本申請(qǐng)公開一種用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法。
背景技術(shù)：
：使臉明亮的皮膚美白化妝品引起了很多人的興趣。特別是東方女性表現(xiàn)出極大的興趣。這是世界領(lǐng)先的化妝品公司將東方女性作為目標(biāo)的充分的理由。與白種人或黑種人相比，東方人人口眾多，且往往對(duì)于明亮的皮膚有著不尋常的眷戀。沒有幾個(gè)女人能避免戶外運(yùn)動(dòng)。特別是在高爾夫球場(chǎng)上，有些人打高爾夫戴口罩并用衣服遮住胳膊和腿。而防曬霜阻止紫外線照射，皮膚美白化妝品防止紫外線照射后的黑色素生成。僅在皮膚美白物質(zhì)的濃度高于預(yù)定水平時(shí)，韓國(guó)食品藥品管理局(koreafood&drugadministration)才會(huì)批準(zhǔn)功能性化妝品。這是因?yàn)橹挥挟?dāng)存在高于預(yù)定量的皮膚美白物質(zhì)時(shí)，皮膚美白物質(zhì)才能顯示其功效。皮膚美白物質(zhì)通過各種機(jī)理防止黑色素生成。例如，皮膚美白物質(zhì)阻止了酪氨酸酶的活化，酪氨酸酶是參與黑色素生成，防止由酪氨酸酶刺激的酪氨酸的氧化，或防止黑色素從黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)移至角質(zhì)形成細(xì)胞的酶。但是，皮膚美白物質(zhì)往往會(huì)引起副作用。例如，具有功能性皮膚美白物質(zhì)“杜鵑醇(或白樺精萃)”作為主要成分的kanebo皮膚美白系列在約16,000名消費(fèi)者中引起白斑病樣癥狀，導(dǎo)致巨額賠償金和品牌廢除。kanebo的杜鵑醇已開發(fā)為有效預(yù)防黑色素生成的物質(zhì)并作為皮膚美白化妝品銷售，其類似物覆盆子酮和莫諾苯腙使患有白斑病的患者的皮膚脫色，通常認(rèn)為伴有黑色素細(xì)胞毒性。相比之下，對(duì)于通過類似機(jī)理(抑制酪氨酸酶活性)表現(xiàn)出抑制黑色素生成的作用的嚕忻喏(4-n-丁基間苯二酚)，消費(fèi)者沒有報(bào)道商業(yè)化的皮膚美白產(chǎn)品的臨床問題。因此，對(duì)通過例如能夠預(yù)測(cè)在長(zhǎng)期反復(fù)使用美白成分后可能發(fā)生的臨床副作用的系統(tǒng)來篩選物質(zhì)的安全性的需要正在增加。另外，需要一種能夠方便、快速、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)美白成分的副作用的系統(tǒng)，這是因?yàn)闉榱苏{(diào)查美白成分的安全性而消耗長(zhǎng)達(dá)幾年的時(shí)間以及巨額成本并不合理。相關(guān)技術(shù)的引用(專利文獻(xiàn)1)韓國(guó)專利注冊(cè)公開號(hào)10-1206200。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問題在一方面，本申請(qǐng)公開用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法。另一方面，本申請(qǐng)旨在提供一種通過預(yù)測(cè)美白成分的副作用來判斷副作用明顯降低的美白成分的方法。技術(shù)方案在一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜跍y(cè)量由于長(zhǎng)期使用美白成分而引起的細(xì)胞毒性增加的方法作為用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于測(cè)量皮膚美白濃度和細(xì)胞毒性濃度之間的相關(guān)因子的方法作為用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于測(cè)量由于紫外線預(yù)處理引起的對(duì)美白成分的敏感度增加的方法作為預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法。有益效果根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)方面，用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法提供有效地預(yù)測(cè)長(zhǎng)期使用美白成分時(shí)可能發(fā)生的副作用的作用。