本發(fā)明克隆表達了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質(zhì)和應用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)

目前為止，已經(jīng)在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發(fā)現(xiàn)了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)

本發(fā)明首次從柯氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri)中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應相比逆反應極微弱，可應用于光學純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從柯氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關(guān)的酶學特性，并進行了應用研究。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Citrobacter koseri ATCC BAA-895，購自美國ATCC菌種庫。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Citrobacter koseri ATCC BAA-895菌體基因組總DNA。設(shè)計特異性引物，應用PCR方法，擴增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、D-乳酸氧化酶表達與純化

將重組質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、D-乳酸氧化酶的酶學性質(zhì)分析

以D-乳酸為底物研究pH對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

以D-乳酸為底物研究溫度對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。

酶活測定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉(zhuǎn)化16h，轉(zhuǎn)化后液相色譜分析上清液。(R)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應的α-酮酸酯，(S)-α-羥酸酯不被氧化。

產(chǎn)物(S)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：

對映體過量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R為反應后(R)-對映體的峰面積，S_S為反應后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S₀為反應前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。

產(chǎn)物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發(fā)表明的有益之處：從Citrobacter koseri ATCC BAA-895中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶可以氧化(R)-α-羥酸和(R)-α-羥酸酯，可用于規(guī)?；苽涫中约?S)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應用價值。

具體實施方式

實施例1

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。

1、Citrobacter koseri ATCC BAA-895 DNA的提取

將Citrobacter koseri ATCC BAA-895菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設(shè)計

設(shè)計引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAGAAAGCGTATTGTCATACAAA 3'

引物2：5'GCCGTCTAGATCGTCGGACGCCGCT 3'

(2)PCR擴增

用以上合成的兩條引物，以Citrobacter koseri ATCC BAA-895的基因組DNA為模板進行PCR擴增。

本步驟中擴增體系為：

擴增程序為：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應30個循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉(zhuǎn)化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的誘導表達及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進結(jié)合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實施例3

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適溫度。以D-乳酸為底物，將底物與pH為9.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定D-乳酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應溫度為40℃。

實施例4

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適pH值。以D-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，40℃水浴15min測定酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 9.0條件下D-乳酸氧化酶酶活最高。

實施例5

本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶與不同底物的反應特性，列于表2中。

表2 D-乳酸氧化酶對不同底物的活性

實施例6

根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結(jié)果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當在反應時間充分時，可以得到各類高光學純的(S)-α-羥酸酯，該酶的光學專一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種氧化酶及其應用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1803

