶b相比，牛凝乳酶a可僅具有一個(gè)氨基酸差異。
如上所述，在本文的工作實(shí)施例中，使用seqidno:1的多肽(牛)作為親本多肽制備變體，此類變體在本文中可被稱為牛凝乳酶變體。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親本多肽與seqidno:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少90％的序列同一性，更優(yōu)選地，親本多肽與seqidno:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少95％的序列同一性，且甚至更優(yōu)選地，親本多肽與seqidno:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少97％的序列同一性。可能優(yōu)選的是，親本多肽是seqidno:1的成熟多肽(牛凝乳酶)。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本上下文中所理解的，具有凝乳酶活性的本文相關(guān)親本多肽可能已經(jīng)例如是例如相應(yīng)的野生型凝乳酶的變體。
用于制備基于乳的產(chǎn)品的方法
如上所述，可根據(jù)本領(lǐng)域使用包含如本文所述的兩種或更多種不同的凝結(jié)劑的組合物，例如以制備基于乳的目標(biāo)產(chǎn)品(如例如干酪產(chǎn)品)。
如上所述，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，其包括將有效量的如本文所述的凝結(jié)劑共混物添加到食品或飼料成分中，和實(shí)施進(jìn)一步的制造步驟以獲得所述食品或飼料產(chǎn)品。
優(yōu)選地，食品或飼料產(chǎn)品是基于乳的產(chǎn)品，并且其中所述方法包括將有效量的如本文所述的凝結(jié)劑共混物添加到乳中和實(shí)施進(jìn)一步的制造步驟以獲得基于乳的產(chǎn)品。
乳可以例如是豆乳、綿羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、羊駝乳、駱駝乳或牛乳。
基于乳的產(chǎn)品可以例如是發(fā)酵乳產(chǎn)品、凝乳酪(quark)或干酪。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及以下相關(guān)的總結(jié)方面：
方面1.一種用于凝乳的組合物，所述組合物包含兩種或更多種具有不同c/p比的凝結(jié)劑的共混物。
方面2.一種用于凝乳的組合物，所述組合物包含兩種或更多種具有不同來源的凝結(jié)劑的共混物，如例如駱駝凝乳酶和牛凝乳酶。
方面3.根據(jù)方面1或2所述的組合物，其中所述兩種或更多種凝結(jié)劑具有不同的普通蛋白質(zhì)水解活性，如例如至少三倍的差異。
方面4.根據(jù)前述方面中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含至少一種具有超過5imcu/mu的c/p比的凝結(jié)劑和具有0.05到1.5imcu/mu的c/p比的至少第二凝結(jié)劑。
方面5.根據(jù)前述方面中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含至少50w/w％一種具有超過5imcu/mu的c/p比的凝結(jié)劑和至少15w/w％具有在0.05到1.5imcu/mu范圍的c/p比的第二凝結(jié)劑，其中所述w/w％指示一種凝結(jié)劑相對(duì)于凝結(jié)劑總量的濃度。
方面6.根據(jù)前述方面中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含來源于兩種或更多種不同動(dòng)物種或動(dòng)物屬或微生物種或微生物屬的兩種或更多種凝結(jié)劑的共混物。
方面7.根據(jù)前述方面中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含至少70w/w％一種具有超過5imcu/mu的c/p比的凝結(jié)劑和15到30w/w％具有在0.05到1.5imcu/mu范圍的c/p比的第二凝結(jié)劑，其中所述w/w％指示一種凝結(jié)劑相對(duì)于凝結(jié)劑總量的濃度。