根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)方面，用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法提供方便地研究皮膚美白濃度與細(xì)胞毒性濃度之間的相關(guān)性的作用。根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)方面，用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法提供有效地預(yù)測(cè)由于紫外線照射引起的副作用增加的作用。附圖說明圖1展示測(cè)試實(shí)施例中用作美白成分的測(cè)試物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。圖2展示在測(cè)試實(shí)施例1-1中測(cè)得的不同濃度的樣品在第1天和第7天的細(xì)胞毒性。rd表示杜鵑醇，rk表示覆盆子酮，mb表示莫諾苯腙，rc表示嚕忻喏，且ap表示5-金剛烷-1-基-n-(2,4-二羥基芐基)-2,4-二甲氧基-苯甲酰胺。圖3展示在測(cè)試實(shí)施例中用樣品處理24小時(shí)后測(cè)得的細(xì)胞毒性，在更換新鮮培養(yǎng)基后用樣品處理24小時(shí)和48小時(shí)后測(cè)得的細(xì)胞毒性，以及用樣品處理72小時(shí)后測(cè)得的細(xì)胞毒性。圖4比較了在測(cè)試實(shí)施例2中測(cè)得的在第7天樣品中黑色素合成的抑制濃度。圖5比較了測(cè)試實(shí)施例3中測(cè)得的7天中接受uvb照射或不接受uvb照射的細(xì)胞毒性的變化。具體實(shí)施方式在一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N通過測(cè)量由于長(zhǎng)期使用美白成分引起的毒性增加來預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法。在一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，所述方法包括測(cè)量以下中的至少一項(xiàng)：i)由于長(zhǎng)期使用美白成分而引起的毒性的增加；ii)皮膚美白濃度與細(xì)胞毒性濃度之差；和iii)由于紫外線預(yù)處理引起的對(duì)美白成分的敏感度的增加。一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其中i)的毒性的增加為在用美白成分處理黑色素細(xì)胞之后48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間測(cè)得的第二細(xì)胞毒性與在3-36小時(shí)測(cè)得的第一細(xì)胞毒性的比率。一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其中ii)的皮膚美白濃度與細(xì)胞毒性濃度之差為造成黑色素細(xì)胞毒性的美白成分的細(xì)胞毒性濃度與有效抑制黑色素細(xì)胞的黑色素生成的美白成分的黑色素生成有效抑制濃度的相關(guān)因子。一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其中iii)的敏感度的增加為其中用美白成分處理經(jīng)紫外線照射的黑色素細(xì)胞的測(cè)試組的細(xì)胞毒性與其中用美白成分處理未經(jīng)紫外線照射的黑色素細(xì)胞的對(duì)照組的細(xì)胞毒性的比率。一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其包括：將美白成分加入黑色素細(xì)胞中的步驟；在將美白成分加入至黑色素細(xì)胞后3-36小時(shí)測(cè)量第一細(xì)胞毒性的步驟；在將美白成分加入至黑色素細(xì)胞后48小時(shí)測(cè)量第二細(xì)胞毒性的步驟；以及測(cè)量第二細(xì)胞毒性與第一細(xì)胞毒性的比率的步驟。