本發(fā)明涉及一種發(fā)酵洋蔥皮功能性產(chǎn)品及其制備方法，特別涉及一種減肥功能產(chǎn)品等。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展、生活水平的提高、工作方式的轉(zhuǎn)變，人們過上了更加安逸、靜態(tài)的生活，轎車、電梯取代了人們少有的消耗能量的方式，繁密的工作把人們牢牢地鎖在電腦旁，勞累一天回到家就會躺在沙發(fā)上看電視，因此，做運動和鍛煉身體的時間微乎其微。與此同時，快節(jié)奏生活下的飲食既缺乏營養(yǎng)也不健康，人們往往在加班到很晚以后還吃夜宵，日常生活中經(jīng)常無節(jié)制地食用高熱量食品，人際場合上過量飲酒，類似不良的飲食方式在快速發(fā)展的今天已是司空見慣。人們卻不知在享受的背后，無數(shù)隱藏的疾病在伺機而來，其中肥胖癥也在慢慢靠近。尤其，兒童期單純性肥胖(以下簡稱兒童肥胖)是指排除機體各器官自身患有的疾病，因長時間能量吸收過多、消耗較少而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪蓄積的一種營養(yǎng)失衡性疾病。WHO報道，兒童肥胖檢出率近年來在全球呈明顯上升趨勢。目前在全球范圍內(nèi)，5歲以下的兒童大約有4千萬超重或者肥胖，學(xué)齡兒童體重超標(biāo)的有1.55億。我國兒童肥胖的患病率同樣不容樂觀，在楊淑香等人2012年對城區(qū)兒童健康水平的抽樣調(diào)查中顯示，山東濰坊男、女兒童的肥胖率分別為9.9％和4.6％；王欽以3～6歲在園兒童為目標(biāo)對象調(diào)查了義烏市的肥胖癥現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)該年齡段兒童肥胖檢出率為0.89％，男孩為0.53％，女孩為0.36％，并且兒童的肥胖癥檢出率逐年上升趨勢。眾所周知，洋蔥中含有豐富的生物活性物質(zhì)，這些成分具有顯著的抑菌、降血脂、降血糖、抗血栓、抗腫瘤和抗氧化等保健功效。關(guān)于洋蔥的多種保健功能及有效成分提取的研究，前人已經(jīng)有了一定的研究基礎(chǔ)。目前，關(guān)于洋蔥可食部分黃酮的研究較多，而加工生產(chǎn)中的廢棄物—洋蔥皮卻沒有得到很好的利用。大量研究證明洋蔥黃酮含量從外鱗莖到內(nèi)鱗莖是依次遞減的，洋蔥外表皮中的黃酮類物質(zhì)的含量顯著高于可食部分。但事實上，洋蔥皮并沒有受到人們的重視，也沒有得到充分的加工利用，大部分洋蔥皮被丟棄，是對資源的極大浪費。如果能夠?qū)⒀笫[皮中富含的黃酮利用起來，不但可以解決加工生產(chǎn)所帶來的污染，又可以研究開發(fā)洋蔥皮深加工產(chǎn)品，這不僅可以促進洋蔥加工業(yè)的快速發(fā)展，對生活、對社會也具有深遠(yuǎn)的意義。從消費者角度講，慢性疾病的發(fā)病率日益增加，功能保健食品的開發(fā)為人們的健康做出了重要保障；依經(jīng)濟角度看，提取洋蔥皮中的黃酮類物質(zhì)，是將洋蔥皮變廢為寶的有效途徑，是科技轉(zhuǎn)化生產(chǎn)力的具體體現(xiàn)；從農(nóng)民的角度來說，功能產(chǎn)品的研究開發(fā)，提高了洋蔥皮的綜合利用，提高了洋蔥產(chǎn)業(yè)的整體效益，增加了農(nóng)民的經(jīng)濟收入。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種洋蔥皮中黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，包括洋蔥皮的發(fā)酵步驟和洋蔥皮中黃酮類化合物的提取步驟。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述發(fā)酵步驟中，采用朝鮮族大醬中篩選出來的產(chǎn)纖維素酶酵母菌和產(chǎn)纖維素酶乳酸菌(cy2-2/cy2-4)。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述洋蔥皮中黃酮類化合物的提取步驟中，還包括乙醇提取步驟。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，洋蔥皮與乙醇的固液比選自1:20～1:40。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，乙醇濃度選自40％～60％的范圍。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，提取溫度選自80℃～90℃的范圍。