本發(fā)明涉及減少煙草植物中煙草特有的亞硝胺或它們的前體。特別地，本發(fā)明涉及側(cè)生邊界結(jié)構(gòu)域(lateralbounddomain，lbd)氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的方法和應(yīng)用并且涉及煙草植物及它們的下游產(chǎn)品(例如，繁殖材料、收獲的葉、加工過的煙草和煙草產(chǎn)品)。
背景技術(shù)：
：如圖1所示，煙草特有的亞硝胺(tsna)由尼古丁和相關(guān)化合物通過發(fā)生在煙草的烘烤(curing)和加工期間的亞硝化反應(yīng)形成。風(fēng)干煙草中的亞硝化劑通常是衍生自通過烘烤期間微生物的作用的葉片硝酸鹽的還原反應(yīng)的亞硝酸鹽。并且已經(jīng)證明亞硝胺的生產(chǎn)與硝酸鹽/亞硝酸鹽和一氧化氮的高水平有關(guān)(liangs.,yangj.,zhouj.,yuj.,may.,bair.,xuf.,yangc.applicationofexogenoussubstancesreducestobacco-specificnitrosaminescontentbyregulatingbiosynthesisofnicotineandnitriteinburleytobacco.actaphysiol.plant.(2013)35:3027-3036；shih.,wangr.,bushl.p.,yangh.,fanninf.f.therelationshipsbetweentsnasandtheirprecursorsinburleytobaccofromregionsandvarieties.journaloffood,agriculture&environment(2012)10(3&4):1048-1052)。tsna的減少是煙草行業(yè)的理想目標(biāo)。氮(n)和硝酸鹽(no3-)的可用性調(diào)節(jié)植物代謝、生長和發(fā)育的許多方面。植物特有的側(cè)生器官邊界結(jié)構(gòu)域(lbd)基因家族對植物側(cè)生器官發(fā)育是必不可少的，同時(shí)也參與了氮代謝調(diào)控。三個n/no3-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的lbd基因家族的成員(lbd37、lbd8和lbd39)作為擬南芥(arabidopsisthaliana)中花青素生物合成的負(fù)調(diào)節(jié)物(rubing.,tohget.,matsudaf.,saitok.,scheiblew-r.membersofthelbdfamilyoftranscriptionfactorsrepressanthocyaninsynthesisandaffectadditionalnitrogenresponsesinarabidopsis.plantcell(2009)21(11):3567-3584)。據(jù)認(rèn)為，lbd37-39信號n可用于植物系統(tǒng)，導(dǎo)致抑制特定n缺乏響應(yīng)，如花青素合成。lbd基因同樣抑制許多其他已知的n應(yīng)答基因，包括no3-攝取和同化(導(dǎo)致改變的no3-含量)，硝酸還原酶的活性/活化作用，蛋白質(zhì)、氨基酸和淀粉的水平，花青素合成和n相關(guān)的生長表型所需要的關(guān)鍵基因(rubin等，2009)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供了一種用于減少煙草植物中至少一種煙草特有的亞硝胺(tsna)或其前體的方法，包括通過增加lbd(側(cè)生器官邊界結(jié)構(gòu)域)氮響應(yīng)性(nitrogen-responsive)轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)來修飾植物。在另一個方面，提供了lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子用于減少煙草植物中至少一種tsna或其前體的應(yīng)用。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)具有至少一種tsna或其前體的減少的煙草植物、煙草植物繁殖材料、煙葉、切割的收獲煙葉、加工的煙葉或切割并加工的煙葉的方法，該方法包括修飾所述煙草植物以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)。在另一個方面，此處提供了一種構(gòu)建體或載體，包含與葉片特異性啟動子或葉片偏好性啟動子可操作地連接的編碼lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的核酸。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建體或載體，包含與衰老特異性啟動子可操作地連接的編碼lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的核酸。在進(jìn)一步的方面，提供了一種煙草細(xì)胞：i)包含外源性lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子；ii)包含本發(fā)明的構(gòu)建體或載體；和/或iii)是由本發(fā)明的方法或應(yīng)用可獲得的(例如，獲得的)。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種煙草植物：i)它已進(jìn)行修飾以實(shí)現(xiàn)與未修飾的植物相比至少一種tsna或其前體的減少，其中修飾是在所述修飾的植物中增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)；ii)包含外源性lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子；iii)是由本發(fā)明所描述的方法或應(yīng)用可獲得的；iv)包含根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體或載體；和/或v)包含根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面，提供了可獲自本發(fā)明的煙草植物的煙草植物繁殖材料(例如，植物種子)。本發(fā)明進(jìn)一步提供：·本發(fā)明的煙草細(xì)胞用于生產(chǎn)煙草產(chǎn)品的應(yīng)用；·本發(fā)明的煙草植物用于繁殖煙草植物的應(yīng)用；·本發(fā)明的煙草植物用于生產(chǎn)煙草產(chǎn)品的應(yīng)用；·本發(fā)明的煙草植物用于種植作物的應(yīng)用；和·本發(fā)明的煙草植物用于生產(chǎn)煙葉(例如，加工的(優(yōu)選烘烤的)煙葉)。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的煙草植物的收獲的葉，或可獲自從本發(fā)明的繁殖材料繁殖而來的煙草植物的收獲的葉，或可獲自通過根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用獲得的煙草植物的收獲的葉。此外，本發(fā)明提供了加工過的煙葉：i)包含本發(fā)明的煙草細(xì)胞；ii)可獲自從本發(fā)明的應(yīng)用可獲得的煙草植物；iii)是通過加工本發(fā)明的煙草植物可獲得的；iv)可獲自從根據(jù)本發(fā)明的煙草植物繁殖材料繁殖而來的煙草植物；或v)是通過加工本發(fā)明的煙草植物的收獲的葉可獲得的。發(fā)明進(jìn)一步提供了由以下制得的煙草產(chǎn)品：i)根據(jù)本發(fā)明或其一個部分的煙草植物；ii)由根據(jù)本發(fā)明的煙草植物繁殖材料繁殖的煙草植物或其部分；iii)根據(jù)本發(fā)明的煙草植物的收獲的葉；或iv)根據(jù)本發(fā)明的加工過的煙葉。附圖說明現(xiàn)將僅通過實(shí)例的方式參考附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方式，其中：圖1示出由前體如尼古丁和降煙堿經(jīng)由煙草煙霧中亞硝化反應(yīng)形成煙草特有的亞硝胺(tsna)。圖2示出024-0147構(gòu)建體(lbd37，組成型啟動子)、024-0148構(gòu)建體(lbd38，組成型啟動子)、0138-0148構(gòu)建體(lbd38，衰老特異性啟動子)和024-0149構(gòu)建體(組成型啟動子)的氨基酸水平。圖3示出由用024-0147((組成型啟動子的lbd37)、0138-0148(lbd38在衰老特異性啟動子上)和0138-0149(lbd39在衰老特異性啟動子上)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的烤煙中nnk和nnn的水平。圖4示出用024-0147(lbd37在組成型啟動子上)、0138-0148(lbd38在衰老特異性啟動子上)和0138-0149(lbd39衰老特異性啟動子上)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的地面煙草中尼古丁的水平。圖5示出用0138-0149(lbd39在衰老特異性啟動子上)、0138-0148(lbd38在衰老特異性啟動子上)和024-0147(lbd37在組成型啟動子上)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的煙草植物的產(chǎn)量。圖6示出來自擬南芥的lbd37(seqidno:1和2)、lbd38(seqidno:3和4)和lbd39(seqidno:5和6)的核苷酸和氨基酸序列。圖7示出擬南芥lbd37(atlbd37)、lbd38(atlbd38)和lbd39(atlbd39)對來自不同植物物種的同源蛋白質(zhì)的對齊。具體實(shí)施方式本發(fā)明人首次令人驚奇地示出，通過增加煙草植物中l(wèi)bd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)，可以減少至少一種煙草特有的亞硝胺(tsna)或其前體。眾所周知，通過如圖1示出的亞硝化反應(yīng)，煙葉中的殘留氮有助于亞硝胺的形成。特別地，硝酸鹽和亞硝酸鹽和一氧化氮(no)在烘干的葉片中作為煙草特有的亞硝胺(tsna)形成的前體。不希望被理論束縛，通過調(diào)節(jié)lbd基因表達(dá)來修飾硝酸鹽同化作用被認(rèn)為有能力調(diào)節(jié)亞硝酸鹽和一氧化氮(no)的生產(chǎn)以及因此在煙葉烘烤和加工期間形成的tsna的水平。然而，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是高度出乎意料的。本發(fā)明提供了lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子用于減少煙草植物中至少一種tsna或其前體的應(yīng)用。由具有增加的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)的煙草植物制得的煙草產(chǎn)品中tsna含量或濃度的減少是非常有利的技術(shù)效果。在一個實(shí)施方式中，提供了生產(chǎn)煙草植物、煙草植物繁殖材料、煙葉、加工的煙葉、切割的煙葉或切割并加工的煙葉的方法，其具有至少一種tsna或其前體的減少，該方法包括修飾所述煙草植物以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)。在此使用的術(shù)語“煙草特有的亞硝胺”或“tsna”具有在領(lǐng)域內(nèi)的一般含義，即，僅在煙草產(chǎn)品或其他含尼古丁的產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的亞硝胺。合適地，至少一種煙草特有的亞硝胺可以是4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)、n’-亞硝基降煙堿(nnn)、n’-亞硝基去氫新煙堿(nat)或n-亞硝基新煙堿(nab)。更合適地，至少一種煙草特有的亞硝胺可以是nnk或nnn。當(dāng)被用于涉及至少一種煙草特有的亞硝胺時(shí)，術(shù)語“其前體”指的是煙草植物的一種或多種化學(xué)品或化合物，其引起形成煙草特有的亞硝胺或涉及引起煙草特有的亞硝胺的產(chǎn)生的亞硝化反應(yīng)。合適地，術(shù)語“其前體”可能指的是硝酸鹽、亞硝酸鹽或一氧化氮。在一個實(shí)施方式中，當(dāng)與未被修飾以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)的煙草植物相比時(shí)，實(shí)施本發(fā)明的方法和或應(yīng)用使得在修飾的煙草植物中至少一種tsna或其前體的減少。在此使用的術(shù)語“減少至少一種tsna或其前體”或“至少一種tsna或其前體的減少”指的是，涉及可比較的產(chǎn)品、方法或應(yīng)用時(shí)，本發(fā)明的產(chǎn)品、方法或應(yīng)用中至少一種tsna或其前體的濃度和/或總含量較低。例如，可比較的煙草產(chǎn)品將會從根據(jù)本發(fā)明還未被修飾的、但其中所有其他相關(guān)特征相同的煙草植物得到(例如，植物物種、生長條件、煙草加工的方法，等等)?？梢允褂妙I(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法來檢測至少一種tsna或其前體的濃度和/或水平。特別是可以使用如實(shí)施例4中詳述在此的方法。例如，當(dāng)檢測煙草特有的亞硝胺前體的濃度和/或水平時(shí)，可以使用如在wo2009/022183中、在morot-gaudry-talarmainetal.2002.planta,215:708-715中或在muretalplantscience181(2011)509-519中詳述的一種方法(其通過引用結(jié)合于此)。合適地，通過實(shí)施本發(fā)明的方法和/或應(yīng)用可以減少至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體的濃度和/或總含量。合適地，當(dāng)與未被修飾以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)的煙草植物中至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體的濃度和/或水平比較時(shí)，在本發(fā)明的煙草植物中(例如，通過本發(fā)明的方法和/或應(yīng)用可獲得的或獲得的)至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體的濃度和/或水平可以是減少的。當(dāng)與從未被修飾以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)的煙草植物中可獲得的或獲得的煙葉、收獲的葉、加工的煙葉、煙草產(chǎn)品或它們的組合比較時(shí)，在從本發(fā)明的煙草植物中可獲得的或獲得的煙葉、收獲的葉、加工的煙葉、煙草產(chǎn)品或它們的組合中，至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體的濃度和/或總含量可以是減少的。合適地，在加工的煙葉中，至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體的濃度和/或總含量可以是減少的。合適地，在煙草產(chǎn)品中，至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體的濃度和/或水平可以是減少的。在一個實(shí)施方式中，至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體可以減少至至少約1％、至少約3％、至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或至少約90％。在一些實(shí)施方式中，至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體可以減少(reducedby)約5％至約95％、約10％至約90％、約20％至約80％、約30％至約70％或約40％至60％。關(guān)于加工的(例如，烘烤的)煙葉，至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體可以減少約5000ng/g至約50ng/g、約4000ng/g至約100ng/g、約3000ng/g至約500ng/g或約2000ng/g至約1000ng/g。