方面8.根據(jù)方面1到7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述兩種或更多種不同凝結(jié)劑中的至少一種來源于源自奶牛、水牛、駱駝、豬、大鼠、綿羊和/或毛霉菌的凝結(jié)劑。
方面9.根據(jù)前述方面中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含乳，如例如豆乳、綿羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、羊駝乳、駱駝乳或牛乳。
方面10.根據(jù)方面9所述的組合物，其中所述乳是牛乳。
方面11.根據(jù)方面9或10所述的組合物，其中所述乳含有約3％到約5％蛋白質(zhì)，如3.5％到4.5％蛋白質(zhì)，如3.8％蛋白質(zhì)。
方面12.根據(jù)方面9到11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述乳包含約1.5％到5％脂肪，如2.5％到4％脂肪，如3.5％脂肪。
方面13.根據(jù)方面1到12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物是牛凝結(jié)劑和非牛凝結(jié)劑的共混物，或者是駱駝凝結(jié)劑和非駱駝凝結(jié)劑的共混物，如例如駱駝凝乳酶和牛凝乳酶的共混物。
方面14.一種食品或飼料組合物，其包含根據(jù)前述方面中任一項(xiàng)所述的兩種或更多種凝結(jié)劑的共混物。
方面15.根據(jù)方面14所述的食品或飼料組合物，其中所述組合物是軟質(zhì)干酪，如例如布里干酪或卡蒙貝爾干酪。
方面16.根據(jù)方面15所述的食品或飼料組合物，其中所述軟質(zhì)干酪是表面熟化的軟質(zhì)干酪。
方面17.根據(jù)方面1到13中任一項(xiàng)所述的組合物在用于制備軟質(zhì)干酪的方法中的用途。
方面18.根據(jù)方面17所述的用途，其中在添加一種或多種起子培養(yǎng)物后不遲于20分鐘，如例如不遲于15分鐘，如例如不遲于10分鐘，如例如不遲于5分鐘將根據(jù)方面1到13中任一項(xiàng)所述的組合物添加到乳中。
方面19.一種用于制備基于乳的產(chǎn)品的方法，其包括添加有效量的根據(jù)方面1到13中任一項(xiàng)所述的組合物和實(shí)施進(jìn)一步的制造步驟以獲得所述基于乳的產(chǎn)品。
方面20.一種用于制備發(fā)酵乳產(chǎn)品的方法，其包括以下步驟：
(a)將起子培養(yǎng)物添加到乳中并在28到42℃的溫度溫育所述培養(yǎng)物至少5分鐘；
(b)以2000imcu/100l到3500imcu/100l的總濃度添加根據(jù)方面1到13中任一項(xiàng)所述的組合物；
(c)在28到42℃的溫度進(jìn)一步溫育所述培養(yǎng)物至少3小時(shí)；
(d)分離所述乳清以獲得干酪。
方面21.根據(jù)方面20所述的方法，其中在添加一種或多種起子培養(yǎng)物后不遲于20分鐘，如例如不遲于15分鐘，如例如不遲于10分鐘添加根據(jù)方面1到13中任一項(xiàng)所述的組合物。
方面22.根據(jù)方面20或21所述的方法，其中所述方法用于制備軟質(zhì)干酪，如例如布里干酪或卡蒙貝爾干酪。
實(shí)施例
實(shí)施例1：凝乳酶蛋白質(zhì)序列和變體序列的比對(duì)和編號(hào)
使用如由ebi(ebi,多序列比對(duì)工具,clustalw”,http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)提供以及如larkinma、blackshieldsg、brownnp、chennar、mcgettiganpa、mcwilliamh、valentinf、wallaceim、wilma、lopezr、thompsonjd、gibsontj、higginsdg(2007).bioinformatics23(21),2947-2948中所述的clustalw算法對(duì)凝乳酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)。