在本申請(qǐng)的一方面，可以例如在3小時(shí)或更晚，4小時(shí)或更晚、6小時(shí)或更晚、8小時(shí)或更晚、10小時(shí)或更晚、12小時(shí)或更晚、14天或更晚、16小時(shí)或更晚、18小時(shí)或更晚、20小時(shí)或更晚、或22小時(shí)或更晚測(cè)量第一細(xì)胞毒性。此外，可以例如在36小時(shí)或更早、34小時(shí)或更早、32小時(shí)或更早、30小時(shí)或更早、28小時(shí)或更早、26小時(shí)或更早、或24小時(shí)或更早測(cè)量第一細(xì)胞毒性。在本申請(qǐng)的一方面，可以例如在48小時(shí)或更晚、60小時(shí)或更晚、72小時(shí)或更晚、84小時(shí)或更晚、96小時(shí)或更晚、108小時(shí)或更晚、120小時(shí)或更晚、132小時(shí)或更晚、144小時(shí)或更晚、156小時(shí)或更晚、168小時(shí)或更晚、或180小時(shí)或更晚測(cè)量第二細(xì)胞毒性。此外，可以例如在480小時(shí)或更早、456小時(shí)或更早、432小時(shí)或更早、408小時(shí)或更早、384小時(shí)或更早、360小時(shí)或更早、336小時(shí)或更早、312小時(shí)或更早、288小時(shí)或更早、264小時(shí)或更早、240小時(shí)或更早、216小時(shí)或更早，或192小時(shí)或更早測(cè)量第二細(xì)胞毒性。當(dāng)在上述時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，可以有效地測(cè)量細(xì)胞毒性的比率。在本申請(qǐng)的一方面，細(xì)胞毒性可以是與未用美白成分處理的對(duì)照組相比，由用美白成分處理的細(xì)胞的吸光度表示的細(xì)胞存活率(％)。例如，可以根據(jù)等式1通過測(cè)量細(xì)胞存活率(％)來預(yù)測(cè)美白成分的副作用。[等式1]細(xì)胞存活率(％)＝{(a樣品-ab)/(ac-ab)}x100a樣品：用美白成分處理的樣品在450nm的吸光度ab：空白的吸光度ac：載體對(duì)照的吸光度(0.5％dmso)在本申請(qǐng)的一方面，細(xì)胞毒性可以為與未用美白成分處理的對(duì)照組相比，20％細(xì)胞死亡的cc20(20％細(xì)胞毒性濃度)。cc20通常被認(rèn)為是細(xì)胞毒性開始出現(xiàn)的濃度。在本申請(qǐng)的一個(gè)方面，細(xì)胞毒性可以是與未用美白成分處理的對(duì)照組相比，一半細(xì)胞死亡的cc50(50％細(xì)胞毒性濃度)，其中。cc50是與載體對(duì)照組相比一半細(xì)胞死亡的濃度。在本申請(qǐng)的一方面，可以測(cè)量第二細(xì)胞毒性與第一細(xì)胞毒性的比率作為倍數(shù)值。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其包括測(cè)量皮膚美白濃度與細(xì)胞毒性濃度之差。例如，可以通過測(cè)量用美白成分處理黑色素細(xì)胞后的細(xì)胞毒性濃度，測(cè)量處理后黑色素細(xì)胞的黑色素生成有效抑制濃度，并測(cè)定與黑色素生成有效抑制濃度相比細(xì)胞毒性濃度的相關(guān)因子來測(cè)量皮膚美白濃度與細(xì)胞毒性濃度之差。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其包括：在將美白成分加入至黑色素細(xì)胞后3-480小時(shí)測(cè)量細(xì)胞毒性濃度的步驟；在將美白成分加入至黑色素細(xì)胞后的3-480小時(shí)，測(cè)量ec50，或抑制50％黑色素生成的有效濃度的步驟；以及通過將細(xì)胞毒性除以ec50來測(cè)量細(xì)胞毒性濃度和黑色素生成有效抑制濃度(ec50)的相關(guān)因子的步驟。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其中細(xì)胞毒性濃度為與對(duì)照組相比一半細(xì)胞死亡的cc50(50％細(xì)胞毒性濃度)，或?yàn)榕c對(duì)照組相比20％細(xì)胞死亡的cc20(20％細(xì)胞毒性濃度)。