本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種miRNA-122檢測試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：microRNAs是在多種真核細(xì)胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類來源內(nèi)源性染色體上的非編碼單鏈小分子RNA，其長度為21～25nt，在進(jìn)化上具有高度的保守性，能夠通過與其目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3’untranslatedregion，3’UTR)互補(bǔ)導(dǎo)致該mRNA分子的翻譯受到抑制。miRNA參與調(diào)控真核生物超過1/3以上基因的表達(dá)、抑制靶基因的翻譯、引起mRNA的降解等，具有非常重要的生物學(xué)功能。進(jìn)一步研究表明，miRNAs在細(xì)胞增殖、分化和凋亡、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟形成、胚胎發(fā)育，生物個體死亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，這些最新的研究發(fā)現(xiàn)為我們提供了全新的疾病發(fā)生、發(fā)展調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，拓展了我們對疾病發(fā)生機(jī)制的理解和認(rèn)識。miRNAs可存在于人體的多種體液中，具有嚴(yán)格的時(shí)空性和組織特異性。循環(huán)miRNAs是正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞釋放到血清/血漿的miRNAs，與目前臨床常用的蛋白質(zhì)類、激素類標(biāo)志物相比，可更早預(yù)測和發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展?fàn)顟B(tài)。循壞miRNAs是基因表達(dá)水平的新型疾病相關(guān)特異性生物標(biāo)志物，在臨床實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域具有巨大的潛能和優(yōu)勢，無疑將極大地提高重大疾病的診斷和治療水平?？焖?、準(zhǔn)確、靈敏的miRNAs檢測技術(shù)是確保循壞miRNAs生物標(biāo)志物成功應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，檢測miRNAs的方法主要有Northern印跡分析、基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR等，但是，由于上述方法都需要預(yù)先對樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，才能完成檢測，這樣既大為增加了檢測復(fù)雜性和檢測時(shí)間，又一定程度上干擾了miRNAs的定量檢測，同時(shí)預(yù)擴(kuò)增存在的實(shí)驗(yàn)室污染問題也極大地影響了這些檢測方法的準(zhǔn)確性，使得這些方法的臨床實(shí)際應(yīng)用受到了極大的限制。肝損傷是所有肝臟疾病共有的病理狀態(tài)，存在于肝病的整個發(fā)生和進(jìn)展期，嚴(yán)重危害人類健康。臨床常常通過肝功能生化指標(biāo)檢查，例如檢測血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素等了解肝臟是否發(fā)生病變，以及肝臟的受損程度等信息。但由于這些常規(guī)肝功指標(biāo)的特異性不高，容易受其它因素例如骨骼肌損傷、肌炎和劇烈運(yùn)動等等的影響，目前亟需一種更加特異和靈敏反應(yīng)肝損傷的檢測標(biāo)志物。MicroRNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種長約19-23個核苷酸的非編碼小RNA分子，其對細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡至關(guān)重要，調(diào)控并影響了整個生命活動的過程。目前大量研究已證實(shí)，miRNA-122幾乎只表達(dá)于人體肝臟中，并且表達(dá)豐度很高。由于肝損傷過程中會發(fā)生肝細(xì)胞的凋亡或裂解，細(xì)胞內(nèi)的miRNA-122便會釋放到人體外周血中，并且miRNA分子在血液中較為穩(wěn)定，相對不易降解，因此通過檢測血液中的miRNA-122分子含量，可有效評估肝損傷的程度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種miRNA-122檢測試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種miRNA-122檢測試劑盒，它包括反轉(zhuǎn)錄引物、檢測引物、質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，其中，所述反轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具體為：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACC-3’；所述檢測引物的上游引物序列如SEQIDNO.2所示，具體為：5’-GAGGCTGGAGTGTGACAATGG-3’，檢測引物的下游引物序列如SEQIDNO.3所示，具體為：5’-TATCCTACGCAGGGTCCGAG-3’；所述質(zhì)控品包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品為合成的線蟲來源的cel-miRNA-39，陽性質(zhì)控品為合成的人源的miRNA-122；所述標(biāo)準(zhǔn)品的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具體為：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACCATTGTCACACTCCA-3’。進(jìn)一步地，所述陰性質(zhì)控品的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具體為：5’-ucaccggguguaaaucagcuug-3’。進(jìn)一步地，所述陽性質(zhì)控品的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具體為：5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。