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，提取時間選自1～2小時的范圍。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，還包括精制步驟。本發(fā)明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述精制步驟為大孔樹脂處理步驟。本發(fā)明還提供一種減肥保健產(chǎn)品，其包含所述洋蔥皮中提出黃酮類化合物。本發(fā)明所述的減肥保健產(chǎn)品，其適用于兒童、成人、老人。通過本發(fā)明，1.洋蔥皮中黃酮類化合物蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量分別為0.2785mg/g、70.85mg/g、0.7mg/g，槲皮素是洋蔥皮中主要的黃酮類物質(zhì)；2.OPE能夠減輕小鼠因攝食高脂飼料導(dǎo)致的營養(yǎng)性肥胖，對攝食量沒有顯著影響，說明OPE不是通過降低食欲達(dá)到減肥的作用，小鼠糞便形態(tài)正常，不會引起腹瀉；3.OPE能夠有效改善小鼠的血脂水平，加快體內(nèi)脂質(zhì)的代謝，并提高機體的抗氧化能力，降低患動脈粥樣硬化的風(fēng)險；4.OPE能有效抑制脂肪細(xì)胞的膨大，減小脂肪細(xì)胞體積，并可清除脂肪在肝臟上的沉積，加快脂肪細(xì)胞的動員與代謝，預(yù)防脂肪肝的發(fā)生；5.OPE降脂減肥的作用與劑量有關(guān)，存在劑量效應(yīng)，中、高劑量效果最為明顯，沒有顯著性差異，而低劑量的效果不很明顯，說明一定劑量的OPE具有預(yù)防肥胖的作用。除此之外，通過本發(fā)明提取得到的黃酮類化合物，具有優(yōu)異的抗氧化效果，可以期待更多功能性產(chǎn)品的開發(fā)。附圖說明圖1示出本發(fā)明的洋蔥皮中黃酮類化合物的提取方法的示意圖；圖2示出產(chǎn)纖維素酶酵母菌生長曲線；圖3示出周期內(nèi)小鼠體重變化趨勢；圖4示出OPE對小鼠脂肪系數(shù)、攝食量、食物利用率的影響；圖5示出OPE對小鼠臟器指數(shù)的影響；圖6示出小鼠血清中TC含量；圖7示出小鼠血清中TG含量；圖8示出小鼠血清中HDL-C水平；圖9示出小鼠血清中LDL-C水平；圖10示出小鼠血清中FFA含量；圖11示出小鼠肝勻漿中GSH-Px的活力；圖12示出小鼠肝勻漿中MDA含量；圖13示出小鼠肝勻漿中T-SOD活力；圖14示出小鼠肝勻漿中T-AOC活力；圖15示出小鼠肝臟對比圖；圖16示出小鼠肝組織細(xì)胞HE染色(400倍)；圖17示出小鼠脂肪組織細(xì)胞HE染色(100倍)。具體實施方式下面，將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行詳細(xì)的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。需要說明的是，在本文中，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。圖1示出本發(fā)明的洋蔥皮中黃酮類化合物的提取方法的示意圖；圖2示出產(chǎn)纖維素酶酵母菌生長曲線；圖3示出周期內(nèi)小鼠體重變化趨勢；圖4示出OPE對小鼠脂肪系數(shù)、攝食量、食物利用率的影響；圖5示出OPE對小鼠臟器指數(shù)的影響；圖6示出小鼠血清中TC含量；圖7示出小鼠血清中TG含量；圖8示出小鼠血清中HDL-C水平；圖9示出小鼠血清中LDL-C水平；圖10示出小鼠血清中FFA含量；圖11示出小鼠肝勻漿中GSH-Px的活力；圖12示出小鼠肝勻漿中MDA含量；圖13示出小鼠肝勻漿中T-SOD活力；圖14示出小鼠肝勻漿中T-AOC活力；圖15示出小鼠肝臟對比圖；圖16示出小鼠肝組織細(xì)胞HE染色(400倍)；圖17示出小鼠脂肪組織細(xì)胞HE染色(100倍)。在本發(fā)明中，洋蔥皮采集于延吉市某農(nóng)貿(mào)市場，用于發(fā)酵的酵母菌由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供的從大醬中分離提取，實驗試劑分別為無水乙醇(分析純)、甲醇、磷酸、乙腈(色譜純)、蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品，作為種子培養(yǎng)基采用牛肉浸膏3.0g、蛋白陳10g、NaC15.0g、葡萄糖1.0g、蒸餾水1000mI。