在本申請(qǐng)的另一方面，可以例如在3小時(shí)或更晚、6小時(shí)或更晚、12小時(shí)或更晚、24小時(shí)或更晚、48小時(shí)或更晚、60小時(shí)或更晚、72小時(shí)或更晚、84小時(shí)或更晚、96小時(shí)或更晚、108小時(shí)或更晚、120小時(shí)或更晚、132小時(shí)或更晚、144小時(shí)或更晚、156小時(shí)或更晚、168小時(shí)或更晚，或180小時(shí)或更晚測(cè)量所述細(xì)胞毒性。此外，可以例如在480小時(shí)或更早、456小時(shí)或更早、432小時(shí)或更早、408小時(shí)或更早、384小時(shí)或更早、360小時(shí)或更早、336小時(shí)或更早、312小時(shí)或更早、288小時(shí)或更早、264小時(shí)或更早、240小時(shí)或更早、216小時(shí)或更早，或192小時(shí)或更早測(cè)量所述細(xì)胞毒性。在本申請(qǐng)的另一方面，可以例如在3小時(shí)或更晚、6小時(shí)或更晚、12小時(shí)或更晚、24小時(shí)或更晚、48小時(shí)或更晚、60小時(shí)或更晚、72小時(shí)或更晚、84小時(shí)或更晚、96小時(shí)或更晚、108小時(shí)或更晚、120小時(shí)或更晚、132小時(shí)或更晚、144小時(shí)或更晚、156小時(shí)或更晚、168小時(shí)或更晚、或180小時(shí)或更晚測(cè)量有效濃度ec50。此外，可以例如在480小時(shí)或更早、456小時(shí)或更早、432小時(shí)或更早、408小時(shí)或更早、384小時(shí)或更早、360小時(shí)或更早、336小時(shí)或更早、312小時(shí)或更早、288小時(shí)或更早、264小時(shí)或更早、240小時(shí)或更早、216小時(shí)或更早，或192小時(shí)或更早測(cè)量有效濃度ec50。當(dāng)在上述時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，可以有效地測(cè)量皮膚美白效果(黑色素細(xì)胞的黑色素生成有效抑制濃度)與細(xì)胞毒性濃度之間的相關(guān)因子。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N通過測(cè)量由于紫外線預(yù)處理引起的對(duì)美白成分的敏感度的增加來預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法。例如，可以通過測(cè)量其中用美白成分處理的經(jīng)紫外線照射的黑色素細(xì)胞的測(cè)試組的細(xì)胞毒性，測(cè)量其中用美白成分處理的未經(jīng)紫外線照射的黑色素細(xì)胞的對(duì)照組的細(xì)胞毒性并測(cè)量試驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞毒性比率來測(cè)量敏感度的增加。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其包括：在用美白成分處理經(jīng)紫外線照射的黑色素細(xì)胞后的3-480小時(shí)測(cè)量測(cè)試組的細(xì)胞毒性，并在用美白成分處理未經(jīng)紫外線照射的黑色素細(xì)胞后3-480小時(shí)測(cè)量對(duì)照組的細(xì)胞毒性的步驟；以及測(cè)定試驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞毒性的比率的步驟。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，其中測(cè)試組和對(duì)照組的細(xì)胞毒性為根據(jù)等式1所示的細(xì)胞存活率(％)。在本申請(qǐng)的另一方面，可以例如在3小時(shí)或更晚、6小時(shí)或更晚、12小時(shí)或更晚、24小時(shí)或更晚、48小時(shí)或更晚、60小時(shí)或更晚、72小時(shí)或更晚、84小時(shí)或更晚、96小時(shí)或更晚、108小時(shí)或更晚、120小時(shí)或更晚、132小時(shí)或更晚、144小時(shí)或更晚、156小時(shí)或更晚、168小時(shí)或更晚、或180小時(shí)或更晚測(cè)量測(cè)試組和對(duì)照組的細(xì)胞毒性。