在一些實(shí)施方式中，至少一種煙草特有的亞硝胺或其前體可以減少至少約5000ng/g、至少約4000ng/g、至少約3000ng/g、至少約2000ng/g、至少約1000ng/g、至少約500ng/g、至少約100ng/g或至少約50ng/g。lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子lbd(側(cè)生器官邊界結(jié)構(gòu)域)基因，又稱為asymmetricleaves2(as2)樣(asl)，編碼植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族。lbd蛋白質(zhì)由特征的n端lob結(jié)構(gòu)域限定，已知其負(fù)責(zé)dna結(jié)合和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。lob結(jié)構(gòu)域包含dna結(jié)合所需的c基序，它包含cx2cx6cx3c基序中的四個完全保守的半胱氨酸(c)殘基，其中x為不保守的殘基。lob結(jié)構(gòu)域還包含蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用所需的保守的甘氨酸殘基和c端亮氨酸拉鏈樣序列(majerc.,hochholdingerf.definingtheboundaries:structureandfunctionoflobdomainproteins.trendsinplantscience(2011)16(1):47-52)。示出基礎(chǔ)基因(foundergene)lob被識別6-bpgcggcgdna共有基序并在酵母中激活轉(zhuǎn)錄(husbandsa.,belle.m.,shuaib.,smithh.m.s.,springerp.s.lateralorganboundariesdefinesanewfamilyofdna-bindingtranscriptionfactorsandcaninteractwithspecificbhlhproteins.nucleicacidsresearch(2007)35(19):6663-6671)。擬南芥lbd基因家族由43個成員組成，基于在lob結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸保守性將成員分為兩類。種類i由lob和lbd1至lbd36組成，種類ii由lbd37至lbd43組成。在擬南芥中，已知種類ii的三個lbd基因lbd37(asl39)、lbd38(asl40)和lbd39(asl41)被氮或硝酸鹽上調(diào)，并作為花青素合成的負(fù)調(diào)節(jié)物。lbd基因還抑制了許多其他已知的氮響應(yīng)性基因，包括no3-攝取和同化所需要的關(guān)鍵基因，導(dǎo)致改變的no3-的含量、硝酸還原酶的活性/活化作用和其他n相關(guān)的生長表型(rubin等，2009)。在此使用的術(shù)語“側(cè)生器官邊界結(jié)構(gòu)域(lbd)氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子””指的是含lob結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)并且其以可能會受到氮或硝酸鹽的可用性影響的方式作為轉(zhuǎn)錄因子。在一個實(shí)施方式中，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子多肽序列包含以下基序中的一個或多個：i)cx2cx6cx3c，其中x為任何氨基酸ii)mscngcrxlrkgcx(seqidno:7)iii)qxxatxfxakfxgr(seqidno:8)iv)fxsllxeaxg(seqidno:9)在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子為lbd37、lbd38或lbd39。術(shù)語“增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性”指的是當(dāng)與未被修飾以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)的植物相比時(shí)，在修飾的植物中，植物中l(wèi)bd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性作為整體增加。在一個實(shí)施方式中，當(dāng)與未被修飾的植物相比時(shí)，修飾的植物中l(wèi)bd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性的增加可能超過約5％。合適地，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子活性的增加可能超過約10％，合適地超過約15％。在一些實(shí)施方式中，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子活性的增加可能超過約20％，更合適地超過約30％。在一些實(shí)施方式中，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子活性的增加可能超過約40％，如約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或約100％。在一些實(shí)施方式中，可以使用基因編輯實(shí)現(xiàn)對植物的修飾以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性?？梢允褂萌魏晤I(lǐng)域內(nèi)已知的方法實(shí)現(xiàn)基因編輯。這里給出了一些非限制性實(shí)例，包括使用crispr-cas9系統(tǒng)。crispr/cas9基因組編輯工具商業(yè)上可獲得，如來自clontech的“guide-it”(avenuedupresidentkennedy78100saint-germain-en-laye,france)。另一種基因編輯的方法包括使用具有商業(yè)上可獲得的試劑盒的talen(轉(zhuǎn)錄活化子樣效應(yīng)器核酸酶)技術(shù)(例如，來自addgene,1kendallsq.ste.b7102,cambridge,ma02139,usa)。另外的方法包括使用鋅指核酸酶如可獲自sigma-aldrich的zincfingernucleasetechnology。另一種方法包括使用silvaetalcurrgenether.feb2011；11(1):11–27(其教導(dǎo)通過引用結(jié)合于此)中描述的大范圍核酸酶(或進(jìn)一步的方法)。又其他的方法是寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(odm)如可獲自keygene(agrobusinesspark90,6708pwwageningen,thenetherlands)的在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以是煙草植物內(nèi)源的。參考于此的“內(nèi)源的”基因不僅指所討論的基因在植物中以其天然形式發(fā)現(xiàn)(即不存在任何人為干預(yù))，也指該相同基因(或基本上同源的核酸/基因)隨后以分離的形式被(重新)引入植物中(轉(zhuǎn)基因)。例如，含有這種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物可能遇到轉(zhuǎn)基因表達(dá)的大量減少和/或內(nèi)源基因的表達(dá)大量減少。分離的基因可以從有機(jī)體中分離出來的或可以是合成品，例如，通過化學(xué)合成。在另一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以是煙草植物外源的。在一個實(shí)施方式中，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以可獲自由從下列屬的一種或多種中選擇的植物：擬南芥屬(arabidopsis)、蕓苔屬(brassica)、稻屬(oryza)、菜豆屬(phaseolus)、茄屬(solanum)、菠菜屬(spinacia)。合適地，擬南芥屬(arabidopsis)lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可能為擬南芥(arabidopsisthaliana)lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自歐洲油菜(brassicanapus)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自蕪菁(brassicarapa)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自辣椒(capsicumannuum)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自萵苣(lactucasativa)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自水稻(oryzasativa)，適合地是粳稻日本晴(oryzasativasubsp.japonica)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自菜豆(phaseolusvulgaris)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自番茄(solanumlycopersicum)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自馬鈴薯(solanumtuberosum)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以選自菠菜(spinaciaoleracea)。在一個實(shí)施方式中，在本發(fā)明中使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以來自茄科(familysolanaceae)，更優(yōu)選是cestoideae亞科，更優(yōu)選是煙草屬的(genusnicotiana)，最優(yōu)選是來自紅花煙草(nicotianatabacum)或黃花煙草(n.rustica)。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子來自煙草屬。lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以來自煙草屬的任何物種，包括黃花煙草(n.rustica)和紅花煙草(nicotianatabacum)(例如，lab21、lnky171、tl1406、basma、galpao、perique、beinhart1000-1和petico)。其他物種包括無莖煙草(n.acaulis)、漸尖葉煙草(n.acuminata)、漸尖葉煙草多花型變種(n.acuminatavar.multiflora)、非洲煙草(n.africana)、具翼煙草(n.alata)、n.amplexicaulis、阿倫特氏煙草(n.arentsii)、漸狹葉煙草(n.attenuata)、貝納末特氏煙草(n.benavidesii)、本塞姆氏煙草(n.benthamiana)、n.bigelovii、博內(nèi)里煙草(n.bonariensis)、洞生煙草(n.cavicola)、克利夫蘭氏煙草(n.clevelandii)、心葉煙草(n.cordifolia)、傘床煙草(n.corymbosa)、迪勃納氏煙草(n.debneyi)、高煙草(n.excelsior)、福爾吉特氏煙草(n.forgetiana)、香煙草(n.fragrans)、粉藍(lán)煙草(n.glauca)、粘煙草(n.glutinosa)、古特斯比氏煙草(n.goodspeedii)、哥西氏煙草(n.gossei)、n.hybrid、因古兒巴煙草(n.ingulba)、卡瓦卡米氏煙草(n.kawakamii)、奈特氏煙草(n.knightiana)、藍(lán)格斯多夫煙草(n.langsdorffii)、狹葉煙草(n.linearis)、長花煙草(n.longiflora)、海濱煙草(n.maritima)、特大管煙草(n.megalosiphon)、摩西氏煙草(n.miersii)、夜花煙草(n.noctiflora)、裸莖煙草(n.nudicaulis)、歐布特斯煙草(n.obtusifolia)、西方煙草(n.occidentalis)、西方煙草hesperis亞種(n.occidentalissubsp.hesperis)、耳狀煙草(n.otophora)、圓錐煙草(n.paniculata)、少花煙草(n.pauciflora)、漸尖葉煙草(n.petunioides)、藍(lán)茉莉葉煙草(n.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏煙草(n.quadrivalvis)、雷蒙德氏煙草(n.raimondii)、殘波煙草(n.repanda)、蓮座葉煙草(n.rosulata)、蓮座葉煙草因古兒巴亞種(n.rosulatasubsp.ingulba)、圓葉煙草(n.rotundifolia)、賽特氏煙草(n.setchellii)、擬似煙草(n.simulans)、茄葉煙草(n.solanifolia)、斯佩格茨煙草(n.spegazzinii)、斯托克通氏煙草(n.stocktonii)、香甜煙草(n.suaveolens)、林煙草(n.sylvestris)、藍(lán)煙草(n.thyrsiflora)、絨毛煙草(n.tomentosa)、絨毛狀煙草(n.tomentosiformis)、三角葉煙草(n.trigonophylla)、蔭生煙草(n.umbratica)、波葉煙草(n.undulata)、顫毛煙草(n.velutina)、芹葉煙草(n.wigandioides)和n.xsanderae。在一個實(shí)施方式中，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子來自lbd基因家族的種類ii。合適地，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子為lbd37、lbd38或lbd39。在一個特定的實(shí)施方式中，lbd37、lbd38或lbd39來源于擬南芥(arabidopsisthaliana)。在另一個實(shí)施方式中，lbd37、lbd38或lbd39來自另一個物種，合適地是圖7列出蛋白質(zhì)中的一種(即sllbd37、oblbd37、brlbd37、sllbd38、brlbd38或brlbd39)。在另一個實(shí)施方式中，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子多肽序列包含下列基序的一種或多種；i)cx2cx6cx3c，其中x為任何氨基酸ii)mscngcrxlrkgcx(seqidno:7)iii)qxxatxfxakfxgr(seqidno:8)iv)fxsllxeaxg(seqidno:9)在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以由包含以下的多核苷酸序列編碼，多核苷酸序列：i)在此示出為seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的多核苷酸序列；ii)在i)中示出的多核苷酸序列的功能性片段，其中，功能性片段編碼功能性lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，或iii)編碼包含在此示出為seqidno:2、seqidno:4或seqidno:6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；或iv)可以在高嚴(yán)格條件下與上述i)、ii)或iii)中教導(dǎo)的多核苷酸雜交的多核苷酸序列或v)與上述i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸序列具有至少70％(優(yōu)選85％、更優(yōu)選90％)同一性的多核苷酸序列，或vi)由于遺傳密碼的簡并性而與i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸不同的多核苷酸序列。在此使用的術(shù)語“功能性片段”指的是多核苷酸的一部分，其能夠編碼保持其活性的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子。