進(jìn)一步地，所述檢測試劑盒由反轉(zhuǎn)錄緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、PCR緩沖液、超純水、質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品組成；其中，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液由dNTPs、RTBuffer、RNaseinhibitor、反轉(zhuǎn)錄引物和超純水組成；所述PCR緩沖液由PCRBuffer、檢測引物和超純水組成；所述標(biāo)準(zhǔn)品包括5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品S1、標(biāo)準(zhǔn)品S2、標(biāo)準(zhǔn)品S3、標(biāo)準(zhǔn)品S4和標(biāo)準(zhǔn)品S5，其濃度分別為106copies/ul、105copies/ul、104copies/ul、103copies/ul和102copies/ul。上述的試劑盒用于檢測miRNA-122。進(jìn)一步地，所述的試劑盒用于檢測肝損傷中的miRNA-122。上述試劑盒基于熒光定量PCR平臺，檢測樣本類型包括血漿或血清。本發(fā)明試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的使用方法為：本試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)品S1、S2、S3、S4和S5線性范圍為102～106copies/ul，用于熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于精確計(jì)算待測樣本中miRNA-122的濃度(copies/ul)。注意將原樣本反應(yīng)體系中的反轉(zhuǎn)錄樣品3ul替換為本標(biāo)準(zhǔn)品3ul，反應(yīng)條件與原樣本一致。檢測結(jié)果計(jì)算：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取待測樣本的miRNA-122濃度后，根據(jù)提取的樣本體積，總RNA總RNA(包含總microRNA)的溶解體積，反轉(zhuǎn)錄上樣體積和熒光定量上樣體積計(jì)算出原血漿或血清樣本中的miRNA-122濃度。例如：提取體積為Aul的血漿樣本，得到體積為Bul的總RNA，取其中2ul用于反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR上樣3ul進(jìn)行檢測，讀取的miRNA-122濃度為Ccopies/ul，則受試者血漿中miRNA-122的濃度(Xcopies/ul)按以下公式進(jìn)行計(jì)算：X(copies/ul)＝C×20×15/3×B/2×1/A＝50BC/A上述陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的使用方法為：在提取待測血漿或血清樣本總RNA(包括總microRNA)的同時(shí)，也用相同的試劑盒和方法提取陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。1.陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果應(yīng)滿足：105～2×105copies/ul，否則實(shí)驗(yàn)無效。2.陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果應(yīng)為0copies/ul，否則實(shí)驗(yàn)無效。本發(fā)明試劑盒檢測結(jié)果的解釋方法為：1.miRNA-122濃度的檢測結(jié)果小于或等于3×104copies/ul時(shí)，可直接報(bào)告結(jié)果為陰性。2.miRNA-122濃度的檢測結(jié)果在3×104～6×104copies/ul范圍內(nèi)時(shí)，可直接報(bào)告結(jié)果為陽性，并建議對此份標(biāo)本謹(jǐn)慎跟蹤。3.miRNA-122濃度的檢測結(jié)果大于等于6×104copies/ul時(shí)，可直接報(bào)告結(jié)果為陽性。4.陰性結(jié)果表示肝臟正常無損傷，陽性結(jié)果表示存在肝損傷。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.本發(fā)明試劑盒提供的反轉(zhuǎn)錄緩沖液和PCR緩沖液不但在組分上進(jìn)行了優(yōu)化有利于長期穩(wěn)定保存，同時(shí)可將加樣工作量簡化至最小，以減少加樣時(shí)可能出現(xiàn)的失誤或誤差，有利于得到穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果；2.本發(fā)明試劑盒提供了一種新的檢測肝損傷的方法，選擇的檢測靶點(diǎn)miRNA-122僅表達(dá)于肝臟，因此特異性優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)；3.本發(fā)明試劑盒選擇用患者血清、血漿或全血為樣本，保存方便，并且由于血細(xì)胞中不含miRNA-122，由采樣或保存手法所導(dǎo)致的樣本溶血或白細(xì)胞破裂等不會影響檢測的結(jié)果，因此檢測不但非侵入性，減少病人痛苦，且準(zhǔn)確性不低于現(xiàn)有技術(shù)；4.本發(fā)明試劑盒基于熒光定量PCR平臺，因此檢驗(yàn)靈敏度高。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。實(shí)施例1：miRNA-122檢測試劑盒所述檢測試劑盒由9ul反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1ul反轉(zhuǎn)錄酶、17ul的PCR緩沖液、20ul超純水、200ul陽性質(zhì)控品、200ul陰性質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品組成；其中，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液由100mMdNTPs(withdTTP)0.15ul、10×RTBuffer1.5ul、10mg/mlRNaseinhibitor0.2ul、10uM反轉(zhuǎn)錄引物1ul和超純水組成6.15ul；所述反轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具體為：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACC-3’；所述反轉(zhuǎn)錄酶為分裝自ABI公司的MultiScribeTMReverseTranscriptase，50U/μL。