此外，可以例如在480小時(shí)或更早、456小時(shí)或更早、432小時(shí)或更早、408小時(shí)或更早、384小時(shí)或更早、360小時(shí)或更早、336小時(shí)或更早、312小時(shí)或更早、288小時(shí)或更早、264小時(shí)或更早、240小時(shí)或更早、216或更早、或192或更早測(cè)量測(cè)試組和對(duì)照組的細(xì)胞毒性。當(dāng)在上述時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，可以有效地測(cè)量由于紫外線預(yù)處理引起的對(duì)美白成分的敏感度的增加。在本申請(qǐng)的另一方面，uv的強(qiáng)度可以為0.1mj/cm3或更高、0.5mj/cm3或更高、1mj/cm3或更高、2mj/cm3或更高、3mj/cm3或更高、4mj/cm3或更高、5mj/cm3或更高、6mj/cm3或更高、7mj/cm3或更高、8mj/cm3或更高、9mj/cm3或更高、10mj/cm3或更高、11mj/cm3或更高、12mj/cm3或更高、13mj/cm3或更高、14mj/cm3或更高、15mj/cm3或更高、16mj/cm3或更高、17mj/cm3或更高、18mj/cm3或更高、19mj/cm3或更高、或20mj/cm3或更高。此外，uv的強(qiáng)度可以為500mj/cm3或更低、480mj/cm3或更低、460mj/cm3或更低、44mj/cm3或更低、420mj/cm3或更低、400mj/cm3或更低、380mj/cm3或更低、360mj/cm3或更低、340mj/cm3或更低、320mj/cm3或更低、300mj/cm3或更低、280mj/cm3或更低、260mj/cm3或更低、240mj/cm3或更低、220mj/cm3或更低、200mj/cm3或更低、180mj/cm3或更低、160mj/cm3或更低、140mj/cm3或更低、120mj/cm3或更低、100mj/cm3或更低、80mj/cm3或更低、60mj/cm3或更低、或40mj/cm3或更低。當(dāng)在上述時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，可以有效地測(cè)量由于紫外線預(yù)處理引起的對(duì)美白成分的敏感度的增加。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，該方法包括測(cè)量上述那些項(xiàng)目之一。美白成分的副作用是各種各樣的且代表性副作用包括皮膚老化、致癌作用、痤瘡、皸裂、白斑病等。其最典型的副作用是白斑病。已知引起白斑病樣副作用的美白成分包括杜鵑醇、覆盆子酮和莫諾苯腙。在本申請(qǐng)中，這些美白成分用作黑色素細(xì)胞毒性的陽(yáng)性化合物。1998年，pola化學(xué)工業(yè)公司的okubo博士開發(fā)了從杉木中分離出的作為具有皮膚美白效果的物質(zhì)4-丁基間苯二酚。其于1999年投入市場(chǎng)，名稱為嚕忻喏。這種美白成分在皮膚美白產(chǎn)品中的使用已超過15年。由于這些產(chǎn)品的用戶沒有報(bào)告臨床副作用，因此在本申請(qǐng)中使用安全性已經(jīng)通過長(zhǎng)期使用證實(shí)的嚕忻喏作為黑色素細(xì)胞毒性的陰性化合物?！景l(fā)明模式】以下，通過實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行詳細(xì)說明。然而，以下實(shí)施例僅用于說明的目的，本申請(qǐng)的范圍不受實(shí)施例的限制。美白成分(測(cè)試物質(zhì))的制備測(cè)試物質(zhì)為杜鵑醇(>98％)、覆盆子酮(>98％)、莫諾苯腙(>98％)、嚕忻喏(>98％)和5-金剛烷-1-基-n-(2,4-二羥基芐基)2,4-二甲氧基-苯甲酰胺(>98％)。杜鵑醇、覆盆子酮和5-金剛烷-1-基-n-(2,4-二羥基芐基)2,4-二甲氧基-苯甲酰胺是合成的(圖1)。特別地，本申請(qǐng)的發(fā)明人合成的物質(zhì)5-金剛烷-1-基-n-(2,4-二羥基芐基)-2,4-二甲氧基-苯甲酰胺(以下稱為“ap”)具有化學(xué)式1的結(jié)構(gòu)且在測(cè)試實(shí)施例2中發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)黑色素細(xì)胞的黑色素生成的優(yōu)異抑制作用?！