在一個實(shí)施方式中，功能性片段可以是本發(fā)明的多核苷酸的一部分，其包含本發(fā)明的多核苷酸的至少50個核苷酸、至少75個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸或至少500個核苷酸。在此使用的術(shù)語“遺傳密碼的簡并性”指的是編碼多肽序列的密碼子的冗余，表現(xiàn)為指定氨基酸的三密碼子組合的多樣性。例如，在編碼具有異亮氨酸氨基酸的多肽的mrna分子中，異亮氨酸可以由auu、auc或aua編碼。這意味著編碼rna的dna分子可以具有多種序列，但產(chǎn)生的多肽會具有相同的序列。換句話說，多形態(tài)的核苷酸序列可以編碼相同的多肽產(chǎn)物。這意味著一個核酸序列可以包含與第二個序列具有非常低序列同一性的序列但卻編碼相同的多肽序列。在一個實(shí)施方式中，多核苷酸序列可以與seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5具有至少80％同一性。合適地，多核苷酸序列可以與seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5具有至少90％同一性。合適地，多核苷酸序列可以與seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5具有至少95％同一性(更優(yōu)選至少99％同一性)。更合適地，多核苷酸序列可以與seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5具有至少99％同一性。在另一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子可以包含在此示出為seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6的多肽序列，或包含具有在至少一個氨基酸處的保守替換的seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6的多肽序列，或與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6具有至少70％同一性的多肽。合適地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6具有至少80％同一性。更合適地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6至少90％同一性。優(yōu)選地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6至少95％同一性。更優(yōu)選地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6至少99％同一性。增加表達(dá)本發(fā)明的方法和應(yīng)用包含至少一種lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的增加?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式實(shí)現(xiàn)表達(dá)的增加。在此使用的術(shù)語“增加的表達(dá)”或“過表達(dá)”指的是附加原始野生型表達(dá)水平的任何表達(dá)形式?！霸黾拥谋磉_(dá)”指的是與相同品種的親本植物的表達(dá)水平相比，植物的mrna水平或蛋白質(zhì)水平增加。將表達(dá)水平與在相同條件下種植的相同品種的親本植物中的相應(yīng)部分進(jìn)行比較。其中表達(dá)水平比親本植物的表達(dá)水平增加至少1.1倍的情況被優(yōu)選地認(rèn)為是表達(dá)水平增加的情況。在這里，更優(yōu)選的是，為了認(rèn)為表達(dá)水平存在增加，通過與親本植物的表達(dá)水平相比的t-測試，植物的表達(dá)水平具有5％的顯著差異。優(yōu)選的是在相同時(shí)間以相同方法測量植物和親本植物的表達(dá)水平。然而，也可以使用作為背景數(shù)據(jù)存儲的數(shù)據(jù)。增加基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法在領(lǐng)域內(nèi)有很好的記錄并且包括，例如，由合適的啟動子驅(qū)動的過表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的應(yīng)用。可以將充當(dāng)啟動子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸引入至非異源形式的多核苷酸的合適位置(典型地是上游)以正調(diào)節(jié)編碼目的多肽的核酸的表達(dá)。例如，可以通過突變、刪除和/或替換(參見us5,565,350；wo9322443)體內(nèi)改變內(nèi)源性啟動子或可以以恰當(dāng)?shù)娜∠蚝途啾景l(fā)明的基因一定的距離將分離的啟動子引入植物細(xì)胞內(nèi)以控制基因的表達(dá)。如果多肽表達(dá)是期望的，通常期望在多核苷酸編碼區(qū)域的3’-端包含聚腺苷酸化區(qū)域。聚腺苷酸化區(qū)域可以來源于天然基因，來自多種其他植物基因或來自t-dna。待添加的31端序列可以來源于，例如，胭脂堿合成酶或章魚堿合成酶基因或可替換地來源于另一種植物基因或較少優(yōu)選地來自任何其他真核基因。也可以將內(nèi)含子序列加入到5’非翻譯區(qū)(utr)或的局部編碼序列的編碼序列以增加在細(xì)胞溶質(zhì)中積累的成熟信使的量。已經(jīng)示出在植物和動物表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單元中包含可剪接內(nèi)含子在mrna和蛋白質(zhì)水平兩方面增加基因表達(dá)高達(dá)1000倍(buchmanandberg(1988)moi.cellbiol.8:4395-4405；callisetal.(1987)genesdev1:1183-1200)。當(dāng)放置在轉(zhuǎn)錄單元的5’端附近時(shí)，基因表達(dá)的這種內(nèi)含子增強(qiáng)通常是最大的。玉米內(nèi)含子adh1-s內(nèi)含子1、2和6、bronze-1內(nèi)含子的應(yīng)用在領(lǐng)域內(nèi)是已知的。一般信息參見：themaizehandbook,chapter116,freelingandwalbot,eds.,springer,n.y.(1994)。在一個實(shí)施方式中，通過使用基因編輯或靶向誘變實(shí)現(xiàn)增加的表達(dá)可以。可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法實(shí)現(xiàn)基因編輯。這里提出的一些非限制性實(shí)例包括使用crispr-cas9系統(tǒng)。crispr/cas9基因組編輯工具是商業(yè)上可獲得的，如來自clontech的“guide-it”(avenuedupresidentkennedy78100saint-germain-en-laye,france)。另一種基因編輯的方法包括使用具有商業(yè)上可獲得的試劑盒(例如，來自addgene,1kendallsq.ste.b7102,cambridge,ma02139,usa)的talen(轉(zhuǎn)錄活化子樣效應(yīng)器核酸酶)技術(shù)。另外的方法包括使用鋅指核酸酶，如可獲自sigma-aldrich的zincfingernucleasetechnology。另一種方法包括使用在silvaetalcurrgenether.feb2011；11(1):11–27(其教學(xué)通過引用結(jié)合于此)中描述的大范圍核酸酶(或另外的方法)。又另外的方法是寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(odm)如可獲自keygene(agrobusinesspark90,6708pwwageningen,thenetherlands)的合適地，可以使用基因編輯以體內(nèi)改變lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子啟動子的序列。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，可以通過在植物內(nèi)的表達(dá)多核苷酸(例如，外源性多核苷酸)實(shí)現(xiàn)lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的增加的表達(dá)，該多核苷酸包含編碼lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列。在一個實(shí)施方式中，所述多核苷酸(例如，外源性多核苷酸)包含與在所述植物中指導(dǎo)所述核酸序列轉(zhuǎn)錄的異源性啟動子可操作地連接的編碼lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，啟動子可以選自由以下各項(xiàng)組成的組：組成型啟動子、衰老特異性啟動子、組織特異性啟動子、發(fā)育調(diào)控的啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。在一個實(shí)施方式中，啟動子可以是組成型啟動子。組成型啟動子在植物發(fā)育期間持續(xù)地指導(dǎo)遍及植物不同部分的基因的表達(dá)，盡管這種基因不能在所有細(xì)胞類型中以相同的水平表達(dá)。已知組成型啟動子的實(shí)例包括：與花椰菜花葉病毒35s轉(zhuǎn)錄本(odelljt,nagyf,chuanh.(1985).identificationofdnasequencesrequiredforactivityofthecauliflowermosaicvirus35spromoter.nature.313810-2)、水稻肌動蛋白1基因(zhangw,mcelroyd,wur.(1991).analysisofriceact15'regionactivityintransgenicriceplants.plantcell31155-65)和玉米泛素1基因(cornejomj,luthd,blankenshipkm,andersonod,blechlae.(1993).activityofamaizeubiquitinpromoterintransgenicrice.plantmolec.biol.23567-81)有關(guān)的那些。組成型啟動子如香石竹蝕環(huán)病毒(cerv)啟動子(hullr,sadlerj,longstaffm(1986)thesequenceofcarnationetchedringvirusdna:comparisonwithcauliflowermosaicvirusandretroviruses.embojournal,5(2):3083-3090)。組成型啟動子可以選自：香石竹蝕環(huán)病毒(cerv)啟動子、花椰菜花葉病毒(camv35s啟動子)、來自水稻肌動蛋白1基因或玉米泛素1基因的啟動子。合適地，啟動子可以是cerv啟動子。在一個實(shí)施方式中，啟動子可以是衰老特異性啟動子?！八ダ咸禺愋詥幼印?sag)可以是與控制衰老相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)的啟動子。因此，啟動子可以將可操作地連接于其的編碼序列(即基因)的表達(dá)基本上排他地限制在開始衰老的組織中。因此，衰老特異性啟動子可以是能夠以發(fā)育調(diào)控方式在植物組織中偏好地促進(jìn)基因表達(dá)的啟動子，使得3’蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的表達(dá)基本上僅在植物組織經(jīng)受衰老時(shí)發(fā)生。令人高興的是衰老趨向于發(fā)生在植物的較老部分，如較老的葉子，而不是發(fā)生在植物的較年輕部分，如種子。已知表達(dá)很多衰老相關(guān)基因的植物的一個實(shí)例是擬南芥。因此，可以從擬南芥的衰老相關(guān)基因中分離衰老特異性啟動子。gepsteinetal.(theplantjournal,2003,36,629-642)使用擬南芥作為模型進(jìn)行了sag和其啟動子的詳細(xì)研究。遺傳構(gòu)建體可以包含來自該文獻(xiàn)中公開的任何sag的啟動子。例如，合適的啟動子可以選自由以下各項(xiàng)組成的組：sag12、sag13、sag101、sag21和sag18或它們的功能性變體或功能性片段。在一個實(shí)施方式中，啟動子可以是sag12啟動子，其是熟練技師已知的或是其功能性變體或功能性片段(gan&amasino,1997,plantphysiology,113:313-319)。合適的啟動子和它們的序列可見于wo2010/097623，其通過引用結(jié)合于此。在另一個實(shí)施方式中，啟動子可以是組織特異性啟動子。組織特異性啟動子是在植物的一個(或幾個)部分中、通常貫穿那些植物部分的生命周期指導(dǎo)基因的表達(dá)的啟動子。組織特異性啟動子的分類通常還包括其特異性不絕對的啟動子，即，它們也可以在除優(yōu)選的組織以外的組織中以較低的水平指導(dǎo)表達(dá)。一些組織特異性啟動子在領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且包括與在馬鈴薯塊莖中表達(dá)的馬鈴薯糖蛋白基因和在小麥、大麥或玉米胚乳中表達(dá)的高分子量麥谷蛋白基因有關(guān)的那些。合適地，組織特異性啟動子可以是葉片特異性啟動子。合適的葉片特異性啟動子可以包括asymmetricleaves1(as1)。在另一個實(shí)施方式中，啟動子可以是發(fā)育調(diào)控啟動子。發(fā)育調(diào)控啟動子在植物發(fā)育期間的特定時(shí)間、在植物的一個或多個部分中指導(dǎo)基因表達(dá)的變化。該基因可以在其他時(shí)間、在那個植物部分中以不同的(通常較低的)水平表達(dá)，并且也可以在其他植物部分中表達(dá)。在一個實(shí)施方式中，啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子能夠響應(yīng)誘導(dǎo)物而指導(dǎo)基因的表達(dá)。在不存在誘導(dǎo)物的情況下，基因不會被表達(dá)。誘導(dǎo)物可以直接作用于啟動子序列上或可以通過阻礙抑制物分子的效果起作用。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)試劑如代謝物、蛋白質(zhì)、生長調(diào)節(jié)劑或有毒元件，生理應(yīng)激如熱、傷害或滲透壓或是病原體或害蟲活動的間接結(jié)果。發(fā)育調(diào)控啟動子可以被描述為特殊類型的誘導(dǎo)型啟動子，其響應(yīng)于由植物產(chǎn)生的內(nèi)源性誘導(dǎo)物或響應(yīng)于在植物的生命周期中特定點(diǎn)的環(huán)境刺激。已知的誘導(dǎo)型啟動子的實(shí)例包括與以下各項(xiàng)有關(guān)的那些：傷害響應(yīng)，如由warnersa,scottr,draperj.(1993)所描述的(isolationofanasparagusintracellularprgene(aopr1)wound-responsivepromoterbytheinversepolymerasechainreactionanditscharacterizationintransgenictobacco.plantj.3191-201.)，溫度響應(yīng)，如由benfey&chua(1989)所公開的(benfey,p.n.,andchua,n-h.(1989)regulatedgenesintransgenicplants.science244174-181)，和化學(xué)誘導(dǎo)，如由gatz(1995)所描述的(gatz,c.(1995)novelinducible/repressiblegeneexpressionsystems.methodsincellbiol.50411-424)。因此，在一個實(shí)施方式中，啟動子可以選自由以下各項(xiàng)組成的組：cerv啟動子、花椰菜花葉病毒35s啟動子(全長或截短的)、二磷酸核酮糖羧化酶啟動子、豌豆質(zhì)體藍(lán)素啟動子、胭脂堿合成酶啟動子、葉綠素r/b結(jié)合啟動子、高分子量麥谷蛋白啟動子、α,β-醇溶蛋白啟動子、大麥醇溶蛋白啟動子和馬鈴薯糖蛋白啟動子。發(fā)明進(jìn)一步提供了包含與葉片特異性啟動子可操作地連接的編碼lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的核酸的構(gòu)建體或載體。