本發(fā)明克隆表達了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質(zhì)和應用，屬于工業(yè)微生物領域。

背景技術：

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)

目前為止，已經(jīng)在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發(fā)現(xiàn)了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)

本發(fā)明首次從斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應相比逆反應極微弱，可應用于光學純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究。

本發(fā)明的技術方案如下：

1、菌株

本發(fā)明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Providencia stuartii ATCC 49809，購自美國ATCC菌種庫。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Providencia stuartii ATCC 49809菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構建重組質(zhì)粒。

3、D-乳酸氧化酶表達與純化

將重組質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、D-乳酸氧化酶的酶學性質(zhì)分析

以D-乳酸為底物研究pH對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

以D-乳酸為底物研究溫度對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。

酶活測定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉化16h，轉化后液相色譜分析上清液。(R)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應的α-酮酸酯，(S)-α-羥酸酯不被氧化。

產(chǎn)物(S)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：

對映體過量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R為反應后(R)-對映體的峰面積，S_S為反應后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S₀為反應前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。

產(chǎn)物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發(fā)表明的有益之處：從Providencia stuartii ATCC 49809中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶可以氧化(R)-α-羥酸和(R)-α-羥酸酯，可用于規(guī)?；苽涫中约?S)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應用價值。

具體實施方式

實施例1

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構建。

1、Providencia stuartii ATCC 49809DNA的提取

將Providencia stuartii ATCC 49809菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉移到50mL預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設計

設計引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAATGCAGTAAACAGCCCTGAAA3'

引物2：5'GCCGTCTAGATTAGTGATCGTGATGGCAACCACAA 3'

(2)PCR擴增

用以上合成的兩條引物，以Providencia stuartii ATCC 49809的基因組DNA為模板進行PCR擴增。

本步驟中擴增體系為：

擴增程序為：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應30個循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的誘導表達及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設置system flow 20ml/min流速，進行排氣。然后設置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進結合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實施例3

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適溫度。以D-乳酸為底物，將底物與pH為6.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定D-乳酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應溫度為45℃。

實施例4

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適pH值。以D-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，45℃水浴15min測定酶的酶活，結果發(fā)現(xiàn)在pH 6.0條件下D-乳酸氧化酶酶活最高。

實施例5

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶與不同底物的反應特性，列于表2中。

表2D-乳酸氧化酶對不同底物的活性

實施例6

根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當在反應時間充分時，可以得到各類高光學純的(S)-α-羥酸酯，該酶的光學專一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種氧化酶及其應用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1734