<212> DNA

<213> Citrobacter koseri ATCC BAA-895

<400> 1

atgagaaagc gtattgtcat acaaagcgct atgcttagtt ccgatagttt gtcccaccac 60

aaggagtgga gaatgtcttc cattacaacg acagataata aagcctttct taatgagctc 120

acccgtctgg tgggtcattc gcacctgctc accgatcctg caaaaaccgc ccgctaccgc 180

aaggggttcc gttccggtca gggcgaagcg ctggccgtgg tcttccccgg ctcgctgctg 240

gaattgtggc gcgtactgaa cgcctgcgta aacgccgata aaatcattct gatgcaggcc 300

gccaataccg gcctgactga aggttccacg ccgaacggca acgattacga tcgcgaaatt 360

gtcatcatca gcacgctacg cctcgacaag ctgcacgtcc tcagtaaagg cgaacaggtg 420

ctggcatacc caggcaccac gctgtactca ctggaaaaag cgcttaaacc ttttggtcgc 480

gaaccgcact cggttatcgg ttcctcctgt atcggcgcgt cagttattgg cggcatttgc 540

aataactccg gcgggtcgct ggtacaacgc ggcccggcgt ataccgaaat gtcgctgttc 600

gcgcgcattg atgaacaggg caaattacag ctggtgaacc atctgggcat cgaactgggc 660

cagaccccgg aacagatcct cagcacactc gatgatgaac gcatcaaaga tgaagatgtg 720

cgccacgatg gccgccacgc ccacgattac gattacgtga ctcgcgtcag ggacattgag 780

gccgataccc ctgcccgcta taacgctgac ccggatcgcc tgttcgaatc ctccggctgc 840

gcgggtaagc tggcggtgtt cgccgtgcgg ctggacactt tcgaggcgga aaaaaaccag 900

caggtctttt acatcggcac caatcagccc gacgtgctga ccgagattcg tcgtcatatc 960

ctggcgaagt tcgacaacct gccggttgcc ggtgaatata tgcaccgcga tatttacgac 1020

atcgcggaga aatatggcaa agatacgttc ctgatgatcg acaagctcgg caccgacaaa 1080

atgccgttct tctttacgct caaaggccgt accgacgcga tgctggaaaa ggtaaaaatc 1140

ttccgcccgc atttcactga ccgcgcgatg cagaagttcg gccatttatt ccctaaccat 1200

ctgccgccgc gcatgaaaag ctggcgcgac aaatatgagc atcatctgct gttaaaaatg 1260

gcgggagacg gggtggcgga agcacaaagc tggctgaccg agtttttcaa aaccgccgag 1320

ggcgatttct ttgcctgtac cccggaggaa ggcagcaaag cgttcctgca ccgttttgcc 1380

gcggcaggcg cggcgatccg ttatcaggcg gtgcatgccg atgaggtgga ggatattctc 1440

gcactggata tcgccttacg gcgtaacgac accgaatggt atgagcatct gccgccggaa 1500

attgacagcc agctggtgca taaactctat tacggtcatt tcatgtgcta tgtcttccat 1560

caggattaca tcgtgaagaa aggcgtcgat gcccatgcgc tgaaagagca aatgctggaa 1620

ctgctgcgcc agcgcggcgc gcaatatccg gcagagcata acgttggtca tttgtacaaa 1680

gcgccggaga cgctggcgcg tttttatcgt gaaaatgacc ccaccaacag catgaatccg 1740

ggtattggta aaacaagtaa gctgaaattc tggaaagaag cggcgtccga cgagacgcat 1800

tga 1803

<210> 2

<211> 600

<212> PRT

<213> Citrobacter koseri ATCC BAA-895

<400> 2

Met Arg Lys Arg Ile Val Ile Gln Ser Ala Met Leu Ser Ser Asp Ser

1 5 10 15

Leu Ser His His Lys Glu Trp Arg Met Ser Ser Ile Thr Thr Thr Asp

20 25 30

Asn Lys Ala Phe Leu Asn Glu Leu Thr Arg Leu Val Gly His Ser His

35 40 45

Leu Leu Thr Asp Pro Ala Lys Thr Ala Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg

50 55 60

Ser Gly Gln Gly Glu Ala Leu Ala Val Val Phe Pro Gly Ser Leu Leu

65 70 75 80

Glu Leu Trp Arg Val Leu Asn Ala Cys Val Asn Ala Asp Lys Ile Ile

85 90 95

Leu Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Asn

100 105 110

Gly Asn Asp Tyr Asp Arg Glu Ile Val Ile Ile Ser Thr Leu Arg Leu

115 120 125

Asp Lys Leu His Val Leu Ser Lys Gly Glu Gln Val Leu Ala Tyr Pro

130 135 140

Gly Thr Thr Leu Tyr Ser Leu Glu Lys Ala Leu Lys Pro Phe Gly Arg

145 150 155 160

Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Ile

165 170 175

Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser Leu Val Gln Arg Gly Pro

180 185 190

Ala Tyr Thr Glu Met Ser Leu Phe Ala Arg Ile Asp Glu Gln Gly Lys

195 200 205

Leu Gln Leu Val Asn His Leu Gly Ile Glu Leu Gly Gln Thr Pro Glu

210 215 220

Gln Ile Leu Ser Thr Leu Asp Asp Glu Arg Ile Lys Asp Glu Asp Val

225 230 235 240

Arg His Asp Gly Arg His Ala His Asp Tyr Asp Tyr Val Thr Arg Val

245 250 255

Arg Asp Ile Glu Ala Asp Thr Pro Ala Arg Tyr Asn Ala Asp Pro Asp

260 265 270

Arg Leu Phe Glu Ser Ser Gly Cys Ala Gly Lys Leu Ala Val Phe Ala

275 280 285

Val Arg Leu Asp Thr Phe Glu Ala Glu Lys Asn Gln Gln Val Phe Tyr

290 295 300

Ile Gly Thr Asn Gln Pro Asp Val Leu Thr Glu Ile Arg Arg His Ile

305 310 315 320

Leu Ala Lys Phe Asp Asn Leu Pro Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg

325 330 335

Asp Ile Tyr Asp Ile Ala Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Met

340 345 350

Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys Met Pro Phe Phe Phe Thr Leu Lys

355 360 365

Gly Arg Thr Asp Ala Met Leu Glu Lys Val Lys Ile Phe Arg Pro His

370 375 380

Phe Thr Asp Arg Ala Met Gln Lys Phe Gly His Leu Phe Pro Asn His

385 390 395 400

Leu Pro Pro Arg Met Lys Ser Trp Arg Asp Lys Tyr Glu His His Leu

405 410 415

Leu Leu Lys Met Ala Gly Asp Gly Val Ala Glu Ala Gln Ser Trp Leu

420 425 430

Thr Glu Phe Phe Lys Thr Ala Glu Gly Asp Phe Phe Ala Cys Thr Pro

435 440 445

Glu Glu Gly Ser Lys Ala Phe Leu His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ala

450 455 460

Ala Ile Arg Tyr Gln Ala Val His Ala Asp Glu Val Glu Asp Ile Leu

465 470 475 480

Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg Asn Asp Thr Glu Trp Tyr Glu His

485 490 495

Leu Pro Pro Glu Ile Asp Ser Gln Leu Val His Lys Leu Tyr Tyr Gly

500 505 510

His Phe Met Cys Tyr Val Phe His Gln Asp Tyr Ile Val Lys Lys Gly

515 520 525

Val Asp Ala His Ala Leu Lys Glu Gln Met Leu Glu Leu Leu Arg Gln

530 535 540

Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Ala Glu His Asn Val Gly His Leu Tyr Lys

545 550 555 560

Ala Pro Glu Thr Leu Ala Arg Phe Tyr Arg Glu Asn Asp Pro Thr Asn

565 570 575

Ser Met Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser Lys Leu Lys Phe Trp Lys

580 585 590

Glu Ala Ala Ser Asp Glu Thr His

595 600