相關(guān)申請的交叉引用本申請要求提交于2015年2月17日的美國臨時申請no.62/117189的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時申請的公開內(nèi)容以引用方式并入本文。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明整體涉及用于診斷和預(yù)測慢性瓣膜病的方法，并且特別涉及通過測量與慢性瓣膜病相關(guān)聯(lián)的微rna(mirna)來診斷和預(yù)測慢性瓣膜病的方法。相關(guān)領(lǐng)域的描述心臟病是犬中最常見的疾病之一。慢性瓣膜病(cvd)(也稱為退行性尖瓣病(dmvd))侵襲約9％的所有犬，且隨著年齡而增加，使得總累計發(fā)病率大于40％。cvd的特征在于房室瓣(最常見地為二尖瓣)的進行性退化和畸變，從而導致早期二尖瓣關(guān)閉不全。這繼而因二尖瓣反流而導致出現(xiàn)收縮期心雜音，其中二尖瓣閉合不充分致使血液流回左心房。受患的犬最終發(fā)展成左房室口容量超負荷、肺水腫、心房擴大和心室上心律不整。雖然外科手術(shù)處理或藥物治療受患瓣膜是可能的，但是寵物主人優(yōu)選營養(yǎng)干預(yù)。早期檢測和治療是必要的，然而檢測卻可能因為缺乏癥狀而很困難。專利申請(pct/us201344011)描述了利用差異性表達的基因和代謝物診斷cvd的方法。然而，基因表達方法需要收集心臟組織，這被視為是侵入性的。此外，mrna不是非常穩(wěn)定并且可能難以經(jīng)由實驗處理。此外，從血清測量代謝物可能是困難的，這取決于化合物的生物化學性質(zhì)和穩(wěn)定性。因此，仍然需要診斷和預(yù)測動物cvd的方法，以提供最適當和有效的治療水平。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明的一個目的是提供診斷和預(yù)測動物慢性瓣膜病的方法。該目的和其它目的利用診斷和預(yù)測動物慢性瓣膜病的方法來實現(xiàn)，該方法包括：從動物獲得樣本；分析樣本與慢性瓣膜病相關(guān)聯(lián)的mirna的量；比較樣本中鑒定的mirna的量和來自一個或多個未患有慢性瓣膜病的相當對照動物樣本中存在的對應(yīng)的mirna的量；以及診斷患有慢性瓣膜病的動物的動物樣本中存在的mirna是否在對照動物的樣本中差異性表達。本發(fā)明另外的和更多目的、特征和優(yōu)點對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。具體實施方式定義術(shù)語“動物”是指易患有或患有慢性瓣膜病的任何動物，包括人類、鳥類動物、牛科動物、犬科動物、馬科動物、貓科動物、山羊類動物、狼類動物、鼠科動物、綿羊類動物或豬類動物。術(shù)語“mirna”或“生物標志物”是指小單鏈非編碼rna分子，包括約21-25個核苷酸的那些，其水平或強度在生物樣本中測量，其可用作標志物以診斷疾病狀態(tài)。術(shù)語“差異表達”或“差異性表達”是指增加或上調(diào)的mirna表達或指減少或下調(diào)的mirna表達，如由樣本中mirna量的存在與否或變化所檢測的那樣。術(shù)語“相當對照動物”是指相同物種和類型的動物或在兩個不同時間評估的個體動物。術(shù)語“對應(yīng)的量”是指得自相當對照動物的mirna的量，對應(yīng)于診斷患有慢性瓣膜病的動物的mirna，其中mirna與慢性瓣膜病相關(guān)聯(lián)。術(shù)語“伴侶動物”是指家養(yǎng)動物(例如狗、貓、鳥、兔子、豚鼠、雪貂、倉鼠、小鼠、沙鼠、消遣用馬、奶牛、山羊、綿羊、驢、豬)以及為了陪伴、消遣、心理支持、性格外向展現(xiàn)和人類需要與其它物種的動物分享的所有其它功能而由人類飼養(yǎng)的更奇特的物種。在一個方面，伴侶動物可指狗或貓。在一個具體方面，伴侶動物可指狗。術(shù)語“診斷”意指確定動物是否易患慢性瓣膜病或者預(yù)測動物是否易于發(fā)展慢性瓣膜病。術(shù)語“早期”意指基于americancollegeofveterinaryinternalmedicine(acvim)診斷hf的指南，具有輕度到中度心臟擴大但無心力衰竭(hf)臨床征象的b期心力衰竭(hf)。術(shù)語“末期”意指基于acvim指南具有中度hf臨床征象的c期hf。如本文使用，本文使用的范圍都是縮略范圍，以免必須列出和描述范圍內(nèi)的每個數(shù)值。可選擇范圍內(nèi)的任何適當?shù)闹?，適當時，可選擇上限值、下限值或該范圍的端值。如本文所用，詞語的單數(shù)形式包括復數(shù)，反之亦然，除非上下文明確另外規(guī)定。