發(fā)明還提供了包含與衰老特異性啟動子可操作地連接的編碼lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的核酸的構(gòu)建體或載體。構(gòu)建體可以包含在載體中。合適地，載體可以是質(zhì)粒。煙草植物本發(fā)明提供了針對煙草植物以及煙草細(xì)胞、煙草植物和煙草繁殖材料的方法、應(yīng)用。在此使用的術(shù)語“煙草植物”指的是用于生產(chǎn)煙草產(chǎn)品的煙草屬(genusnicotiana)植物。適合的煙草植物的非限制性實(shí)例包括紅花煙草(n.tabacum)和黃花煙草(n.rustica)(例如，lab21、lnky171、tl1406、basma、galpao、perique、beinhart1000-1和petico)。這并不意在將術(shù)語“煙草”延伸至對生產(chǎn)煙草產(chǎn)品無用的煙草屬物種。因此，在一個實(shí)施方式中，煙草植物確實(shí)包括藍(lán)茉莉葉煙草(n.plumbaginifolia)。煙草材料可獲自多種紅花煙草(nicotianatabacum)物種的變種，通常被稱為白肋(burley)變種、熏制(flue)或鮮亮變種、深色變種和東方/土耳其變種。在一些實(shí)施方式中，煙草材料來源于白肋、弗尼吉亞(virginia)、熱風(fēng)管處理的、風(fēng)干的、烤干的、東方的或深色的煙草植物。煙草植物可以選自馬里蘭煙草、稀有煙草、特產(chǎn)(speciality)煙草、膨脹煙草等。在此還考慮了對煙草栽培品系和精英煙草栽培品系(elitetobaccocultivar)的應(yīng)用。因此，在此使用的煙草植物可以是煙草變種或精英煙草栽培品系。特別有用的紅花煙草(nicotianatabacum)變種包括白肋類型、深色類型、熏制類型和東方類型的煙草。在一些實(shí)施方式中，煙草植物可以例如，選自以下變種中的一種或多種：紅花煙草aa37-1、紅花煙草b13p、紅花煙草克桑西(mitchell-mor)、紅花煙草ktd#3雜交種107、紅花煙草bel-w3、紅花煙草79-615、紅花煙草samsunholmesnn、來自雜交紅花煙草bu21×紅花煙草hojaparado的f4，株系97、紅花煙草ktrdc#2雜交種49、紅花煙草ktrdc#4雜交種110、紅花煙草白肋21、紅花煙草pm016、紅花煙草ktrdc#5ky160si、紅花煙草ktrdc#7fca、紅花煙草ktrdc#6tn86si、紅花煙草pm021、紅花煙草k149、紅花煙草k326、紅花煙草k346、紅花煙草k358、紅花煙草k394、紅花煙草k399、紅花煙草k730、紅花煙草ky10、紅花煙草ky14、紅花煙草ky160、紅花煙草ky17、紅花煙草ky8959、紅花煙草ky9、紅花煙草ky907、紅花煙草md609、紅花煙草mcnair373、紅花煙草nc2000、紅花煙草pg01、紅花煙草pg04、紅花煙草p01、紅花煙草p02、紅花煙草p03、紅花煙草rg11、紅花煙草rg17、紅花煙草rg8、紅花煙草speightg-28、紅花煙草tn86、紅花煙草tn90、紅花煙草va509、紅花煙草as44、紅花煙草banketa1、紅花煙草basmadramab84/31、紅花煙草basmaizichnazp4/b,紅花煙草basmaxanthibx2a,紅花煙草batek,紅花煙草besukijember、紅花煙草c104、紅花煙草coker319、紅花煙草coker347、紅花煙草criollomisionero、紅花煙草pm092、紅花煙草delcrest、紅花煙草djebel81、紅花煙草dvh405、紅花煙草galpaocomum、紅花煙草hb04p、紅花煙草hicksbroadleaf、紅花煙草kabakulakelassona、紅花煙草pm102、紅花煙草kutsagee1、紅花煙草ky14xl8、紅花煙草ky171、紅花煙草labu21、紅花煙草mcnair944、紅花煙草nc2326、紅花煙草nc71、紅花煙草nc297、紅花煙草nc3、紅花煙草pvh03、紅花煙草pvh09、紅花煙草pvh19、紅花煙草pvh2110、紅花煙草redrussian、紅花煙草samsun、紅花煙草saplak、紅花煙草simmaba、紅花煙草talgar28、紅花煙草pm132、紅花煙草wislica、紅花煙草yayaldag、紅花煙草nc4、紅花煙草trmadole、紅花煙草prilephc-72、紅花煙草prilepp23、紅花煙草prileppb156/1、紅花煙草prilepp12-2/1、紅花煙草yakajk-48、紅花煙草yakajb125/3、紅花煙草τi-1068、紅花煙草kdh-960、紅花煙草ti-1070、紅花煙草tw136、紅花煙草pm204、紅花煙草pm205、紅花煙草basma、紅花煙草tkf4028、紅花煙草l8、紅花煙草tkf2002、紅花煙草tn90、紅花煙草gr141、紅花煙草basmaxanthi、紅花煙草gr149、紅花煙草gr153和紅花煙草petithavana。變種或栽培品系的非限制性實(shí)例為：bd64、cc101、cc200、cc27、cc301、cc400、cc500、cc600、cc700、cc800、cc900、coker176、coker319、coker371gold、coker48、cd263、df911、dt538lcgalpaotobacco、gl26h、gl350、gl600、gl737、gl939、gl973、hb04p、hb04plc、hb3307plc、hybrid403lc、hybrid404lc、hybrid501lc、k149、k326、k346、k358、k394、k399、k730、kdh959、kt200、kt204lc、ky10、ky14、ky160、ky17、ky171、ky907、ky907lc、kty14xl8lc、littlecrittenden、mcnair373、mcnair944、msky14xl8、narrowleafmadole、narrowleafmadolelc、nbh98、n-126、n-777lc、n-7371lc、nc100、nc102、nc2000、nc291、nc297、nc299、nc3、nc4、nc5、nc6、nc7、nc606、nc71、nc72、nc810、ncbh129、nc2002、nealsmithmadole、oxford207、pd7302lc、pd7309lc、pd7312lc'periq'e'tobacco、pvh03、pvh09、pvh19、pvh50、pvh51、r610、r630、r7-11、r7-12、rg17、rg81、rgh51、rgh4、rgh51、rs1410、speight168、speight172、speight179、speight210、speight220、speight225、speight227、speight234、speightg-28、speightg-70、speighth-6、speighth20、speightnf3、tl1406、tl1269、tn86、tn86lc、tn90、tn97、tn97lc、tnd94、tnd950、tr(tomrosson)madole、va309、va359、aa37-1、b13p、xanthi(mitchell-mor)、bel-w3、79-615、samsunholmesnn、ktrdcnumber2hybrid49、burley21、ky8959、ky9、md609、pg01、pg04、p01、p02、p03、rg11、rg8、va509、as44、banketa1、basmadramab84/31、basmaizichnazp4/b、basmaxanthibx2a、batek、besukijember、c104、coker347、criollomisionero、delcrest、djebel81、dvh405、galpaocomum、hb04p、hicksbroadleaf、kabakulakelassona、kutsagee1、labu21、nc2326、nc297、pvh2110、redrussian、samsun、saplak、simmaba、talgar28、wislica、yayaldag、prilephc-72、prilepp23、prileppb156/1、prilepp12-2/1、yakajk-48、yakajb125/3、ti-1068、kdh-960、tl-1070、tw136、basma、tkf4028、l8、tkf2002、gr141、basmaxanthi、gr149、gr153、petithavana。即使在此沒有明確地指出，也考慮低交換子(lowconverter)亞變種。在一個實(shí)施方式中，煙草植物為白肋類型煙草植物，適合的是白肋ph2517。在一個實(shí)施方式中，植物繁殖材料可以獲自本發(fā)明的煙草植物。在此使用的“植物繁殖材料”指的是取自植物的任何植物物質(zhì)，從該物質(zhì)可以生產(chǎn)其他植物。合適地，植物繁殖材料可以是種子。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的煙草細(xì)胞、煙草植物和/或植物繁殖材料可以包含外源性lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子。在另一個實(shí)施方式中，煙草細(xì)胞、煙草植物和/或植物繁殖材料可以包含根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體或載體。在另一個實(shí)施方式中，煙草細(xì)胞、煙草植物和/或植物繁殖材料是通過根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的(例如，獲得的)。合適地，當(dāng)與未修飾的煙草植物相比時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的煙草植物可以包含減少量的至少一種煙草特有的亞硝胺，其中修飾是指在所述經(jīng)修飾的植物中l(wèi)bd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)增加。在一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明煙草植物包含本發(fā)明的煙草細(xì)胞。在另一個實(shí)施方式中，植物繁殖材料是從本發(fā)明的煙草植物中可獲得(例如，獲得的)。在另一個實(shí)施方式中，煙草細(xì)胞、煙草植物和/或植物繁殖材料可以包括：i)在此示出為seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5的多核苷酸序列或ii)i)中示出的多核苷酸序列的片段，其功能性片段編碼硝酸還原酶，硝酸還原酶通過一種或多種翻譯后調(diào)控機(jī)制從調(diào)控中解耦合(decouple)，煙草中的硝酸還原酶通常經(jīng)受所述機(jī)制或iii)編碼包含在此示出為seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或iv)可以在高嚴(yán)格條件下與上述i)、ii)或iii)中教導(dǎo)的多核苷酸雜交的多核苷酸序列或v)與上述i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸具有至少70％(優(yōu)選85％，更優(yōu)選90％)同一性的多核苷酸序列或vi)由于遺傳密碼的簡并性而與i)、ii)或iii)中示出的多核苷酸不同的多核苷酸序列。在一個實(shí)施方式中，多核苷酸序列可以與seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5具有至少80％同一性。合適地，多核苷酸序列可以與seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5具有至少90％同一性。合適地，多核苷酸序列可以與seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5具有至少95％同一性(更合適地至少99％同一性)。在另一個實(shí)施方式中，煙草細(xì)胞、煙草植物和/或植物繁殖材料可以包含lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，其包含在此示出為seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6的多肽序列或包含具有在至少一個氨基酸處的保守替換的seqidno.2,seqidno.4或seqidno.6的多肽序列或與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6具有至少70％同一性的多肽。合適地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6具有至少80％同一性。更合適地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6具有至少90％同一性。特別地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6具有至少95％同一性。最合適地，多肽可以與seqidno.2、seqidno.4或seqidno.6具有至少99％同一性。在一個實(shí)施方式中，提供了如在前述用于生產(chǎn)煙草產(chǎn)品的實(shí)施方式中，所提供的煙草細(xì)胞的應(yīng)用。此外，提供了在此描述的煙草植物培育煙草細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明還在另一個實(shí)施方式中，提供前述實(shí)施方式中，的煙草植物用于生產(chǎn)煙草產(chǎn)品的應(yīng)用。在另一個實(shí)施方式中，提供了本發(fā)明的煙草植物種植作物的應(yīng)用。氨基酸在一個實(shí)施方式中，與未修飾的植物相比時(shí)，根據(jù)本發(fā)明修飾植物以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)可以獲得植物中氨基酸的濃度改變。在一個實(shí)施方式中，修飾植物以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)可以獲得選自由以下各項(xiàng)組成的組的一種或多種氨基酸的濃度改變：組氨酸、天冬氨酸鹽、天冬酰胺、谷氨酸鹽、谷氨酰胺、蘇氨酸和脯氨酸。合適地，修飾植物以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)可以獲得選自由以下各項(xiàng)組成的組的一種或多種氨基酸的濃度減少：組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和蘇氨酸。合適地，修飾植物以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)可以獲得選自由以下各項(xiàng)組成的組的一種或多種氨基酸的濃度增加：天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽和脯氨酸。產(chǎn)品本發(fā)明同樣提供了由根據(jù)本發(fā)明的煙草可獲得的或獲得的產(chǎn)物。在一個實(shí)施方式中，提供了本發(fā)明的煙草植物生產(chǎn)煙葉的應(yīng)用。合適地，煙葉可以經(jīng)受下游應(yīng)用如加工。因此，在一個實(shí)施方式中，前述的實(shí)施方式的應(yīng)用可以提供加工的煙葉。合適地，煙葉可以經(jīng)受烘烤、發(fā)酵、巴氏殺菌或它們的組合。在另一個實(shí)施方式中，煙葉可以被切割。在一些實(shí)施方式中，煙葉可以在經(jīng)受烘烤、發(fā)酵、巴氏殺菌或它們的組合之前或之后被切割。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的煙草植物的收獲的葉。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，收獲的葉可以是從由本發(fā)明的繁殖材料繁殖的煙草植物中可獲得的(例如，獲得的)。在另一個實(shí)施方式中，提供了從本發(fā)明的方法或應(yīng)用中可獲得的收獲的葉。合適地，收獲的葉可以是切割的收獲的葉。在一些實(shí)施方式中，收獲的葉可以包含活的煙草細(xì)胞。在其他的實(shí)施方式中，收獲的葉可以經(jīng)受進(jìn)一步的加工。同樣提供了加工的煙葉。加工的煙葉可以是從本發(fā)明的煙草植物可獲得的。合適地，加工的煙葉可以是從以根據(jù)本發(fā)明的任何方法和/或應(yīng)用中獲得的煙草植物中可獲得的。在另一個實(shí)施方式中，加工的煙葉可以是從由根據(jù)本發(fā)明的煙草植物繁殖材料繁殖而來的煙草植物中可獲得的。