净瘜W(xué)式1】5-金剛烷-1-基-n-(2,4-二羥基芐基)-2,4-二甲氧基-苯甲酰胺莫諾苯腙(4-芐氧基-苯酚)購(gòu)自santacruzbiotechnology(美國(guó)，目錄號(hào)：sc-232257)，嚕忻喏(4-丁基間苯二酚)購(gòu)自東京化工(tokyochemicalindustry，日本，目錄號(hào)：3b773)。將所有測(cè)試物質(zhì)溶于dmso中，并在dmso中處理使細(xì)胞終濃度為0.5％。黑色素細(xì)胞的制備在實(shí)驗(yàn)中使用hemn-mp和a375細(xì)胞。hemn-mp(人表皮黑色素細(xì)胞，新生的，中度色素供體，目錄號(hào)：c-102-5c)細(xì)胞購(gòu)自lifetechnologies(美國(guó))。作為細(xì)胞培養(yǎng)基，使用補(bǔ)充有hmgs(目錄號(hào)s-002-5)的培養(yǎng)基254(目錄號(hào)m-254-500)。根據(jù)制造商手冊(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，使用第3-8代的細(xì)胞?？偠灾?7℃、5％co2培養(yǎng)箱中在175t燒瓶中培養(yǎng)細(xì)胞。在傳代培養(yǎng)期間，使用0.05％胰蛋白酶-edta分離細(xì)胞，通過離心(1200rpm，5分鐘)收集細(xì)胞，并在接種后培養(yǎng)至5×103個(gè)細(xì)胞/cm2。對(duì)于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，將細(xì)胞接種到每個(gè)孔為2x104個(gè)細(xì)胞的96孔板上，培養(yǎng)一天，并用每種物質(zhì)以200μl/孔進(jìn)行處理。然后，在預(yù)定時(shí)間后測(cè)量細(xì)胞毒性。a375(人黑色素瘤細(xì)胞系)細(xì)胞購(gòu)自atcc(目錄號(hào)crl-1619，美國(guó))。作為細(xì)胞培養(yǎng)基，使用補(bǔ)充有10％fbs(目錄號(hào)：16000-044，gibco，美國(guó))的dmem(目錄號(hào)：12-604，lonza，美國(guó))。以相同的方式對(duì)hem細(xì)胞進(jìn)行亞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)。細(xì)胞毒性測(cè)量通過dojindomoleculartechnologies(美國(guó))制造的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cellcountingkit-8，cck-8)測(cè)量細(xì)胞毒性。從96孔板中移除培養(yǎng)基后，向每個(gè)孔中加入200μl的相同培養(yǎng)基中的10％cck-8。在37℃溫育約2小時(shí)后，使用elisa讀數(shù)儀在450nm下測(cè)定100μl培養(yǎng)基的吸光度。隨著細(xì)胞死亡，cck-8的顏色從無色變成橙色，轉(zhuǎn)變成更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。根據(jù)等式1計(jì)算細(xì)胞存活率。[等式1]細(xì)胞存活率(％)＝{(a樣品-ab)/(ac-ab)}x100a樣品：用美白成分處理的樣品在450nm下的吸光度ab：空白的吸光度ac：載體對(duì)照的吸光度(0.5％dmso)統(tǒng)計(jì)分析通過學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?；谌位蚋啻为?dú)立測(cè)試的結(jié)果，獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。測(cè)試實(shí)施例1-1：取決于美白成分和處理時(shí)間的hemn-mp細(xì)胞的細(xì)胞毒性濃度的比較為了確定美白成分對(duì)hemn-mp(人表皮黑色素細(xì)胞，新生的，中度色素供體，目錄號(hào)：c-102-5c)細(xì)胞的細(xì)胞毒性濃度，與用每種美白成分以表1(圖2)中描述的濃度處理后在第1天和第7天的對(duì)照組(0.5％dmso)相比，測(cè)量細(xì)胞存活率(％細(xì)胞存活率)。