因此，提及“一個”、“一種”和“該”通常包括相應(yīng)術(shù)語的復數(shù)形式。例如，提及“一種方法”包括提及多種此類“方法”。與此類似，詞語“包括”、“包含”和“含有”都作包含性而非排他性地解釋。同樣地，術(shù)語“包括”、“包含”和“或”都應(yīng)當視為包含性的，除非上下文明確禁止這一解釋。在此公開的方法、組合物和其它進展不限于本文所述的具體方法、方案及試劑，因為正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到的，這些具體方法、方案及試劑可改變。此外，本文所用的術(shù)語只出于描述具體實施方案的目的，并非旨在限制、也不會限制本文公開或受權(quán)利要求書保護的范圍。除非另外定義，否則本文使用的全部科技術(shù)語、專門術(shù)語及首字母縮略詞都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域或使用這些術(shù)語的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義。本文中引述或提及的所有專利、專利申請、出版物、技術(shù)和/或?qū)W術(shù)論文以及其它參考文獻都在法律允許的范圍內(nèi)全文以引用方式并入本文。對這些參考文獻的論述僅旨在總結(jié)其中作出的論斷。我們并不承認任何這些專利、專利申請、出版物或參考文獻或它們的任何一部分是相關(guān)的、實質(zhì)性的或為現(xiàn)有技術(shù)。特別保留質(zhì)疑這些專利、專利申請、出版物及其它參考文獻是相關(guān)的、實質(zhì)性的或為現(xiàn)有技術(shù)的任何斷言的準確性和相關(guān)性的權(quán)利。本發(fā)明本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本文所述的mirna可存在于動物的生物樣本中，并且可通過指示或預(yù)測慢性瓣膜病的閾值而將樣本中mirna的量用作診斷慢性瓣膜病的生化指標。這樣，本發(fā)現(xiàn)允許獸醫(yī)和其它臨床醫(yī)生對樣本中的這些“生物標志物”進行測試，并且確定動物是否易患或患有慢性瓣膜病以及是否需要進一步診斷或治療。在已確定需要進一步診斷或治療的情況下，此類進一步診斷或治療的成本和風險可為合理的。根據(jù)上文，本發(fā)明提供用于診斷動物慢性瓣膜病的方法。所述方法包括：從動物獲得樣本；分析樣本與慢性瓣膜病相關(guān)聯(lián)的微rna(mirna)的量；比較樣本中鑒定的mirna的量和來自一個或多個未患有慢性瓣膜病的相當對照動物樣本中存在的對應(yīng)的mirna的量；以及診斷患有慢性瓣膜病的動物的動物樣本中存在的mirna的量是否在對照動物的樣本中差異性表達。在一個實施方案中，用于診斷動物慢性瓣膜病的方法可包括：從動物獲得樣本；分析樣本與慢性瓣膜病相關(guān)聯(lián)的mirna的量；比較樣本中鑒定的mirna的量和來自一個或多個未患有慢性瓣膜病的相當對照動物樣本中存在的對應(yīng)的mirna的量；以及診斷患有慢性瓣膜病的動物的動物樣本中存在的mirna的量是否大于對照動物樣本中存在的mirna的量。在另一個實施方案中，用于診斷動物慢性瓣膜病的方法可包括：從動物獲得樣本；分析樣本與慢性瓣膜病相關(guān)聯(lián)的mirna的量；比較樣本中鑒定的mirna的量和來自一個或多個未患有慢性瓣膜病的相當對照動物樣本中存在的對應(yīng)的mirna的量；以及診斷患有慢性瓣膜病的動物的動物樣本中存在的mirna的量是否小于對照動物樣本中存在的mirna的量。在各種實施方案中，可對一個或多個相當對照動物的mirna進行評估，所述動物不為針對慢性瓣膜病而評估的動物并且為已確定未患有慢性瓣膜病的動物，并且將此類評估的結(jié)果用作基線值以與對mirna作評估的動物的結(jié)果進行比較。在一些實施方案中，mirna的基線值可通過評估多個相當對照動物來測定。在另一個實施方案中，可在整個動物生命的各個時段測定動物mirna的量，并且結(jié)果可用于確定動物是否易患或患有慢性瓣膜病，例如如果mirna的量隨動物年齡而增加或減少，則動物可被診斷為易患或患有慢性瓣膜病。在一些實施方案中，可對動物進行周期性評估并且可記錄mirna的結(jié)果。因此，如果后續(xù)評估示出mirna的量自上次評估以來增加或減少，則動物可被診斷為易患或患有慢性瓣膜病。在一些方面，mirna的具體變化可與慢性瓣膜病的早期或末期相關(guān)。生物來源的任何樣本均可用于本發(fā)明。