所述PCR緩沖液由2×PCRBuffer10ul(分裝自Roche公司的FastStartEssentialDNAGreenMaster)、10uM檢測上引物0.5ul、10uM檢測下引物0.5ul和超純水6ul組成；所述檢測引物的上游引物序列如SEQIDNO.2所示，具體為：5’-GAGGCTGGAGTGTGACAATGG-3’，檢測引物的下游引物序列如SEQIDNO.3所示，具體為：5’-TATCCTACGCAGGGTCCGAG-3’；所述標(biāo)準(zhǔn)品包括5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品S13ul、標(biāo)準(zhǔn)品S23ul、標(biāo)準(zhǔn)品S33ul、標(biāo)準(zhǔn)品S43ul和標(biāo)準(zhǔn)品S53ul，其濃度分別為106copies/ul、105copies/ul、104copies/ul、103copies/ul和102copies/ul。所述質(zhì)控品包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品為合成的線蟲來源的cel-miRNA-39，陽性質(zhì)控品為合成的人源的miRNA-122；所述標(biāo)準(zhǔn)品的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具體為：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACCATTGTCACACTCCA-3’。所述陰性質(zhì)控品的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具體為：5’-ucaccggguguaaaucagcuug-3’。所述陽性質(zhì)控品的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具體為：5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。實(shí)施例2：檢測肝移植術(shù)后病人血漿中的miRNA-122的表達(dá)水平1、樣本采集及處理使用普通EDTA采血管采集健康人和肝移植受者血液5ml，分別共10份。將血液轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管中，4℃2000g離心10min，吸取上層血漿至一新的15ml離心管中。再將血漿4℃4000g離心20min，吸取上層血漿至一新的15ml離心管中。吸取200ul并使用QIAGEN的miRNeasySerum/PlasmaKit按照操作說明書進(jìn)行總RNA(包括總microRNA)的提取，同時(shí)也進(jìn)行等體積陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品總RNA的提取，得到最終待測總RNA體積為40ul。2、實(shí)驗(yàn)檢測將待測樣本、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品提取后的總RNA(包括總microRNA)按下述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，miRNA-122反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如表1所示，miRNA-122反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如表2所示，將反轉(zhuǎn)錄后的待測樣本、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品S1-S4的反應(yīng)體系按照上述說明在96孔板中進(jìn)行配置混勻，板式離心機(jī)短暫離心5s后，置于Bio-radCFXconnect熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件按照下述說明進(jìn)行，miRNA-122熒光定量PCR檢測反應(yīng)體系如表3所示，miRNA-122熒光定量PCR檢測反應(yīng)條件如表4所示，在每個循環(huán)第二步即，60℃1min收集熒光信號。每管反應(yīng)做5個副孔。表1：miRNA-122反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系成分體積反轉(zhuǎn)錄緩沖液9ul反轉(zhuǎn)錄酶1ulRNA樣品(5～50ng)2ul超純水3ul共計(jì)15ul表2：miRNA-122反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件表3：miRNA-122熒光定量PCR檢測反應(yīng)體系成分體積PCR緩沖液17ul反轉(zhuǎn)錄樣品3ul共計(jì)20ul表4：miRNA-122熒光定量PCR檢測反應(yīng)條件3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測結(jié)果經(jīng)副孔計(jì)算取平均值后，見表5(結(jié)果取小數(shù)點(diǎn)后1位)表5.熒光定量PCR儀檢測miRNA-122結(jié)果樣本類型檢測結(jié)果(copies/ul)健康人1852.4肝移植受者11231.6陽性質(zhì)控品16224.2陰性質(zhì)控品0經(jīng)計(jì)算，陽性質(zhì)控品的濃度為(16224.2×50×40)/200＝1.62242×105copies/ul，陰性質(zhì)控品的濃度為0copies/ul，符合試劑盒說明，因此本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。經(jīng)計(jì)算，健康人的miRNA-122濃度為(1852.4×50×40)/200＝1.8524×104copies/ul，小于3×104copies/ul，因此排定為陰性。肝移植受者的miRNA-122濃度為(11231.6×50×40)/200＝1.12316×105copies/ul，大于6×104copies/ul，因此判定為陽性。SEQUENCELISTING<110>成都仕康美生物科技有限公司<120>一種miRNA-122檢測試劑盒及應(yīng)用<130>2016<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>1cgactatcctacgcagggtccgaggtattcgcgtaggatagtcgcaaacacc52<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2gaggctggagtgtgacaatgg21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3tatcctacgcagggtccgag20<210>4<211>66<212>DNA<213>人工序列<400>4cgactatcctacgcagggtccgaggtattcgcgtaggatagtcgcaaacaccattgtcac60actcca66<210>5<211>22<212>RNA<213>人工合成<400>5ucaccggguguaaaucagcuug22<210>6<211>22<212>RNA<213>人工合成<400>6uggagugugacaaugguguuug22當(dāng)前第1頁1 2 3