根據(jù)測(cè)量結(jié)果，計(jì)算關(guān)于美白成分和處理時(shí)間的cc20和cc50。然后，計(jì)算第7天的細(xì)胞毒性濃度與第1天的細(xì)胞毒性濃度相比的比率(表2)?！颈?】【表2】在使用hemn-mp細(xì)胞的毒性試驗(yàn)中，美白成分的細(xì)胞毒性取決于暴露時(shí)間而明顯變化。在美白成分中，已知具有副作用的rd、rk和mb在第7天與第1天相比顯示出細(xì)胞毒性增加(cc50)4.5-14.9倍。相比之下，沒有報(bào)道臨床副作用的rc(1.2倍)和ap(2.2倍)顯示出細(xì)胞毒性增加相對(duì)較小(表2)。這表明毒性的增加取決于樣品的處理(暴露)時(shí)間。有趣的是，對(duì)已知引起白斑病(黑色素細(xì)胞毒性)的rd、rk和mb，這種現(xiàn)象特別明顯。結(jié)論，當(dāng)?shù)?天的細(xì)胞毒性與第1天的細(xì)胞毒性相比為2.7倍或更高、2.8倍或更高、2.9倍或更高、3.0倍或更高、3.1倍或更高、3.2倍或更高、3.3倍或更高、3.4倍或更高、3.5倍或更高、3.6倍或更高、3.7倍或更高、3.8倍或更高、3.9倍或更高、4.0倍或更高、4.1倍或更高、4.2倍或更高、4.3倍或更高、或4.4倍或更高時(shí)，可以確定美白成分有副作用。測(cè)試實(shí)施例1-2取決于美白成分和處理時(shí)間的a375細(xì)胞的細(xì)胞毒性濃度的比較研究美白成分對(duì)不同處理時(shí)間下的a375(人黑色素瘤細(xì)胞系，目錄號(hào)crl-1619)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。測(cè)量3種不同樣品處理?xiàng)l件的毒性。在更換新鮮培養(yǎng)基后，用美白成分將樣品處理24小時(shí)和48小時(shí)，和在不更換培養(yǎng)基的情況下，用美白成分將樣品處理72小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞毒性。結(jié)果如圖(圖3)所示。根據(jù)測(cè)量結(jié)果，計(jì)算關(guān)于美白成分和處理時(shí)間的cc20和cc50。然后，計(jì)算第3天的細(xì)胞毒性濃度與第1天的細(xì)胞毒性濃度相比的比率(表3)。【表3】對(duì)于a375細(xì)胞，與第1天相比，用rd、rk和mb處理治療后第3天的細(xì)胞毒性增加約16.8-41倍(cc50)，而rc(4.2倍)和ap(1.7倍)的毒性增加較小(表3)。rd、rk和mb顯示毒性隨時(shí)間明顯增加，表明用這些樣品處理的黑色素細(xì)胞的毒性與時(shí)間成比例。這被認(rèn)為是引起白斑病的樣品的體外黑色素細(xì)胞毒性的特征之一。結(jié)論，可以確定當(dāng)?shù)?天的細(xì)胞毒性與第1天的細(xì)胞毒性相比為7倍或更高、7.5倍或更高、8倍或更高、8.5倍或更高、9倍或更高、9.5倍或更高、10倍或更高、10.5倍或更高、11倍或更高、11.5倍或更高、或12倍或更高時(shí)，美白成分有副作用。特別是，當(dāng)用樣品對(duì)a375細(xì)胞處理一天，然后在去除樣品后再培養(yǎng)2天時(shí)，用rd、rk和mb樣品處理的組顯示毒性持續(xù)增加，而用rc和ap處理的組顯示細(xì)胞毒性沒有增加。這表明去除樣品后細(xì)胞毒性的恢復(fù)取決于樣品而不同。這是引起白斑病的美白成分與rc和ap美白成分之間的另一個(gè)差異(圖2)。測(cè)試實(shí)施例2hemn-mp細(xì)胞的細(xì)胞毒濃度與美白成分有效濃度的相關(guān)性的比較研究對(duì)于hemn-mp細(xì)胞，美白成分對(duì)黑色素生成的抑制作用。在用表4所示濃度的樣品處理細(xì)胞，并培養(yǎng)7天后，與對(duì)照組(0.5％dmso)相比，測(cè)量黑色素的量(圖4)。此外，計(jì)算美白成分的ec50(黑色素生成的50％有效抑制濃度)(表5)。然后，將cc20或cc50除以ec50，以研究細(xì)胞毒性與黑色素生成有效抑制濃度之間的相關(guān)因子(差異)(表6)。