<212> DNA

<213> Providencia stuartii ATCC49809

<400> 1

atgaatgcag taaacagccc tgaaaatcaa cgattattac tgacactcac caatattgtt 60

ggtaaaaaaa atatcctgac taagcctcat aaaaccgaac gttaccgcaa agggtttcgc 120

tcaggtattg gtaatgctat agcggtcgtc ttccctacca cgttgttaga gcaatggtat 180

gtttttaaag cctgtgtcga ggcggataaa atagtgatta tgcaagccgc gaacacaggg 240

ctgacagaag gttcgacgcc aagcggttat gattatgatc gtgatatcgt tattattagc 300

acattaaaat taaatcaaat tcaagtatta cctgaattta atcaagttgt tgctatgcca 360

ggcagtacgc tgtatgacct cgagaaatta ctaaaaccat taggtcgtga accgcattcc 420

ctcattggct cctcttgcat cggggcgtca gtggttggcg ggatctgtaa tagttcaggt 480

ggctccctag tgcgccgagg cccggcttat acggagctag ccttatatgg gcgagtaaat 540

gaagatggaa aagtggagtt agtaaaccac ctagggatta acttagggga tacacctgaa 600

gaaattttaa cgaacttgca aaatcgacgt tatcgaacag aagatgttga acacagtgaa 660

aagctggcgt cagaccatga atatgctcag cgagttcgtg atgtgaatgc ggatacacca 720

tcacgcttta acgcagatga gcgccgcttg tttgaagcat ctggttgtgc gggtaaatta 780

gccgtatttg ctgtccgcct tgatactttc cctgccgata cctcaacaca agtgttttat 840

attggcacaa acaatccgga tgttctggaa gacattcgcc gtcatattct tagtgaattt 900

aaaaacttac cagtagcagg tgagtatatg caccgcggtt gttttgatat cgctgaagta 960

tacggaaaag ataccttttt aatgatagat aaatttggca ctgacaaaat gccactattt 1020

tttactatca aaggccgtat tgatgccgta ttaaataaag taccgttgtt accgtcaaac 1080

cttgttgacc gcactatgca gctactcagt aaattatggc ctgcacattt acctccacgc 1140

atgaagcaat ttcgtgataa gtatgagcat catctgatgt taaaaatggc gggtgaaggt 1200

attgatgagg cgaaagtttg gctgaaatcc ttctttgcaa cggcggatgg ggggtatttt 1260

gagtgtacac cagaggaagg ggcaaaagca tttttacacc gctttgccgc agcgggatcg 1320

gcggttcgtt accatgcggt acacaataaa gatgttgagg atgtattgcc gctggatatc 1380

gctttgcgtc gaaatgatcg tgattggttt gaaaaattgc cgccagaaat tgaaaaattg 1440

ttagttcata aactgtattg tgggcatttt atgtgtcatg tgatgcacca agattatgta 1500

ttgaaaaaag gcgtcgatcc aaaagaattg aaagagaaaa tgttagcgct gttagatgaa 1560

cgaggtgcac aataccccgc agagcataac gtaggccact tatataaagc tcagccacag 1620

ctaaaatctt tctataaaaa agccgatccg actaacacca tgaaccccgg tttaggcaaa 1680

acaacgaaac gtaaaaattg ggaaggggat tgtggttgcc atcacgatca ctaa 1734

<210> 2

<211> 577

<212> PRT

<213> Providencia stuartii ATCC49809

<400> 2

Met Asn Ala Val Asn Ser Pro Glu Asn Gln Arg Leu Leu Leu Thr Leu

1 5 10 15

Thr Asn Ile Val Gly Lys Lys Asn Ile Leu Thr Lys Pro His Lys Thr

20 25 30

Glu Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Ile Gly Asn Ala Ile Ala

35 40 45

Val Val Phe Pro Thr Thr Leu Leu Glu Gln Trp Tyr Val Phe Lys Ala

50 55 60

Cys Val Glu Ala Asp Lys Ile Val Ile Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly

65 70 75 80

Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Ser Gly Tyr Asp Tyr Asp Arg Asp Ile

85 90 95

Val Ile Ile Ser Thr Leu Lys Leu Asn Gln Ile Gln Val Leu Pro Glu

100 105 110

Phe Asn Gln Val Val Ala Met Pro Gly Ser Thr Leu Tyr Asp Leu Glu

115 120 125

Lys Leu Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Leu Ile Gly Ser

130 135 140

Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Val Gly Gly Ile Cys Asn Ser Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Val Arg Arg Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Leu Ala Leu Tyr

165 170 175

Gly Arg Val Asn Glu Asp Gly Lys Val Glu Leu Val Asn His Leu Gly

180 185 190

Ile Asn Leu Gly Asp Thr Pro Glu Glu Ile Leu Thr Asn Leu Gln Asn

195 200 205

Arg Arg Tyr Arg Thr Glu Asp Val Glu His Ser Glu Lys Leu Ala Ser

210 215 220

Asp His Glu Tyr Ala Gln Arg Val Arg Asp Val Asn Ala Asp Thr Pro

225 230 235 240

Ser Arg Phe Asn Ala Asp Glu Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ser Gly Cys

245 250 255

Ala Gly Lys Leu Ala Val Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Ala

260 265 270

Asp Thr Ser Thr Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asn Pro Asp Val

275 280 285

Leu Glu Asp Ile Arg Arg His Ile Leu Ser Glu Phe Lys Asn Leu Pro

290 295 300

Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg Gly Cys Phe Asp Ile Ala Glu Val

305 310 315 320

Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Met Ile Asp Lys Phe Gly Thr Asp Lys

325 330 335

Met Pro Leu Phe Phe Thr Ile Lys Gly Arg Ile Asp Ala Val Leu Asn

340 345 350

Lys Val Pro Leu Leu Pro Ser Asn Leu Val Asp Arg Thr Met Gln Leu

355 360 365

Leu Ser Lys Leu Trp Pro Ala His Leu Pro Pro Arg Met Lys Gln Phe

370 375 380

Arg Asp Lys Tyr Glu His His Leu Met Leu Lys Met Ala Gly Glu Gly

385 390 395 400

Ile Asp Glu Ala Lys Val Trp Leu Lys Ser Phe Phe Ala Thr Ala Asp

405 410 415

Gly Gly Tyr Phe Glu Cys Thr Pro Glu Glu Gly Ala Lys Ala Phe Leu

420 425 430

His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ser Ala Val Arg Tyr His Ala Val His

435 440 445

Asn Lys Asp Val Glu Asp Val Leu Pro Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg

450 455 460

Asn Asp Arg Asp Trp Phe Glu Lys Leu Pro Pro Glu Ile Glu Lys Leu

465 470 475 480

Leu Val His Lys Leu Tyr Cys Gly His Phe Met Cys His Val Met His

485 490 495

Gln Asp Tyr Val Leu Lys Lys Gly Val Asp Pro Lys Glu Leu Lys Glu

500 505 510

Lys Met Leu Ala Leu Leu Asp Glu Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Ala Glu

515 520 525

His Asn Val Gly His Leu Tyr Lys Ala Gln Pro Gln Leu Lys Ser Phe

530 535 540

Tyr Lys Lys Ala Asp Pro Thr Asn Thr Met Asn Pro Gly Leu Gly Lys

545 550 555 560

Thr Thr Lys Arg Lys Asn Trp Glu Gly Asp Cys Gly Cys His His Asp

565 570 575

His