作為發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Nal0g、(NH4)SO44g、KH2PO42g、MgSO4·7H2O0.5g、蛋白陳10g、牛肉膏5g、加水至1000mI。在本發(fā)明中，儀器設(shè)備分別采用電子天平：FA1104N型，上海精密科學(xué)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:FYFLAN-1001型，東京理化器械株式會社；糖度計:WY032'T型，重慶蜀江科技貿(mào)易有限公司；高速粉碎機:FW-200型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:EYELAN-1001型，東京理化器械株式會社；冷凍干燥機:LGH-18型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜儀:LC-2010型：日本島津DPN-9082BS-III電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療設(shè)備有限公司。實施例1～9一、<洋蔥皮提取物的制備>按照表1，將洋蔥皮粉碎后加入到濃度分別為40％、50％、60％的乙醇水溶液中，固液比分別為1:20、1:30、1:40，在80-90℃萃取1-2小時。趁熱過濾，濾渣中加一定量的醇水溶液，在相同溫度下萃取30min后過濾，方法再進行一次，將三次濾液合并，濃縮至原體積的五分之一，冷凍干燥，計算提取率。表1發(fā)酵洋蔥皮提取異黃酮按照表1的極差分析結(jié)果可以得出，影響洋蔥皮異黃酮提取效果各因素的主次順序為B(提取溫度)、D(乙醇濃度)、A(固液比)和C(提取時間)。二、<產(chǎn)纖維素酵母菌的制備>從朝鮮族大醬提取分離出來的產(chǎn)纖維素酵母菌的生長曲線。由圖2可以看出，酵母菌在培養(yǎng)基上生長良好，生長停滯期較短，在接種8h后進入對數(shù)生長期，60h后生長速率有所下降，80-100h進入穩(wěn)定期時菌體數(shù)量最大，根據(jù)生長曲線結(jié)果可以確定產(chǎn)纖維素酵母菌的穩(wěn)定生長期為80-100h。經(jīng)活化培養(yǎng)后接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、120r/min條件下培養(yǎng)24h后作為種子液。按4％接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、120r/min條件下培養(yǎng)，每4h測量培養(yǎng)液吸光度(600nm)，以時間為橫坐標(biāo)，吸光度做縱坐標(biāo)繪制生長曲線。將種子液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，一定條件下培養(yǎng)制成粗酶液，將粗酶液4℃、3000r/min下離心15min，取上清液測定纖維素酶活力。采用濾濾、紙酶活和CMC酶活測定纖維素酶活。將細(xì)菌在一定條件下培養(yǎng)，分別討論產(chǎn)酶時間、產(chǎn)酶pH及產(chǎn)酶溫度對纖維素酶活力的影響，以確定最佳產(chǎn)酶條件。表2異黃酮發(fā)酵前后含量變化樣品名發(fā)酵前含量發(fā)酵后含量增長比率蘆丁0.000765mg/g0.009173mg/g92％槲皮素0.0084255mg/g0.040636mg/g79％山奈酚0.008424mg/g0.005696mg/g-49％由表2可以看出，洋蔥皮最佳條件發(fā)酵，最優(yōu)提取工藝提取以后，異黃酮的總含量有所增長，蘆丁和槲皮素的含量在經(jīng)過發(fā)酵之后分別增長了92％和79％，而山奈酚的含量卻降低了48％。三、洋蔥皮提取物在減肥產(chǎn)品中的應(yīng)用準(zhǔn)確稱量蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品2mg，分別投入到10mL容量瓶容器中，用甲醇(HPLC級)溶解并定容至刻度，放在超聲波中20min使溶解完全，得到0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再分別精密量取1mL蘆丁、槲皮素和山奈酚單體溶液至10mL容量瓶中，定容至刻度，混合均勻，即得到三種標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液。