【表4】【表5】濃度rd(mm)rk(mm)mb(μm)rc(μm)ap(μm)ec501.13±0.160.97±0.096.8±2.52.7±0.60.11±0.01*ec50(黑色素合成的50％抑制濃度)【表6】倍數(shù)rdrkmbrcapcc20/ec500.80.41.3>2011.8cc50/ec502.11.42.8>20>20表6比較了第7天，細(xì)胞毒性濃度(cc50)和美白成分的黑色素合成的抑制濃度(ec50)之間的相關(guān)因子。cc20/ec50是通過將20％細(xì)胞毒性濃度除以黑色素生成的50％有效抑制濃度而獲得的值，并代表20％細(xì)胞毒性濃度和有效濃度的相關(guān)因子。cc50/ec50是通過將50％細(xì)胞毒性濃度除以黑色素生成的50％有效抑制濃度而獲得的值，并表示50％細(xì)胞毒性濃度和有效濃度的相關(guān)因子。而rd、rk和mb在1.4-2.8倍顯示50％的細(xì)胞毒性，rc和ap僅在20倍或更高時(shí)顯示50％的細(xì)胞毒性(表6)。也就是說，rd、rk和mb在有效濃度和細(xì)胞毒性濃度之間，即體外安全性幅度，顯示出非常窄小的差異，但rc和ap顯示出較寬的安全性幅度。因此，當(dāng)cc50/ec50為5倍或更高、6倍或更高、7倍或更高、8倍或更高、9倍或更高、10倍或更高、11倍或更高、12倍或更高、13倍或更高、14倍或更高、15倍或更高、16倍或更高、17倍或更高、18倍或更高、19倍或更高、或20倍或更高時(shí)，可以確認(rèn)美白成分是安全的。這種現(xiàn)象表明，對(duì)于一些樣品，抑制黑色素生成的作用可能導(dǎo)致黑色素細(xì)胞死亡。在化妝品開發(fā)中，這是應(yīng)確保的安全性中的一個(gè)重要因素。測(cè)試實(shí)施例3對(duì)于hemn-mp細(xì)胞，取決于uvb照射的、美白成分的毒性濃度(對(duì)美白成分的敏感度的增加)的比較為了研究uvb照射對(duì)美白成分的細(xì)胞毒性的影響，比較在無uvb照射的情況下用美白成分處理的組和以20mj/cm3的uvb照射，然后用美白成分處理的組的細(xì)胞毒性(圖5)。也就是說，研究通過uvb照射激發(fā)的細(xì)胞對(duì)各種美白成分的反應(yīng)。用uvb照射細(xì)胞并用樣品處理細(xì)胞后，確定細(xì)胞毒性的增加，并計(jì)算與處理前相比的細(xì)胞毒性的比率(表7)?！颈?】表7顯示在有或無uvb照射下第7天美白成分的細(xì)胞毒性的變化。與uvb未照射的細(xì)胞相比，uvb照射的細(xì)胞的毒性比率(％)是以每種美白成分的代表性濃度(3個(gè)點(diǎn))測(cè)定的。針對(duì)對(duì)照組的細(xì)胞毒性(15-20％)，校正比率。當(dāng)用uvb照射黑色素細(xì)胞，然后用美白成分處理時(shí)，rd和rk顯示出細(xì)胞毒性平均增加約20％，而rc和ap顯示出細(xì)胞毒性的微量增加小于5％。這意味著在用rd和rk處理時(shí)，uvb照射激發(fā)的黑色素細(xì)胞顯示出加劇的毒性。對(duì)于rc和ap，沒有觀察到這種現(xiàn)象，且這種現(xiàn)象被認(rèn)為是引起白斑病、具有小安全系數(shù)的美白成分的特征之一。結(jié)論，當(dāng)比率平均為15％或更低、14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低、10％或更低、9％或更低、8％或更低、或7％或更低時(shí)，可以確定美白成分是安全的?？傊?，用rd、rk和mb將黑色素細(xì)胞處理較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)和細(xì)胞暴露于uvb時(shí)，rd、rk和mb會(huì)加劇細(xì)胞毒性。這與以往長(zhǎng)期使用含杜鵑醇的化妝品的使用者，特別是在暴露于紫外線的部位上所報(bào)道的白斑病副作用的事實(shí)是一致的。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的用于預(yù)測(cè)美白成分的副作用的方法，可以預(yù)測(cè)由長(zhǎng)期使用引起的美白成分副作用，可以方便地闡明皮膚美白濃度與細(xì)胞毒性濃度之間的相關(guān)性，并且可以有效地預(yù)測(cè)由于uv照射引起的副作用的增加。當(dāng)前第1頁(yè)12