本發(fā)明的加工的煙葉可以是通過加工本發(fā)明的收獲的葉可獲得的。在此使用的術(shù)語“加工的煙葉”指的是已經(jīng)經(jīng)受一個或多個煙草在領(lǐng)域內(nèi)經(jīng)受的加工步驟的煙葉。“加工的煙葉”不包含或基本上不包含活的細(xì)胞。術(shù)語“活的細(xì)胞”指的是能夠生長和/或新陳代謝活躍的細(xì)胞。因此，如果細(xì)胞被認(rèn)為不是活的，也被稱為“非活的”，那么細(xì)胞就沒有展示活細(xì)胞的特征。術(shù)語“基本沒有活細(xì)胞”指的是全部細(xì)胞的少于約5％是活的。優(yōu)選少于約3％，更優(yōu)選少于約1％，甚至更優(yōu)選少于約0.1％的全部細(xì)胞是活的。在一個實(shí)施方式中，加工的煙葉可以通過以下中的一種或多種來加工：烘烤、發(fā)酵和/或巴氏殺菌。合適地，加工的煙葉可以通過烘烤來加工?？梢酝ㄟ^領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法烘烤煙葉。在一個實(shí)施方式中，可以通過從包含風(fēng)干、烤干、熏干和曬干的團(tuán)體中選擇的烘烤方法中的一種或多種烘烤煙葉。合適地，煙葉可以是風(fēng)干的。典型地，通過將煙葉懸掛在通風(fēng)良好的倉房中并使其干燥來實(shí)現(xiàn)風(fēng)干。通常在四至八周的時(shí)間內(nèi)完成。風(fēng)干特別適合白肋煙草。合適地，煙葉可以是烤干的。典型地，通過將煙葉懸掛在大倉房中、在其中連續(xù)或間歇式低悶燒地保持硬木的火焰實(shí)現(xiàn)烤干，并且取決于加工和煙草，通常需要三天至十周。在另一個實(shí)施方式中，煙葉可以是熏干的。熏干可以包括將煙葉捆在煙葉梗上并將它們掛在熏制倉房的層柱(tier-pole)上。倉房通常具有自外部進(jìn)料火箱運(yùn)行的煙道。典型地，這使得煙草被熏干而沒有暴露在煙霧中。通常整個烘烤進(jìn)程中溫度會慢慢升高，整個過程需要大約一周。合適地，煙葉可以是曬干的。這種方法典型地包括將無遮蓋的煙草暴露于陽光下。合適地，加工的煙葉可以是通過發(fā)酵來加工的。可以以領(lǐng)域中已知的任何方式進(jìn)行發(fā)酵。典型地，在發(fā)酵期間，煙葉被堆成經(jīng)烘烤的煙葉的堆(大塊)，其被覆蓋在如粗麻布中以保持水分。葉片里面剩余的水分和煙草的重量結(jié)合產(chǎn)生使煙草成熟的天然熱量。每天監(jiān)測大塊中心的溫度。在一些方法中，每周將整個大塊打開。隨后移動葉片使其搖動和濕潤，翻轉(zhuǎn)大塊以便里面的葉片到外面來并將底部的葉片置于大塊的頂部。這保證了整個大塊中均勻的發(fā)酵。葉片上另外的水分，加上葉片自身的實(shí)際旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生熱量，釋放出煙草的天然氨并減少了尼古丁，同時(shí)還加深顏色并改善煙草的香氣。典型地，取決于煙草的品種、柄在葉片上的位置、葉片的厚度和預(yù)期用途，發(fā)酵過程持續(xù)最高達(dá)6個月。合適地，加工的煙葉可以是通過巴氏殺菌來加工的。當(dāng)煙葉會被用于制作無煙煙草產(chǎn)品、最優(yōu)選是鼻煙時(shí)，巴氏殺菌可以使特別優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法進(jìn)行煙葉巴氏滅菌法。例如，可以按jfoulds,lramstrom,mburke,kfagerstrom.effectofsmokelesstobacco(snus)onsmokingandpublichealthinsweden.tobaccocontrol(2003)12:349–359中所描述的細(xì)節(jié)進(jìn)行巴氏滅菌法，其教導(dǎo)通過引用結(jié)合于此。在鼻煙的生產(chǎn)期間，典型地通過用蒸汽熱處理煙草24-36小時(shí)(達(dá)到約100℃的溫度)的方法進(jìn)行巴氏滅菌法。這產(chǎn)生幾乎無菌的產(chǎn)品，并且不希望被理論束縛，結(jié)果中的一個被認(rèn)為是對另外的tsna形成的限制。在一個實(shí)施方式中，巴氏滅菌法可以是蒸汽巴氏滅菌法。在一些實(shí)施方式中，加工的煙葉可以被切割。加工的煙葉可以在加工之前或之后被切割。合適地，加工的煙葉可以在加工之后被切割。在一些實(shí)施方式中，煙草植物、煙草植物的收獲的葉和/或加工的煙葉可以用于提取尼古丁。可以通過使用領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法實(shí)現(xiàn)尼古丁的提取。例如，us2,162,738中教導(dǎo)了由煙草提取尼古丁的方法，其通過引用結(jié)合于此。本發(fā)明的另一個方面提供了煙草產(chǎn)品。在一個實(shí)施方式中，煙草產(chǎn)品可以是從本發(fā)明的煙草植物或其部分中制得。合適地，煙草植物或其部分可以從根據(jù)本發(fā)明的煙草植物繁殖材料繁殖而來。在煙草植物的背景下，在此使用的術(shù)語“其部分”指的是煙草植物的一個部分。優(yōu)選地，“其部分”為煙草植物的葉片。在另一個實(shí)施方式中，煙草產(chǎn)品可以制備自本發(fā)明的收獲的葉。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，煙草產(chǎn)品可以制備自本發(fā)明的加工的煙葉。合適地，煙草產(chǎn)品可以由烘烤、發(fā)酵和/或巴氏殺菌中的一種或多種的加工的煙葉制得。合適地，煙草產(chǎn)品可以包括切割的煙葉，典型地按照前述實(shí)施方式可選地進(jìn)行加工。在一個實(shí)施方式中，煙草產(chǎn)品可以是吸煙物品(smokingarticle)。在此使用的術(shù)語“吸煙物品”可以包括可吸煙產(chǎn)物，如卷煙、香煙、雪茄煙和小雪茄煙，無論其基于煙草、煙草衍生品、膨脹煙草、復(fù)原煙草還是基于煙草替代品。在另一個實(shí)施方式中，煙草產(chǎn)品可以是無煙煙草產(chǎn)品。在此使用的術(shù)語“無煙煙草產(chǎn)品”指的是不意在被吸煙和/或經(jīng)受燃燒的煙草產(chǎn)品。在一個實(shí)施方式中，無煙煙草產(chǎn)品可以包鼻煙(snus)、鼻煙(snuff)、咀嚼煙草或類似物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，煙草產(chǎn)品可以是煙草加熱裝置。典型地在加熱的生煙制品(smokingarticle)中，通過熱量從熱源至物理上分隔開的氣溶膠生成基底或材料的傳遞產(chǎn)生氣溶膠，其可以位于熱源的內(nèi)部、周圍或下游。在吸煙期間，揮發(fā)性化合物由從熱源傳遞的熱量而從氣溶膠生成基底中釋放出來并夾帶在通過(drawnthrough)生煙制品的空氣中。隨著釋放的化合物冷卻，它們凝結(jié)以形成被使用者吸入的氣溶膠。用于消費(fèi)和吸用煙草加熱裝置的產(chǎn)生氣溶膠的制品和裝置領(lǐng)域內(nèi)已知。例如，它們可以包括電加熱的氣溶膠生成裝置，其中由從該氣溶膠生成裝置的一個或多個電熱元件至煙草加熱裝置的氣溶膠生成基底傳輸?shù)臒崃慨a(chǎn)生氣溶膠。合適地，煙草加熱裝置可以是氣溶膠生成裝置。優(yōu)選地，煙草加熱裝置可以是加熱但不燃燒(heat-not-burn)裝置。加熱但不燃燒裝置是領(lǐng)域內(nèi)已知的，并且通過加熱而不是燃燒煙草來釋放化合物。合適的加熱但不燃燒裝置的實(shí)例可以是在wo2013/034459或gb2515502中教導(dǎo)的一種，其通過引用結(jié)合于此。在一個實(shí)施方式中，煙草加熱裝置的氣溶膠生成基底可以是根據(jù)本發(fā)明的煙草產(chǎn)品。多核苷酸/多肽/構(gòu)建體/方法在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，編碼目的蛋白(例如，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子)的嵌合基因可以被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，引起目的蛋白在啟動子的指導(dǎo)下的受控表達(dá)。啟動子可以獲自包括動物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒的不同來源。啟動子也可以是合成構(gòu)建的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明以合適載體(例如，植物轉(zhuǎn)化載體)的方式將外源基因引入植物中。植物轉(zhuǎn)化載體可以包含表達(dá)盒，其含有在轉(zhuǎn)錄的方向上5’-3’的啟動子序列、目的基因(例如，表達(dá)失調(diào)的(deregulated)硝酸還原酶)編碼序列、可選地包括內(nèi)含子、可選地3’非翻譯的終止子序列(包括用于rna聚合酶的停止信號和用于聚腺苷化酶的多腺苷酸化信號)。啟動子序列可以以一個或多個拷貝存在，并且這些拷貝可以是上文描述的啟動子序列的相同體或變體。終止子序列可獲自植物、細(xì)菌或病毒基因。例如，合適的終止子序列為豌豆rbcse9終止子序列、來源于根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的胭脂堿合成酶(nopalinesynthase)基因的nos終止子序列以及來自花椰菜花葉病毒的35s終止子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會很容易知道其他適合的終止子序列。表達(dá)盒也可以包含基因表達(dá)增強(qiáng)機(jī)制以增加啟動子的強(qiáng)度。這種增強(qiáng)子元件的實(shí)例是來源于豌豆質(zhì)體藍(lán)素基因的啟動子的一部分，并且這是國際專利申請?zhí)杦o97/20056的主題。例如，合適的增強(qiáng)子元件可以是來源于根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因的nos增強(qiáng)子元件以及來自花椰菜花葉病毒的35s增強(qiáng)子元件。這些調(diào)控區(qū)可以來源于與啟動子dna序列相同的基因或可以來源于不同的基因，來自煙草或其他生物體，例如，來自茄科家族或來自cestroideae亞族的植物。所有的調(diào)控區(qū)應(yīng)當(dāng)能夠在待轉(zhuǎn)化的組織的細(xì)胞中操作。啟動子dna序列可以來源于與在本發(fā)明中使用的目的基因(例如，啟動子將要指導(dǎo)的基因，例如，編碼植物的修飾以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)的基因)編碼序列相同的基因或可以來源于不同的基因，來自煙草或另一個有機(jī)體，例如，來自茄科家族的植物或來自cestroideae亞族。當(dāng)提及“嵌合基因時(shí)”，其指的是編碼目的基因(例如，編碼表達(dá)失調(diào)的硝酸還原酶的基因)的核酸序列來源于與指導(dǎo)其表達(dá)的啟動子序列不同的來源(例如，來自不同的基因或來自不同的物種)。表達(dá)盒可以被并入基本植物轉(zhuǎn)化載體如pbin19plus、pbi101或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他合適的植物轉(zhuǎn)化載體中。除表達(dá)盒外，植物轉(zhuǎn)化載體會包含轉(zhuǎn)化過程所必需的這種序列。這些可以包括農(nóng)桿菌屬vir基因，一種或多種t-dna邊界序列和可選擇標(biāo)志物或其他識別轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方式。術(shù)語“植物轉(zhuǎn)化載體”指的是能夠體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。優(yōu)選地，表達(dá)載體被并入(incorporated)至有機(jī)體的基因組中。術(shù)語“并入”優(yōu)選地覆蓋穩(wěn)定并入基因組。用于轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且包括例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。構(gòu)建遺傳修飾的植物的基本原則是在植物基因組中插入遺傳信息以取得對所插入的遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定保持。一般技術(shù)的綜述可件于potrykus(annurevplantphysiolplantmolbiol[1991]42:205-225)和christon(agrofood-industryhi-techmarch/april199417-27)的文章中。典型地，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，通過農(nóng)桿菌與來自靶標(biāo)植物的外植體的共培養(yǎng)，將攜帶目的外源dna即嵌合基因的雙元載體(binaryvector)由合適的農(nóng)桿菌屬菌株轉(zhuǎn)移至靶標(biāo)植物。然后在選擇培養(yǎng)基中再生轉(zhuǎn)化的植物組織，選擇培養(yǎng)基包含可選擇標(biāo)志物和植物生長激素。可代替選項(xiàng)是浸花法(clough&bent,1998)，其中，使完整植物的花芽與包含嵌合基因的農(nóng)桿菌菌株的懸浮液接觸，并且在坐果后，通過在選擇性培養(yǎng)基上生長來發(fā)芽和識別轉(zhuǎn)化的個體。植物組織被農(nóng)桿菌直接感染是已被廣泛采用的簡單技術(shù)，并且其描述于butcherd.n.etal.,(1980),tissueculturemethodsforplantpathologists,eds.:d.s.ingramsandj.p.helgeson,203-208。另外的適合的轉(zhuǎn)化方法包括例如，使用聚乙二醇或電穿孔技術(shù)、粒子轟擊、微量注射和使用碳化硅纖維的直接基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體。使用轟擊轉(zhuǎn)化(ballistictransformation)來轉(zhuǎn)化植物，包括framebr,draytonpr,bagnaallsv,lewnaucj,bullockwp,wilsonhm,dunwelljm,thompsonja&wangk(1994)中教導(dǎo)的碳化硅晶須技術(shù)。theplantjournal6:941-948中教導(dǎo)了通過碳化硅晶須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)育性轉(zhuǎn)基因玉米植物，以及例如，在meyerp,heidmmmi&niedenhofi(1992)中教導(dǎo)了病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)。在gene110:213-217中教導(dǎo)了使用木薯花葉病毒作為用于植物的載體系統(tǒng)。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的更多教導(dǎo)可以在ep-a-0449375中找到。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種載體系統(tǒng)，其攜帶編碼目的基因(例如，編碼表達(dá)失調(diào)的硝酸還原酶的基因)的核苷酸序列并將它引入有機(jī)體如植物的基因組。載體系統(tǒng)可以包含一種載體，但它可以包含兩種載體。在兩種載體的情況下，載體系統(tǒng)通常被稱為雙元載體系統(tǒng)。在gynheunganetal,(1980),binaryvectors,plantmolecularbiologymanuala3,1-19中進(jìn)一步詳細(xì)地描述雙元載體系統(tǒng)。用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的一種廣泛應(yīng)用的系統(tǒng)使用來自根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的ti質(zhì)?；騺碜园l(fā)根農(nóng)桿菌(agrobacteriumrhizogenes)的ri質(zhì)粒，anetal.,(1986),plantphysiol.81,301-305andbutcherd.n.etal.,(1980),tissueculturemethodsforplantpathologists,eds.:d.s.ingramsandj.p.helgeson,203-208。