準(zhǔn)確稱量OPE的粉末2mg，裝入到10mL容量瓶容器中，先倒入一半的甲醇將黃酮類物質(zhì)溶解，放入超聲波中20min后，繼續(xù)用甲醇定容至10mL刻度，然后超聲30min，將溶液用0.45μm微孔濾膜過濾，繼而根據(jù)準(zhǔn)備好的程序和流動相進行檢測。色譜柱：DiamonsilC18(250×4.6mm5μm)，選擇乙腈-0.4％磷酸溶液作為流動相，流速0.8mL/min，每次以10μL量進樣，在360nm波長下進行梯度洗脫(表3)。表3洗脫程序以60只4～5周齡SPF級C57BL-6J雄性小鼠為試驗對象，飼養(yǎng)期間自由采食和飲水，按動物實驗中心標(biāo)準(zhǔn)進行飼養(yǎng)，溫度保持在20～23℃左右，濕度控制在40～60％，自然通風(fēng)，照明按12/12h自動控制，定期更換墊料，保持生長環(huán)境清潔，清洗鼠籠。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始預(yù)防性抗肥胖試驗，周期為10周。不同處理的動物分籠飼養(yǎng)，每周稱1次體重，并觀察整個過程中小鼠活動程度、體毛色澤、進食情況及糞便形狀等。試驗10周后，各組小鼠禁食12h，稱量終體重后眼球取血，解剖后取小鼠的臟器和脂肪。喂養(yǎng)適應(yīng)1周后，按體重隨機取10只繼續(xù)喂食基礎(chǔ)飼料，列為普通對照組；其余小鼠按體重隨機分為五組，通過飼喂高脂飼料進行膳食誘導(dǎo)，分別設(shè)置為高脂對照組、實驗組(高、中、低)和陽性茶多酚對照。具體喂養(yǎng)方式見表4：表4試驗動物分組情況每天對小鼠的生理狀況進行記錄，如體毛色澤、活潑程度、進食飲水及糞便性狀等，稱取小鼠的給食量、剩食量和撒食量，單位為g，精確到0.1，統(tǒng)計攝食量(1)。每周稱小鼠體重1次，實驗結(jié)束前，小鼠禁食12h，測定小鼠終體重，并用游標(biāo)卡尺記錄體長(鼻子到肛門的長度)，計算體重增長量(2)和Lee’s指數(shù)(3)；計算食物利用率(4)。攝食量＝給食量-剩食量-撒食量(1)體重增長量＝終體重-初體重(2)食物利用率＝體重增長量/攝食量×100(4)小鼠摘眼球取血后，解剖摘取小鼠腹腔脂肪和睪丸附近脂肪，以及小鼠的心、肝、脾、腎，用濾紙吸干臟器上的血液后稱量其重量，保留到0.001g，計算脂肪系數(shù)(5)和臟器指數(shù)(6)。脂肪系數(shù)＝體內(nèi)脂肪總重/體重×100％(5)臟器指數(shù)＝臟器重/體重×100％(6)實驗結(jié)束時，將小鼠解剖摘取肝臟和脂肪，肉眼下觀察小鼠肝臟脂肪變性情況，并立即選取左葉肝組織及附睪同一部位脂肪組織(約0.5×0.5×0.8cm)于10％福爾馬林溶液中固定，并不時搖動，使組織固定充分、完全，減少淤血對細(xì)胞觀察的干擾。組織塊固定好后，用不同濃度的無水乙醇和二甲苯進行脫水透明，然后將組織用軟蠟和硬蠟包埋。蠟?zāi)毯螅瑥陌窈兄腥∠陆M織塊，根據(jù)冷凍切片機的刀片進行必要的修型，然后調(diào)節(jié)厚度開始切片，攤片的時候要盡量注意避免褶皺，防止細(xì)胞在顯微鏡下展示不完全，烘干后按HE染色程序進行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。肝臟脂肪組織變性情況，按照《非酒精性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)》進行判定。肝臟相關(guān)指標(biāo)的測定要先制成組織勻漿，在右葉肝組織同一位置取0.3g，將其放在玻璃勻漿管口用剪子剪碎，加入9倍體積(mL)提前放入冰箱中的0.86％生理鹽水。為了保持組織勻漿的低溫狀態(tài)，將勻漿管下端插入盛有冰水混合物的三角瓶中，用左手穩(wěn)住保持平衡。右手將搗杵慢慢地垂直插入套管中，上下研磨使組織勻漿化，為了充分研碎重復(fù)10次左右，看不到肝纖維為止。組織勻漿在4℃下2500r/min離心10min取上清液，按照試劑盒指導(dǎo)過程測定肝組織中蛋白含量、MDA、T-SOD、T-AOC、和GSH-Px活力。試驗期結(jié)束后，摘除小鼠眼球用5ml離心管采集血樣，按小鼠編號順序?qū)﹄x心管標(biāo)號，置于水浴鍋中，37℃水浴30min。取出于高速冷凍離心機上3000r/min條件下離心10min，分離采集小鼠血清，每份分裝兩管，于-80℃冰箱中保存。根據(jù)試劑盒操作具體步驟說明測定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C和FFA含量。實驗數(shù)據(jù)用Excel辦公軟件進行統(tǒng)計整理，脂肪細(xì)胞用ImageJ軟件進行測量，結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，并通過LED法進行差異顯著性檢驗。