示例包括但不限于血液(血清/血漿)、腦脊髓液(csf)、尿液、糞便、呼吸物、唾液、或任何組織活檢切片。在一個實施方案中，樣本可為血清樣本。當在本文使用術(shù)語“血清”時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到也可使用血漿或全血或全血的亞級分?？衫缡褂帽绢I(lǐng)域公知的任何方法在mirna水平上測定表達的減少或增加以對多核苷酸進行定量，所述方法諸如pcr(包括但不限于rt-pcr和qpcr)、測序、northern印跡法、微陣列、或其它雜交方法。雖然使用一種mirna足以診斷慢性瓣膜病，但使用一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、或四種或更多種此類mirna也涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。可對mirna進行評估并用于以任何組合進行診斷。這樣，本發(fā)明方法可包括基于上調(diào)的mirna和下調(diào)的mirna來診斷cvd。在一個實施方案中，診斷可基于確定存在于動物樣本中的mirna的量是否大于所比較的對照動物樣本中存在的mirna的量。在一個方面，mirna可包括mir-103、mir-98、let-7c、或let-7b。在一個實施方案中，診斷可基于確定存在于動物樣本中的mirna的量是否小于所比較的對照動物樣本中存在的mirna的量。在一個方面，mirna可包括mir-302d、mir-380、mir-874、mir-582、mir-490、mir-329b、或mir-487b。差異表達的mirna可有統(tǒng)計意義上的顯著性，如本文所例示的那樣。在一些方面，統(tǒng)計顯著性可包括p<0.05、p<0.01、或甚至p<0.001。在各種實施方案中，動物可為人或伴侶動物。在一個方面，伴侶動物可為犬科動物例如狗，或貓科動物例如貓。在一個具體方面，動物可為犬科動物。實施例本發(fā)明可通過以下實施例進一步闡釋，但應(yīng)當理解，這些實施例僅出于闡釋目的而包含在本文中，并不打算限制本發(fā)明的范圍，除非另有特別說明。實施例1通過表達譜差異分析(differentialexpressionprofiling)研究來鑒定mirna，從而比較患病樣本和正常血清樣本。通過委員會認證的獸醫(yī)心臟病專家所實施或評估的超聲波心動描記術(shù)，心臟的病理檢查，或者這兩者，將犬分類為具有健康心臟或cvd。利用americancollegeofveterinaryinternalmedicine(acvim)/europeancollegeofveterinaryinternalmedicine(ecvim)分期方案基于其心力衰竭(hf)的階段將犬劃分到下列三組之一：a組(a期，處于風險但未被侵襲，6只犬)、b組(b期，具有輕度到中度心臟擴大但無心力衰竭的臨床征象，6只犬)、或c組(c期，具有中度心力衰竭的臨床征象，6只犬)(表1)。這三組犬通過年齡、體型和性別進行匹配。從各個組的犬中收集血清并保存于-80℃直至使用。表1：用于mirna研究的血清樣本組別數(shù)量疾病階段分類a6acvima期：處于風險但未被侵襲b6acvimb期：輕度到中度心臟擴大，但無hf的臨床征象c6acvimc期：中度hf的臨床征象。將樣本送至qiagen以使用qiagen’smirnapcr陣列系統(tǒng)進行mirna提取和pcr定量。分析總共277種已知犬科動物的mirna。使用anova(方差分析)進行數(shù)據(jù)分析。anovap值被調(diào)節(jié)用于多個測試，并使用benjaminiandhochberg方法計算假發(fā)現(xiàn)率(fdr)。計算b組與a組之間(fc_bva)，以及c組與a組之間(fc_cva)的表達倍數(shù)變化。使用fdr<0.05的閾值選擇差異表達的mirna。選定總共11種mirna(表2)。表2：差異表達的mirnaaanova標稱p值；b假發(fā)現(xiàn)率；c正倍數(shù)變化數(shù)指示由對照樣本上調(diào)；負數(shù)指示由對照樣本下調(diào)。本說明書已公開了本發(fā)明的通常優(yōu)選的實施方案。雖然采用了特定術(shù)語，但這些術(shù)語僅以一般性和描述性意義使用，而非出于限制目的。本發(fā)明的范圍在權(quán)利要求書中陳述。顯然，按照以上教導內(nèi)容，本發(fā)明的許多修改形式和變型形式皆是可能的。因此，應(yīng)當理解，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)可以不同于具體描述的其它形式實施本發(fā)明。當前第1頁12