多個(gè)序列比對(duì)的clustalw2設(shè)置為蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣＝blosum，空位開放(gapopen)＝10，空位延伸(gapextension)＝0.05，空位距離(gapdistance)＝8，無末端空位(noendgap)，迭代＝無，numiter＝1，聚類＝nj
作為參照序列，使用牛凝乳酶b前凝乳酶原(genbank保藏號(hào)p00794-本文所公開的seqidno:1)，其中n-末端甲硫氨酸具有編號(hào)1(mrcl……)并且c-末端異亮氨酸(在蛋白質(zhì)序列……lakai中)具有編號(hào)381。將變體與牛b前-原凝乳酶比對(duì)，并且根據(jù)相應(yīng)的牛凝乳酶殘基對(duì)殘基編號(hào)。
實(shí)施例2：凝乳酶比活性的確定
2.1凝結(jié)活性的確定
使用remcat方法來確定凝乳活性，該方法是由國際乳業(yè)聯(lián)合會(huì)開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)方法(idf方法)。
從用0.5g/l氯化鈣溶液(ph≈6.5)由低熱低脂乳粉制備的標(biāo)準(zhǔn)乳基質(zhì)的可見絮凝所需的時(shí)間確定凝乳活性。將凝乳酶樣品的凝結(jié)時(shí)間與具有已知的凝乳活性并且具有與樣品相同的酶組成(通過idf標(biāo)準(zhǔn)110b確定)的參照標(biāo)準(zhǔn)物的凝結(jié)時(shí)間進(jìn)行比較。在相同的化學(xué)和物理?xiàng)l件下測量樣品和參照標(biāo)準(zhǔn)物。使用84mm乙酸ph5.5緩沖液將變體樣品調(diào)節(jié)到大約3imcu/ml。此后，向放置在能在恒溫?cái)嚢柘卤３?2℃±1℃的恒溫的水浴中的玻璃試管中的10ml預(yù)熱乳(32℃)中添加200μl酶。
根據(jù)下式計(jì)算相對(duì)于具有與樣品相同的酶組成的標(biāo)準(zhǔn)物凝乳酶的總凝乳活性(強(qiáng)度)，單位為每毫升國際凝乳單位(imcu)，
s標(biāo)準(zhǔn)物：凝乳酶的國際參照標(biāo)準(zhǔn)物的凝乳活性。
t標(biāo)準(zhǔn)物：針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物稀釋物獲得的凝結(jié)時(shí)間(秒)。
d樣品：樣品的稀釋因子
d標(biāo)準(zhǔn)物：標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋因子
t樣品：針對(duì)稀釋的凝乳酶樣品獲得的從添加酶到絮凝時(shí)間的凝結(jié)時(shí)間(秒)
2.2總蛋白質(zhì)含量的確定
使用來自thermoscientific的piercebca蛋白質(zhì)測定試劑盒，依照提供商的說明確定總蛋白質(zhì)含量。
2.3凝結(jié)比活性的計(jì)算
通過將凝結(jié)活性(imcu/ml)除以總蛋白質(zhì)含量(mg總蛋白質(zhì)/ml)來確定凝結(jié)比活性(imcu/mg總蛋白質(zhì))。
實(shí)施例3：蛋白水解活性的確定
使用熒光標(biāo)記的bodipy-fl酪蛋白(enzchek；molecularbioprobes，e6638)作為底物來測量普通蛋白質(zhì)水解活性。用ph不敏感的綠色熒光bodipy-fl大量標(biāo)記的酪蛋白衍生物導(dǎo)致綴合物熒光的幾乎完全淬滅。蛋白酶催化的水解釋放熒光bodipy-fl。該方法非常敏感，這對(duì)于該實(shí)驗(yàn)是必不可少的，因?yàn)閏hymaxm具有迄今為止已知的所有凝結(jié)劑的最低的普通蛋白質(zhì)分解活性。
所述測定在調(diào)節(jié)到期望ph值且最終底物濃度為0.04mg/ml的0.2m磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。在將1份底物與1份酶(二者均在磷酸鹽緩沖液中制備)混合之前，將所有酶變體歸一化為50imcu/ml(根據(jù)實(shí)施例2)。將底物和酶在96孔nuncfluoro微量滴定板中混合，密封并在32℃培育60分鐘。在培育后，去除密封，并在熒光計(jì)中記錄熒光。