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，數(shù)值用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示。在整個實驗過程中各組小鼠攝食飲水正常，排泄的糞便呈正常狀態(tài)，小鼠精神狀態(tài)較佳，反應(yīng)敏捷，各組間無撕咬現(xiàn)象。表5OPE對小鼠體重、Lee's指數(shù)的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。小鼠身體重量的增量及每周的增長幅度從表5、圖3可見。各組小鼠在飼養(yǎng)初期體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，處于同一水平。隨著飼養(yǎng)時間的增加，各組小鼠體重正常生理反應(yīng)都會逐漸增長，但從折線圖中可以看出，高脂組小鼠體重增加的速率最快，高于實驗組和普通組，說明小鼠攝食高脂飼料起到了增長體重的作用。到末期稱量終體重時，高脂對照組小鼠體重增長了55.42％，普通對照組體重增長32.82％，兩組小鼠體重增長有顯著的差距，參照保健食品功能學(xué)評價程序與檢驗方法規(guī)范，說明小鼠肥胖模型成功。高脂組體重與OPE中劑量組和高劑量組差異顯著，表明一定劑量的OPE起到了抑制肥胖的作用；而低劑量組與高脂組的小鼠體重差異不顯著，說明低劑量提取物沒有起到明顯的作用。洋蔥皮提取物高劑量組體重增長量與飼喂基礎(chǔ)飼料的普通組差異不顯著，說明高劑量洋蔥皮提取物抑制肥胖作用效果最明顯。Lee's指數(shù)與人的體重指數(shù)(BMI)類似，主要反映機體肥胖程度。從表3可以觀察到，其中只有洋低組與高脂組Lee's指數(shù)不存在顯著性差異，其他組與高脂組比較都看出顯著性差異，而除了洋低外的其他組組間無顯著差異，說明洋高、洋中和陽性對照組小鼠的肥胖程度與正常組接近。機體的脂肪含量及脂肪系數(shù)是反映小鼠肥胖程度的一個重要指標(biāo)，實驗結(jié)果從表6、圖4可見。OPE中、高劑量組與高脂組相比，脂肪總重、脂肪系數(shù)均顯示出顯著差異(P<0.05)，洋低組的脂肪重和脂肪系數(shù)相對高脂對照組比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，效果不是很明顯，說明一定劑量的洋蔥皮提取物具有良好的抑制體內(nèi)脂肪堆積的作用。實驗組、陽性對照組和高脂對照組之間小鼠的攝食水平基本接近，這說明飼養(yǎng)期間灌胃OPE并沒有給小鼠的食欲帶來不良影響。喂食高脂飼料的小鼠食物利用率較高，說明肥胖與體內(nèi)的激素水平有關(guān)。飼喂高脂飼料實驗組的食物利用率比高脂對照組的食物利用率低，說明OPE可能是通過降低體內(nèi)食物利用率，而實現(xiàn)控制體重平衡的功效，預(yù)示著OPE對體重的影響與攝食量無關(guān)。表6OPE對小鼠脂肪系數(shù)、攝食量、食物利用率的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。從表7的數(shù)據(jù)可以看出，各實驗組間心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，表明OPE對心、腎、脾臟功能沒有明顯影響。而高脂組的肝臟指數(shù)顯著(P<0.05)高于普通組，可能是由于長期攝食高能量的食物，使脂肪在肝臟上的積聚變多所致。灌胃OPE實驗組的肝臟指數(shù)較高脂組顯著(P<0.05)降低，分別降低了6.91％、1.73％、5.19％，與普通對照組差異不明顯，這可能是因為洋蔥皮中豐富的黃酮類物質(zhì)起到了抑制脂肪在動物體內(nèi)堆聚的作用，加速脂肪分解，避免了脂肪在臟器上的沉積。表7OPE對小鼠臟器指數(shù)的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。OPE對小鼠血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量的影響如表8、圖6～10所示，高脂組TC、TG的水平提升較多，與普通組相比具有顯著性差異，說明高能量的膳食誘導(dǎo)會使小鼠血清TC、TG含量升高。