在植物中引入根據(jù)本發(fā)明的所需外源基因的方法后，另外的dna序列的存在和/或插入可能是必要的。已在ep-a-120516；hoekema,in:thebinaryplantvectorsystemoffset-drukkerijkantersb.b.,amsterdam,1985,chapterv；fraley,etal.,crit.rev.plantsci.,4:1-46；andanetal.,emboj(1985)4:277-284中仔細(xì)研究并描述了應(yīng)用t-dna用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。用編碼目標(biāo)蛋白(例如，lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子)的外源基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以根據(jù)已知的組織培養(yǎng)方法生長和維持，如通過將細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有必須的生長因子如氨基酸、植物激素、維生素等的合適的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞。涉及本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”包括包含編碼目標(biāo)基因(例如，根據(jù)本發(fā)明的編碼lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的基因)的外源基因的任何植物。優(yōu)選地，外源基因被結(jié)合至植物的基因組中。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”和“嵌合基因”不包括當(dāng)在其天然啟動子(也在其自然環(huán)境中)的控制下時(shí)、在其自然環(huán)境中編碼序列的天然核苷酸。在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列、嵌合基因、植物轉(zhuǎn)化載體或植物細(xì)胞處于分離的形式。術(shù)語“分離的”指的是序列至少基本上沒有至少一種其他組分，該序列本質(zhì)上與該組分天然地相關(guān)并且是如在自然界中發(fā)現(xiàn)的那樣。在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列、嵌合基因、植物轉(zhuǎn)化載體或植物細(xì)胞處于純凈的狀態(tài)。術(shù)語“純凈的”指的是在一個相對純凈的狀態(tài)，例如，至少約90％純凈或至少約85％純凈。在此使用的術(shù)語“核苷酸序列”指的是寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及它們的變體、類似物、片段和衍生物(如它們的部分)。核苷酸序列可以是基因組的或合成的或重組體的起源的，其可以是雙鏈的或單鏈的而無論代表有義鏈還是無義鏈。本發(fā)明涉及的術(shù)語“核苷酸序列”包含基因組dna、cdna、合成dna和rna。優(yōu)選其表示dna，更優(yōu)選其表示為本發(fā)明編碼的cdna序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)涉及并包括本發(fā)明本身的范圍時(shí)，核苷酸序列不包括根據(jù)本發(fā)明的天然核苷酸序列，當(dāng)在其自然環(huán)境中時(shí)和當(dāng)與其自然相關(guān)的序列(也在其自然環(huán)境中)相關(guān)時(shí)。為了便于參考，我們應(yīng)當(dāng)將這種優(yōu)選的實(shí)施方式稱為“非天然核酸序列”。在此方面，術(shù)語“天然核苷酸序列”指的是在其天然環(huán)境中并且當(dāng)與整個啟動子(其是該序列天然相關(guān)的)可操作地連接時(shí)的整個核苷酸序列，啟動子也在其天然環(huán)境中。然而，本發(fā)明的范圍所覆蓋的氨基酸序列可以在其天然有機(jī)體中在核苷酸序列的表達(dá)后被分離和/或純化。然而，優(yōu)選地，本發(fā)明的范圍所覆蓋的氨基酸序列可以在其天然有機(jī)體中由核苷酸序列表達(dá)，但其中該核苷酸序列不受再處于在該有機(jī)體內(nèi)與該序列自然相關(guān)的啟動子的控制下。典型地，本發(fā)明的范圍所覆蓋的核苷酸序列是使用重組dna技術(shù)(例如，重組dna)制備的。然而，在本發(fā)明的可替代的實(shí)施方式中，核苷酸序列可以是使用領(lǐng)域內(nèi)已知的化學(xué)方法以其整體或局部合成的(參見caruthersmhetal.,(1980)nucacidsressympser215-23andhorntetal.,(1980)nucacidsressympser225-232)。編碼具有在此定義的具體性質(zhì)的蛋白質(zhì)或是適用于修飾的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以識別自和/或分離自和/或純化自產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的任何細(xì)胞或有機(jī)體。領(lǐng)域內(nèi)已知多種用于識別和/或分離和/或純化方法核苷酸序列的方法。舉例來說，在合適的序列已被識別和/或分離和/或純化后，可以使用pcr擴(kuò)增技術(shù)來制備更多序列。進(jìn)一步舉例來說，可以利用來自產(chǎn)生酶的有機(jī)體的染色體dna或信使rna來構(gòu)建基因組dna和/或cdna文庫。如果已知酶的氨基酸序列，可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并用于從制備自有機(jī)體的基因組庫中識別編碼酶的克隆。可替代地，包含與另一種已知的酶基因同源的序列的標(biāo)記的寡核苷酸探針可以被用于識別編碼酶的克隆。在后一種情況下，使用較低嚴(yán)格的雜交和洗滌條件。在進(jìn)一步的可選替換方式中，編碼酶的核苷酸序列可以是通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)化方法合成制備的，方法例如由beucages.l.etal.,(1981)tetrahedronletters22,p1859-1869描述的亞磷酰胺方法(phosphoroamiditemethod)或由matthesetal.,(1984)emboj.3,p801-805描述的方法。在亞磷酰胺方法中，在例如自動dna合成器中合成寡核苷酸，純化、退火、切割和克隆在合適的載體中。核苷酸序列可以是混合的基因組和合成的來源、混合的合成和cdna的來源或混合的基因組和cdna的來源，它們是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成的、基因組的或cdna的來源(視情況而定)的片段而制備的。每個被連接的片段對應(yīng)于整個核苷酸序列的各種部分。還可以通過使用特定引物的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)制備dna序列，例如，在us4,683,202或saikirketal.(science(1988)239,pp487-491)中所描述的。本發(fā)明的范圍還包括具有在此定義的具體性質(zhì)的酶的氨基酸序列。在此使用的術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“肽”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“酶”同義。氨基酸序列可以制備自和/或分離自合適的來源，或者它可以是合成制備的，或者它可以是通過使用dna重組技術(shù)制備的。優(yōu)選地，當(dāng)涉及并由本發(fā)明本身的范圍覆蓋時(shí)，氨基酸序列不是天然的酶。在此方面，術(shù)語“天然的酶”指的是在其天然環(huán)境中并且當(dāng)其已被其天然核苷酸序列表達(dá)時(shí)的整個酶。本發(fā)明還覆蓋與多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列的應(yīng)用，該多肽具有在此限定的具體性質(zhì)或是編碼這種多肽(以下簡稱“同源序列”)的任何核苷酸序列。這里，術(shù)語“同源物”指的是與主題氨基酸序列和主體核苷酸序列具有一定同源性的實(shí)體。這里，術(shù)語“同源”可以等同于“同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段應(yīng)當(dāng)提供和/或編碼保持酶的功能活性和/或提高酶的活性的多肽。典型地，同源序列會例如包含與受試者氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等等，或者會將編碼相同的活性位點(diǎn)。盡管同源也可以在相似性方面進(jìn)行考慮(即，具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，但在本發(fā)明的背景下，優(yōu)選在序列同一性方面表達(dá)同源性。在一個實(shí)施方式中，同源序列被包含在氨基酸序列或核苷酸序列中，與受試者序列相比，其有一個或幾個添加、刪除和/或替換。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及其氨基酸序列是在此示出的蛋白質(zhì)，或是通過替換、刪除或添加一個或幾個氨基酸(如在親本蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7、8、9個氨基酸或更多氨基酸，如10個或多于10個氨基酸)而來源于該(親本)蛋白質(zhì)并具有親本蛋白活性的蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及這樣的核酸序列(或基因)：編碼其氨基酸序列是在此示出的蛋白質(zhì)，或編碼通過替換、刪除或添加一個或幾個氨基酸(如在親本蛋白的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7、8、9個氨基酸或更多氨基酸，如10個或多于10個氨基酸)而來源于該(親本)蛋白質(zhì)并具有親本蛋白活性的蛋白質(zhì)。同源性或同一性比較可以通過眼睛進(jìn)行或者更常見的是，在的可用的序列比較程序的幫助下進(jìn)行。這些商業(yè)上可獲得的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算出兩個或更多序列之間的％同源性。可以計(jì)算連續(xù)序列的％同源性或％同一性，即一個程序與另一個程序?qū)R，并且一個序列中的每個氨基酸與另一個序列中的相應(yīng)氨基酸直接比較，每次一個殘基。這就是所謂的“無空位”對齊。典型地，這樣的無空位對齊僅在相對短數(shù)目的殘基上執(zhí)行。雖然是一種非常簡單和一致的方法，但這種方法沒有考慮，例如，在一對完全相同的序列中，一個插入或刪除將會引起隨后的氨基酸殘基無法對齊，這樣有可能導(dǎo)致在執(zhí)行全局對比時(shí)在％同源性方面的大的降低。因此，大多數(shù)的序列比較方法被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生最優(yōu)的對齊，它們考慮可能的插入和刪除而對整體同源性分?jǐn)?shù)進(jìn)行過度罰分。這是通過在序列對齊中插入“空位”以嘗試使局部同源性最大化而實(shí)現(xiàn)的。然而，這些更復(fù)雜的方法將“空位罰分”分配給在對齊中的發(fā)生的每個空位，使得對于相同數(shù)目的同一氨基酸而言，以盡可能少的空位進(jìn)行序列對齊(反映出兩個進(jìn)行對比的序列之間更高的關(guān)聯(lián)性)會獲得比具有多個空位的序列對比更高的分?jǐn)?shù)。通常使用“仿射空位成本(affinegapcosts)”，其對空位的存在收取(charge)較高成本而對空位中每個隨后的殘基收取較小罰分。這是最常用的空位評分系統(tǒng)。高空位罰分當(dāng)然會產(chǎn)生具有較少空位的優(yōu)化的對齊。大多數(shù)對齊程序允許修改空位罰分。但是，在使用這樣的軟件用于序列比較時(shí)，優(yōu)選使用默認(rèn)值。考慮到空位罰分，最大的％同源性的計(jì)算首先需要產(chǎn)生最優(yōu)的對齊。用于實(shí)施這種對齊的合適的電腦程序?yàn)関ectornti(invitrogencorp.)?？梢詧?zhí)行序列比較的軟件的實(shí)施例包括，但不限于例如，blast軟件包(參見ausubeletal1999shortprotocolsinmolecularbiology,4thed-chapter18)、blast2(參見femsmicrobiollett1999174(2):247-50；femsmicrobiollett1999177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、fasta(altschuletal1990j.mol.biol.403-410)和alignx。至少blast、blast2和fasta可以用于離線和在線搜索(參見ausubeletal1999,pages7-58to7-60)。盡管可以以同一性測量最終的％同源性，但對齊方法本身通常不是基于全或無的配對比較。相反地，通常使用比例相似性得分矩陣，其基于化學(xué)相似性或進(jìn)化距離將分?jǐn)?shù)分配至每個成對的比較。通常使用的這種矩陣的實(shí)例是losum62矩陣-用于程序的blast套件的默認(rèn)矩陣。vectornti程序通常使用公共默認(rèn)值或自定義符號對照表，如果提供的話(更多細(xì)節(jié)參見用戶手冊)。對于某些應(yīng)用，優(yōu)選使用用于vectornti包的默認(rèn)值?？商娲?，使用vectornti(invitrogencorp)中的多重對比特征，可以計(jì)算百分比同源性，它基于一種算法，類似于clustal(higginsdg&sharppm(1988),gene73(1),237-244)。一旦軟件產(chǎn)生了最優(yōu)對齊方式，就可能計(jì)算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。軟件典型地將這作為序列比較的一部分并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。在確定序列同一性時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用空位罰分，然后優(yōu)選地使用以下參數(shù)用于配對比較：對于blast空位打開0空位延伸0對于clustaldna蛋白質(zhì)字長21k三倍空位罰分1510空位延伸6.660.1在一個實(shí)施方式中，可以連同上面定義的空位罰分和空位延伸設(shè)置使用clustal。在一些實(shí)施方式中，用于blast或clustal對齊的空位罰分可以不同于以上詳述的那些。技術(shù)人員會意識到可以定期改變用于執(zhí)行blast和clustal對齊的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，并且在那個時(shí)候能夠基于針對blast或clustal對齊算法詳述的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)選擇合適的參數(shù)。合適地，在至少20個連續(xù)的核苷酸上、優(yōu)選在至少30個連續(xù)的核苷酸上、優(yōu)選在至少40個連續(xù)的核苷酸上、優(yōu)選在至少50個連續(xù)的核苷酸上、優(yōu)選在至少60個連續(xù)的核苷酸上、優(yōu)選在至少100個連續(xù)的核苷酸上確定關(guān)于核苷酸序列的同一性的程度。合適地，有關(guān)于核苷酸序列的同一性程度可以在整個序列上決定。序列也可能具有氨基酸殘基的刪除、插入或替換，這產(chǎn)生沉默(silent)的變化并產(chǎn)生功能上等價(jià)的物質(zhì)?？梢曰跉埢跇O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)方面的相似性進(jìn)行仔細(xì)考慮的氨基酸替換，只要保留物質(zhì)的二級結(jié)合活性即可。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；并且具有相似親水性值的帶有不帶電極性頭基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如，可以根據(jù)下表進(jìn)行保守替換。