實(shí)施例4：兩種類型的凝結(jié)劑共混物：駱駝-牛凝乳酶共混物和駱駝-米赫毛霉菌(mucormiehei)凝結(jié)劑的評(píng)價(jià)
在軟質(zhì)干酪技術(shù)中，使用高c/p比凝結(jié)劑如
然而，在一些情況下可被視為默認(rèn)的一般改良是較高的干酪硬度。
為了保持高c/p比如
已經(jīng)用不同的凝結(jié)劑比率生產(chǎn)了布里型穩(wěn)定的軟質(zhì)干酪。已經(jīng)在脫模和保存期間分析了干酪。
乳：(所有試驗(yàn)相同)
-蛋白質(zhì)：36.2g/l(未添加乳清蛋白質(zhì))
-脂肪：61.7g/l
-脂肪/蛋白質(zhì)比：1.7
-巴氏滅菌：72℃/20秒
-總體積/試驗(yàn)：500l(5桶100l)
-添加的cacl2：15g/100l
-凝結(jié)劑添加溫度：40℃
-凝結(jié)劑添加時(shí)的ph值：6.3
-凝結(jié)劑劑量：3000imcu/100l乳(對(duì)應(yīng)于8287imcu/g蛋白質(zhì))。
凝結(jié)劑共混物：
-已經(jīng)測試了第一種類型的共混物：具有20％、30％或50％
-已經(jīng)測試了第二種類型的共混物：具有20％或30％
-已經(jīng)進(jìn)行了具有相同的劑量和參數(shù)的純
結(jié)果：
(值為5桶的平均值)
-脫模時(shí)的ph值(圖4)：對(duì)于所使用的兩種類型的低c/p比凝結(jié)劑，均觀察到當(dāng)增加低c/p比組分時(shí)得到脫模時(shí)的較低ph值的微小傾向：從純
-質(zhì)地：已使用具有軋刀工具的taxt2透度計(jì)，在25天保存期后對(duì)干酪進(jìn)行質(zhì)地測量。
-硬度(圖2)：硬度隨著共混物中低c/p凝結(jié)劑的百分比增加而明顯降低，然后穩(wěn)定在較高的百分比。對(duì)于
-粘度(圖3)：當(dāng)將
-最佳質(zhì)地：本實(shí)驗(yàn)的目的是降低硬度；然而，粘度不是期望的特征。因此，對(duì)于兩種類型的低c/p比的凝結(jié)劑，用于質(zhì)地改善的最佳共混物均為20％。
-脫模時(shí)的干物質(zhì)(dm)(圖5)：與純
-干物質(zhì)相對(duì)于硬度：將這些干物質(zhì)結(jié)果與質(zhì)地測量進(jìn)行比較，我們可以看出，與純
-最佳結(jié)果：使用這些不同的結(jié)果，我們可以看出，對(duì)于
實(shí)施例5：確定牛凝乳酶、駱駝凝乳酶和共混凝乳酶的凝結(jié)行為。
為了追蹤凝結(jié)行為，我們使用了
該軟件測量凝乳中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的組織速度。將乳密度和凝乳粘彈性的變化以用戶友好的圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，其可用于凝結(jié)劑表征或定義最佳凝乳切割時(shí)間。
乳制備
準(zhǔn)備含有500g根據(jù)目標(biāo)乳組合物的乳的容器并在添加凝乳酶前1小時(shí)將其在38℃的水浴中加熱到凝乳溫度。在使用乳之前，控制ph值并記錄下來。
乳組成
具有3.8％蛋白質(zhì)的強(qiáng)化乳，高熱處理：90℃保持30s，
凝乳時(shí)的ph值：38℃，6.18以及4℃，6.28。
凝乳溫度：38℃。這種乳類型對(duì)應(yīng)于生產(chǎn)軟質(zhì)干酪乳類型時(shí)使用的乳組合物。
凝結(jié)劑制備
測試3種凝結(jié)劑溶液：駱駝凝乳酶(
將每種凝結(jié)劑溶液添加到乳中(對(duì)于500g乳為1ml，因此為40imcu/1l)。在添加凝結(jié)劑后，通過上下翻轉(zhuǎn)將樣品混合30秒。在上下翻轉(zhuǎn)后，將10ml每種凝結(jié)劑溶液添加到chymograph中。
結(jié)果
如圖7中所描繪的，使用牛凝乳酶和駱駝凝乳酶的共混物(chymaxsoft)時(shí)的凝結(jié)速度超過單獨(dú)使用駱駝凝乳酶(
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