第二列中相同單元格并且優(yōu)選在第三列的相同行中的氨基酸可以互相替換：本發(fā)明也涵蓋了可以出現(xiàn)的同源替換(在此使用的替換(substitution)和代替(replacement)都指的是已存在的氨基酸殘基與可替換的殘基的互相交換)，即，相似的替換相似的(like-for-likesubstitution)，如堿性的替換堿性的、酸性的替換酸性的、極性的替換極性的，等等。同樣也可能發(fā)生非同源替換，即，由一類殘基至另一類，或可替代地，涉及包含非天然的氨基酸如鳥氨酸(以下簡稱z)、二氨基丁酸鳥氨酸(以下簡稱b)、正亮氨酸鳥氨酸(以下簡稱o)、吡啶基丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基丙氨酸(thienylalanine)、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸。也可以是由非天然氨基酸進(jìn)行代替，包含；α*和α-雙取代的*氨基酸、n-烷基氨基酸*、乳酸*，天然氨基酸的鹵化衍生物如三氟酪氨酸*、p-cl-苯基丙氨酸*、p-br-苯基丙氨酸*、p-i-苯基丙氨酸*、l-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、l-α-氨基丁酸*、l-γ-氨基丁酸*、l-α-氨基異丁酸*、l-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、l-甲硫氨酸砜#*、l-正亮氨酸*、l-正纈氨酸*、p-硝基-l-苯基丙氨酸*、l-羥基脯氨酸#、l-硫代脯氨酸*、苯基丙氨酸(phe)的甲基衍生物如4-甲基-phe*、五甲基-phe*、l-phe(4-氨基)#、l-tyr(甲基)*、l-phe(4-異丙基)*、l-tic(1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸)*、l-二氨基丙酸#和l-phe(4-芐基)*。為了如上討論的目的(涉及同源或非同源替換)，使用符號*表示衍生物的疏水性而使用#表示衍生物的親水性，#*表示兩親的特性。變體氨基酸序列可以包括合適的間隔子基團(tuán)，其可以插在任意兩個氨基酸殘基之間，除氨基酸間隔子之外，氨基酸殘基的序列包含烷基如甲基、乙基或丙基基團(tuán)，如甘氨酸或β-丙氨酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員會很好理解變體的另外的形式，包括在類肽形式中存在一種或多種氨基酸殘基。為了避免疑惑，使用的“類肽形式”指的是這樣的變體氨基酸殘基，其中α-碳取代基在殘基的氮原子上，而不是在α-碳上。以類肽形式制備多肽的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，例如，simonrjetal.,pnas(1992)89(20),9367-9371andhorwelldc,trendsbiotechnol.(1995)13(4),132-134。用于本發(fā)明中的核苷酸序列可以包括在其中的合成的或修飾的核苷酸。對寡核苷酸的許多不同類型的修飾是領(lǐng)域內(nèi)已知的。這些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’端或5’端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。對于本發(fā)明的目的，需要理解的是可以通過領(lǐng)域內(nèi)任何可用的方法修飾在此描述的核苷酸序列?？梢詫?shí)施這種修飾以提高本發(fā)明的核苷酸序列的體內(nèi)活性和壽命。本發(fā)明還涵蓋與本發(fā)明的核酸序列互補(bǔ)的序列或能夠與本發(fā)明的序列或其互補(bǔ)的序列雜交的序列。在此使用的術(shù)語“雜交”將包括“通過其使核酸的一個鏈經(jīng)堿基配對與互補(bǔ)鏈結(jié)合的方法”，以及如在聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增方法。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括在此提出的那些的互補(bǔ)序列)。優(yōu)選地，在嚴(yán)格的條件下檢測雜交(例如，50℃和0.2xssc{1xssc＝0.15mnacl,0.015mna3檸檬酸鹽ph7.0})。更優(yōu)選地，在高嚴(yán)格條件下檢測雜交(例如，65℃和0.1xssc{1xssc＝0.15mnacl,0.015mna3citrateph7.0})。一個方面，本發(fā)明使用的序列是合成序列-即通過體外的化學(xué)或酶的合成制備的序列。它包括但不限于使用針對宿主有機(jī)體的最優(yōu)化密碼子制成的序列。術(shù)語“表達(dá)載體”指的是能夠體內(nèi)或體外表達(dá)的構(gòu)建體。優(yōu)選地，表達(dá)載體被結(jié)合至合適宿主有機(jī)體的基因組中。術(shù)語“結(jié)合”優(yōu)選地包括穩(wěn)定結(jié)合在基因組中。本發(fā)明的核苷酸序列可以存在于載體中，在其中核苷酸序列可操作地連接至調(diào)控序列，能夠由合適宿主有機(jī)體提供核苷酸序列的表達(dá)。本發(fā)明中使用的載體可以轉(zhuǎn)化至在此描述的合適宿主細(xì)胞中以提供本發(fā)明的多肽的表達(dá)。載體的選擇例如質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體經(jīng)常取決于待引入載體的宿主細(xì)胞。載體可以體外使用，例如，用于生產(chǎn)rna或用于轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染宿主細(xì)胞。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，發(fā)明提供了通過將本發(fā)明的核苷酸序列引入可復(fù)制載體中、將載體引入相容的宿主細(xì)胞中以及使宿主細(xì)胞在引起載體復(fù)制的條件下生長來制備本發(fā)明的核苷酸序列的方法。載體可以進(jìn)一步包含使得載體能夠在討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。這些序列的實(shí)例為質(zhì)粒puc19、pacyc177、pub110、pe194、pamb1和pij702的復(fù)制起點(diǎn)。在一些應(yīng)用中，用于在本發(fā)明中使用的核苷酸序列可操作地連接至調(diào)控序列，其能夠提供用于核苷酸序列的表達(dá)，如通過選定的宿主細(xì)胞。舉例來說，本發(fā)明涵蓋含有可操作地連接至這種調(diào)控序列的本發(fā)明的核苷酸序列的載體，即，該載體為表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連接”指的是這樣的并置(juxtaposition)：在其中，所記載的組分處于允許它們以其預(yù)期的方式行使功能的關(guān)系中。調(diào)控序列“可操作地連接”至編碼序列是連接(ligated)，以這種方式在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。術(shù)語“調(diào)控序列”包含啟動子和增強(qiáng)子以及其他表達(dá)調(diào)控信號。術(shù)語“啟動子”以領(lǐng)域內(nèi)的通常意義使用，例如，rna聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。也可以通過選擇異源調(diào)節(jié)區(qū)例如啟動子、分泌前導(dǎo)和終止子區(qū)來實(shí)現(xiàn)編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的增強(qiáng)的表達(dá)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列至少與啟動子可操作地連接。術(shù)語“構(gòu)建體”-與術(shù)語如“結(jié)合物”、“盒”和“雜交體”同義-包括用于根據(jù)本發(fā)明使用的核苷酸序列，其直接或間接附著于啟動子。間接附著的實(shí)例為提供合適的間隔子基團(tuán)如內(nèi)含子序列，如sh1-內(nèi)含子或adh內(nèi)含子，在本發(fā)明的啟動子和核苷酸序列之間起媒介作用。同樣的道理，本發(fā)明涉及的術(shù)語“融合”包含直接或間接地附著。在一些情況下，這些術(shù)語不涵蓋通常與野生型基因啟動子相關(guān)的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的天然組合(并且當(dāng)它們均在其自然環(huán)境中時(shí))。這種構(gòu)建體甚至可以包含或表達(dá)允許對基因構(gòu)建體進(jìn)行選擇的標(biāo)志物。可以在potrykus(annurevplantphysiolplantmolbiol[1991]42:205-225)和christou(agro-food-industryhi-techmarch/april199417-27)的文章中找到用于轉(zhuǎn)化植物的常用技術(shù)的綜述。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步教導(dǎo)可以在ep-a-0449375中找到。除非另有定義，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本公開所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。singleton,etal.,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,20ed.,johnwileyandsons,newyork(1994)和hale&marham,theharpercollinsdictionaryofbiology,harperperennial,ny(1991)想本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了許多在本公開中使用的術(shù)語的綜合詞典。本公開并不限于在此公開的示例性方法和材料，在實(shí)踐或測試本公開的實(shí)施方式中，可以使用與在此描述的那些相似或等價(jià)的任何方法和材料。數(shù)值的范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另有指出，所有核酸序列均以5’至3’取向由左至右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基方向取向由左至右書寫。在此提供的標(biāo)題不限制本公開的很多方面或?qū)嵤┓绞剑梢酝ㄟ^以整體參考說明書來具有它們。因此，通過以整體參考說明書來更完整地限定下面定義的術(shù)語。在此使用氨基酸名字、三字母縮寫或單字母縮寫提及氨基酸。在此使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”，包括蛋白質(zhì)、多肽和肽類。如在此所使用的，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“酶”同義。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和術(shù)語“多肽”在此可以互換使用。在本公開和權(quán)利要求中，可以使用氨基酸殘基的慣例的單字母和三字母代碼。所定義的用于氨基酸3字母代碼符合iupaciubjointcommissiononbiochemicalnomenclature(jcbn)。也可以了解的是，由于遺傳密碼的簡并性，多肽可以由多于一個的核苷酸序列編碼。術(shù)語的其他定義可以出現(xiàn)在整個說明書中。在更詳細(xì)地描述示例性實(shí)施方式之前，需要了解的是本公開不限于所描述的特定實(shí)施方式，當(dāng)然，這樣可以是不同的。還要了解的是，在此使用的術(shù)語僅是為了描述特定的實(shí)施方式，而不是意在限制，因?yàn)楸竟_的范圍將只受隨附的權(quán)利要求的限制。對于所提供的數(shù)值的范圍，除非上下文另有明確規(guī)定，否則理解的是，還公開了在該范圍的上限和下線之間的每個中間值、至下限單元的十分之一。在任何記載的至之間的每個小范圍、或在記載的范圍中的中間值、以及在記載的范圍中的任何記載的或中間的值均涵蓋在本公開中。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在范圍內(nèi)或從中排除，并且其中兩者(上限和下限)任一個、兩者都不或兩者都是被包括在較小范圍內(nèi)的每個范圍也包含在本公開中，服從規(guī)定范圍內(nèi)的任何明確排除限制。在所記載的范圍包括一個或兩個極限值時(shí)，排除了那些包括的極限值中的任一個或兩者的范圍的同樣包含在本公開中。必須注意的是，除非上下文另有明確規(guī)定，否則在此和在附加的權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式的“一種(a)”、“一個(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)的指代詞。因此，例如，提及“一種酶”或“一種硝酸還原酶”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多個這類候選試劑和其等價(jià)物，等等。提供在此討論的出版物僅因?yàn)樗鼈兊墓_早于本應(yīng)用的申請日期。在此的任何公開內(nèi)容都不被解釋為承認(rèn)該出版物構(gòu)成隨附的權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)。優(yōu)勢與本發(fā)明相關(guān)的關(guān)鍵優(yōu)勢為減少制備自未被修飾以增加lbd氮響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的活性或表達(dá)的煙草植物的煙草產(chǎn)品中煙草特有的亞硝胺濃度(例如，nnk)?，F(xiàn)在，將參考下面的附圖和實(shí)施例、僅以實(shí)例的方式描述本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1lbd克隆從a.擬南芥cdna分離lbd基因lbd37(at5g67420.1)、lbd38(at3g49940.1)和lbd39(at4g37540.1)。它們被初步克隆到穿梭載體(可購自lifetechnologies)中，隨后被轉(zhuǎn)化到包含組成型香石竹蝕環(huán)病毒(cerv)啟動子、sag12衰老特異性啟動子和胭脂堿合成酶(nos)終止子的pbnp雙元載體中。在所有的序列分析都已認(rèn)定構(gòu)建體正確之后，它隨后被轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌lba4404中(可購自clontechlaboratories,inc.)并轉(zhuǎn)化到白肋ph2517中。實(shí)施例2煙草的轉(zhuǎn)化如由horschetal.(science227:1229-1231,1985)所描述的，使用葉盤共培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)化白肋ph2517植物。在50ml的lb肉湯加1g/l葡萄糖連同相關(guān)抗生素中建立經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的過夜培養(yǎng)物。在27℃下生長，直到達(dá)到0.6至0.99之間的od600。從7周的煙草植物中獲取最年輕的兩個完全展開的葉片并在8％的domestostm中進(jìn)行表面殺菌10分鐘，然后用無菌蒸餾水清洗4次。使用11mm的木塞穿孔器切葉盤，然后接種在農(nóng)桿菌懸浮液中兩分鐘。盤被在無菌濾紙片之間吸干(blotted)，并且在ms3％蔗糖+2.2μmbap+0.27μmnaa板上放置10盤/板。這些板被隨后培養(yǎng)2天。然后將盤轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有500g/l頭孢噻肟和100g/l卡那霉素的相同的msbn培養(yǎng)基的板。每兩周將盤被轉(zhuǎn)移到上述培養(yǎng)基的新鮮板上，直到小苗(shoot)開始形成。隨著小苗的出現(xiàn)，它們被切除并轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有500mg/l頭孢噻肟和100mg/l卡那霉素的含ls培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.5μmbap的板。在足夠大以后(～2周)，將這些轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有500mg/l頭孢噻肟的ls培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.5μmbap的廣口瓶中。大約3周后，小苗被轉(zhuǎn)移至ls培養(yǎng)基+3％蔗糖+250mg/l頭孢噻肟的廣口瓶中。再過3-4周以后，植物最終被轉(zhuǎn)移至ls培養(yǎng)基+3％蔗糖(無抗生素)使其生根。一旦植物扎根，將它們轉(zhuǎn)移至溫室的泥土中。組織培養(yǎng)的生長條件為24℃+/-1℃，16小時(shí)的日光。實(shí)施例3tsna水平檢測tsna分析轉(zhuǎn)包給internationalulc(62manitoudrive,kitchener,ontario,n2c1l3)。labstat使用的方法基于以下文獻(xiàn)：·wu,w.；ashley,d.l.；watson,c.h.anal.chem.(2003)75:4827-4832.·wagner,k.a.；finkel,n.h.；fossett,j.e.；gillman,i.g.anal.chem.(2005)77:1001-1006.·lee,j-m.；shinj-w.；oh,i_h.；leeu-c.；rheem-s.(2004)corestacongresskyoto.paperss20；參見http://www.coresta.org/past_abstracts/kyoto2004-smoketech.pdf·chwojdak,c.a.；self,d.a.；wheeler,h.r.acollaborative,harmonizedlc-ms/msmethodforthedeterminationoftobaccospecificnitrosamines(tsna)intobaccoandtobaccorelatedmaterials.61sttobaccoscienceresearchconference,charlotte,nc.usa.september24,2007.方法簡介：測試需要100g烤煙的最小取樣量。研磨和篩分煙草產(chǎn)品以確保顆粒尺寸<4mm，其中分析要在制備實(shí)驗(yàn)室組合物后盡快進(jìn)行。將一定量的包含四個氘標(biāo)記的tsna類似物(即nnn-d4、nat-d4、nab-d4、nnk-d4)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)加入煙草產(chǎn)品(0.75g)，然后在手腕動作振動器上將tsna化合物萃取至醋酸銨水溶液中。然后過濾萃取物并使其經(jīng)受利用正電噴霧電離(esi)的lc-msms分析。對于每種分析物，可以使用兩個質(zhì)量遷移對來輔助進(jìn)行分析物確認(rèn)和定量。最強(qiáng)的一對用于定量；強(qiáng)度相對弱的遷移對被用作用于進(jìn)一步化合物確認(rèn)的限定符(qualifier)。結(jié)果：圖3示出與野生型植物相比，生產(chǎn)自表達(dá)lbd37在組成型啟動子(024-0147)上的構(gòu)建體的植物的烤煙中的nnk和nnn水平顯著降低。生產(chǎn)自表達(dá)lbd38在衰老特異性啟動子(138-0148)上的構(gòu)建體的植物的烤煙同樣示出nnk的明顯減少。由于lbd38和lbd39的過表達(dá)意味著對植物的適度代價(jià)，lbd38和39在衰老特異性啟動子的控制下表達(dá)。然而，轉(zhuǎn)基因的影響被減弱，同樣，對tsna的減少的影響也減弱了。對于以衰老啟動子(0138-0148和0138-0149)表達(dá)的基因而言，與組成型啟動子(024-0147)相比，轉(zhuǎn)基因植物中nnk含量與對照相比減少的程度明顯較低。然而，由lbd37對nnk水平產(chǎn)生的影響對于80％的株系是顯著的，示出平均減少3至6倍。對攜帶lbd37基因的植物來說，nnn的減少也是統(tǒng)計(jì)上顯著的。與野生型對照相比，觀察到2至4倍較少的nnn的減少。實(shí)施例4煙葉氨基酸含量的分析(t1)使用由phenomenex提供的ez:faastlc/ms試劑盒測定野生型和轉(zhuǎn)基因白肋ph2517植物的氨基酸含量。所有試劑和供應(yīng)品，包括hplc色譜柱，均為試劑盒的組成部分。該過程的所有步驟均提供于用戶手冊kh0-7338中，將其用作實(shí)驗(yàn)方案。該方法涉及待分析樣品的固相萃取，然后是衍生化和液/液萃取。通過液相色譜-質(zhì)譜法(lc-ms)對衍生化的樣品進(jìn)行快速分析。通過吸附劑包裝的尖端進(jìn)行固相萃取，該尖端結(jié)合氨基酸同時(shí)允許干擾化合物流過。結(jié)合到吸附劑上的氨基酸被擠出到樣品小瓶中并在室溫下的水溶液中迅速用試劑衍生化。衍生化的氨基酸同時(shí)遷移至有機(jī)層用于使其與干擾化合物另外分離。然后將移走有機(jī)層，蒸發(fā)并在重溶在水性流動相中并在lc-ms系統(tǒng)上分析。在溫室中生長來自每個構(gòu)建體的4個獨(dú)立的植物。當(dāng)采集10號葉片(中間位置)并速凍在液氮中時(shí)，植物已生長了14周。下面呈現(xiàn)的結(jié)果獲自主要氨基酸含量的平均值。12株野生型植物生長在相同條件下并且對照呈現(xiàn)的結(jié)果代表12個中間葉片的平均氨基酸含量。結(jié)果與討論眾所周知的是，烤煙中的tsna含量與收獲時(shí)存在于葉片中的含氮物質(zhì)有關(guān)。衰老期的氮同化、氮運(yùn)輸、中樞氮代謝和循環(huán)都是涉及植物的氮狀態(tài)的事件。雖然非常復(fù)雜，但也認(rèn)識到氨基酸含量是植物氮狀態(tài)的反映并且潛在地是tsna前體水平的指征。圖2所示結(jié)果示出了氨基酸的分布，并且因此植物的氮狀態(tài)受構(gòu)建體影響。谷氨酸鹽/酯(glutamate)、谷氨酰胺(glutamine)和天冬酰胺顯然在野生型和轉(zhuǎn)基因植物中都是最豐富的3種氨基酸。然而，對于攜帶基因lbd37、lbd38或lbd39的許多轉(zhuǎn)基因株系而言，與野生型相比，總氨基酸的豐富度增加。此外，在轉(zhuǎn)基因植物中，示出與其他氨基酸相比，谷氨酸鹽/酯和脯氨酸占氨基酸總量的比例增加。這證明在攜帶3個lbd基因的過表達(dá)的植物中氮物質(zhì)分布的改變。實(shí)施例5煙草尼古丁水平的分析尼古丁分析轉(zhuǎn)包給labstat。labstat使用的方法基于以下文獻(xiàn)：·imperialtobaccocanadalimited,proceduresanalyticalservices,procedure11；“simultaneousdeterminationofsugarsandtotalalkaloidsintobacco”.·bran&luebbe,autoanalyser3(aa3)referencemanual.方法簡介：用1型水萃取陸地?zé)?groundtobacco)然后過濾。隨后在bran&luebbeautoanalyser3(aa3)上分析萃取物。每個樣品經(jīng)歷用緩沖的氫氧化鈉溶液的在線稀釋并透析到磺胺酸的流中。洗脫液與氯化氰反應(yīng)以形成黃綠色染料并且在比色計(jì)上在460nm處讀取吸光度。結(jié)果：圖4示出的尼古丁水平分析的結(jié)果表明，植物中l(wèi)bd37、lbd38和lbd39基因的表達(dá)引起所得到的煙草的尼古丁含量與野生型相比略有增加。由于尼古丁是富含氮的代謝物，這一結(jié)果是轉(zhuǎn)基因植物中氮分布/代謝改變的另一個指征。圖5表明，對于用衰老啟動子(0138-0148和0138-0149)表達(dá)lbd38和lbd39的植物而言，產(chǎn)量與野生型基本相同，但是對于用組成型啟動子(024-0147)表達(dá)lbd37的植物的產(chǎn)量卻略有減少。以上說明書中提到的所有出版物通過引用結(jié)合于此。對所描述的方法和本發(fā)明的系統(tǒng)的多種修飾和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的，只要不背離本發(fā)明的范圍和精神即可。盡管已經(jīng)與具體優(yōu)選的實(shí)施方式相關(guān)地描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被過度限制于這些具體的實(shí)施方式。事實(shí)上，意在將對生物化學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的描述模式的多種修改包括在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。序列表<110>英美煙草(投資)有限公司(britishamericantobacco(investments)limited)<120>方法<130>p106424cn<140>pct/gb2016/050260<141>2016-02-04<150>gb1501941.7<151>2015-02-05<160>27<170>patentinversion3.5<210>1<211>753<212>dna<213>擬南芥（arabidopsisthaliana）<400>1atgagctgcaatggttgccgtgttctccggaaaggttgcagcgagaattgtatcctccgg60ccatgtattcaatggattgaaaccgccgatgctcaaggccacgccaccgtcttcgtcgct120aaattcttcggccgtgctggtctcatgtcctttatctccgctgttccggattctcaacgt180cctgctttgtttcagtcgttgctctacgaagcttgtggaagaactgtcaatccagttaac240ggagcaatcggaatgttatggactggaaactggaatatctgtcaagcggctgttgaaaca300gtgcttcgcggcggttctttaagaccgatcccggagcttctcactcacggcggcggtttc360gctggctttccttcgcctacatctgaagaagcatctgagatctgcaccgaaatgttgaat420ctccagcaaaatgattccaccgatcgtaacatctatcatcattcacgattctcaagctct480agatctagatctactatggattcttcttctccgacgaaacgtaagagattatcatcggaa540gaccaaccatcttcggagcttgatctatctctcatccctaattttcccattaagcaagca600acaccttcttctacacggcggcgatcagtaacaccgtcgatgaactcagaggactccggg660acgacgacgactacgacggcgttttgtgacaagggtgatgtgtacggtaacggaggagga720gaaacgaccaagttgcttaacctttttgtttaa753<210>2<211>250<212>prt<213>擬南芥（arabidopsisthaliana）<400>2metsercysasnglycysargvalleuarglysglycyssergluasn151015cysileleuargprocysileglntrpilegluthralaaspalagln202530glyhisalathrvalphevalalalysphepheglyargalaglyleu354045metserpheileseralavalproaspserglnargproalaleuphe505560glnserleuleutyrglualacysglyargthrvalasnprovalasn65707580glyalaileglymetleutrpthrglyasntrpasnilecysglnala859095alavalgluthrvalleuargglyglyserleuargproileproglu100105110leuleuthrhisglyglyglyphealaglypheproserprothrser115120125gluglualasergluilecysthrglumetleuasnleuglnglnasn130135140aspserthraspargasniletyrhishisserargpheserserser145150155160argserargserthrmetaspserserserprothrlysarglysarg165170175leusersergluaspglnprosersergluleuaspleuserleuile180185190proasnpheproilelysglnalathrproserserthrargargarg195200205servalthrprosermetasnsergluaspserglythrthrthrthr210215220thrthralaphecysasplysglyaspvaltyrglyasnglyglygly225230235240gluthrthrlysleuleuasnleupheval245250<210>3<211>744<212>dna<213>擬南芥（arabidopsisthaliana）<400>3atgagttgcaatggttgtcgagttctacgaaaaggttgcagtgagaattgcatcctccgt60ccatgtattcaatggatcgaatcacctgaagctcaaggccacgccaccgtcttcgtcgct120aagttcttcggccgtgccggtttaatgtctttcatctccgccgtaccggaatctcaatgc180cctgctttgtttcagtctttgctatacgaagcttgtgggagaactgtgaatccggtgaac240ggagccgtcggattgttgtggacggggaattggaatgtttgtcaagcggcggttgagacg300gtgcttcgtggtggttctttaaaaccaataccggagcttcttaacggcggtggattcgcc360gggtttccgtctcctacttccgacgaagcttcggagatctgtacggaaatgttgaatcta420cgaaaagctgatgattccggtgatcggaacatttatcatcactgccgattctcaagctct480agatctagatcaagatcaacagcttctccgccgaaacggaaacgattatcgtcggaacaa540caaccttcgtcggagcttgatctctctcttattcctatttatccgattaaaaccttgccg600tttaaggaagatacaccgtcgatgtactcggaggagtctgttaccacggtttcgtttcaa660aacaacaacgccggtgatcggtacgtacgctgcggcggaggaggaggaggagcaacgaca720aagttgctcaatctcttcgcttga744<210>4<211>247<212>prt<213>擬南芥（arabidopsisthaliana）<400>4metsercysasnglycysargvalleuarglysglycyssergluasn151015cysileleuargprocysileglntrpilegluserproglualagln202530glyhisalathrvalphevalalalysphepheglyargalaglyleu354045metserpheileseralavalprogluserglncysproalaleuphe505560glnserleuleutyrglualacysglyargthrvalasnprovalasn65707580glyalavalglyleuleutrpthrglyasntrpasnvalcysglnala859095alavalgluthrvalleuargglyglyserleulysproileproglu100105110leuleuasnglyglyglyphealaglypheproserprothrserasp115120125glualasergluilecysthrglumetleuasnleuarglysalaasp130135140aspserglyaspargasniletyrhishiscysargpheserserser145150155160argserargserargserthralaserproprolysarglysargleu165170175sersergluglngl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