對于血清TC、TG的含量與高脂組相比，實驗組和陽性對照組均有所降低，中、高劑量組、陽性對照組降低的幅度具有顯著性(p<0.05)，而洋低組的降低幅度不顯著(P>0.05)；中、高劑量組TG和高劑量組TC含量與正常組無顯著差異，說明一定劑量的OPE對于降低小鼠血清TC、TG含量具有一定作用，洋高組比高脂組TC含量降低了11.96％。試驗各組間小鼠血清HDL-C水平并無顯著性差異(p>0.05)，和高脂組比較，試驗組血清HDL-C均有所升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組和陽性組血清中LDL-C水平和高脂對照組比較，均有所降低，且除了洋低以外差異都顯著(p<0.05)；和普通組比較，實驗組和陽性組血清LDL-C水平均有一定程度的升高，但差異不顯著。由表6數(shù)據(jù)可知，高脂組FFA偏大，中、高劑量組和陽性組相比高脂組FFA值平均降低了16.22％，水平接近正常組，但各組間差異不顯著。表8OPE對小鼠血脂指標(biāo)及游離氨基酸的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。綜上可知，高脂組小鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA含量高于普通組小鼠，血清中HDL-C低于普通組小鼠，說明長久的高能量膳食能夠在一定程度上引起小鼠血脂升高，實驗組小鼠的血脂水平有所改善，說明添加洋蔥皮提取物對于降低小鼠血脂起到一定作用。小鼠灌胃OPE后抗氧化指標(biāo)的變化見表9和圖11～14。高脂組的GSH-Px活力顯著(P<0.05)低于普通組，實驗組和陽性對照組都能將小鼠肝組織中GSH-Px活力提高，其中中、高劑量組提高的效果比較顯著，優(yōu)于普通組。與普通組相比，高脂組肝組織勻漿MDA含量升高較顯著(P<0.05)，己經(jīng)超出正常對照組的42.2％，反應(yīng)出高脂膳食誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)高血脂癥，以致機體抗氧化能力減弱。洋低組和陽性組能夠小幅度地降低MDA含量，但是對比高脂組呈現(xiàn)不顯著性差異；洋高和洋中組的肝組織勻漿中MDA含量相對高脂組降低比較顯著，與普通組接近，說明OPE能夠控制MDA含量，從而加強機體抗氧化能力。測定小鼠的T-AOC水平，高脂組顯著(P<0.05)低于普通組，實驗組和陽性組T-AOC水平較高脂組相比有所提升，其中洋高組和洋中組提高最為顯著，洋低組、陽性組與高脂組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對于T-SOD活力來看，實驗組、陽性組、普通組間差異均不顯著(P>0.05)，但相對高脂組活力都有所提升，洋中組差異最為顯著(P<0.05)，提高了14.45％，說明中劑量的OPE對提升肝T-SOD活力效果最好。表9OPE對小鼠肝臟中GSH-Px,MDA,T-AOC,T-SOD的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。綜合對比分析普通組和高脂組小鼠肝勻漿中MDA、T-AOC和相關(guān)氧化酶，顯示出高能量膳食誘導(dǎo)使得小鼠肝臟中MDA含量升高，T-AOC降低，GSH-Px和T-SOD活力下降，機體抗氧化能力減弱，OPE和茶多酚都能夠增強機體抗氧化能力，OPE的作用成效要優(yōu)于茶多酚。用肉眼觀察圖15解剖后肝臟圖片可知，普通組、洋高組和洋中組的肝臟外觀顏色呈紅褐色，表面光滑且有光澤，邊緣銳利，質(zhì)軟有彈性；肥胖組和洋低組小鼠的肝臟則呈土黃色，沒有光澤，腫大易碎，肝表面比普通組粗糙，邊緣圓頓，切面有油膩感；陽性組小鼠情況介于二種之間，優(yōu)于肥胖組和洋低組，但不及中、高劑量效果好。從圖16病理學(xué)觀察中可以看出，高劑量組和中劑量組的肝細(xì)胞形態(tài)、大小正常，肝索排列相對整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)無損壞，與普通組無太大差異。高脂組的肝細(xì)胞可見炎性細(xì)胞浸潤，小泡性脂肪浸潤增多，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。陽性組肝細(xì)胞脂肪化程度比高脂組和洋低組有改善，但效果不及洋中組，說明OPE一定劑量能有效改善小鼠肝細(xì)胞脂肪變性的癥狀，脂肪化肝細(xì)胞的修復(fù)作用明顯。脂肪細(xì)胞的超微顯微鏡的觀察結(jié)果見圖17。與普通組相比，高脂組的脂肪細(xì)胞在形態(tài)上明顯膨大，顯微鏡同視野內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量減少。陽性對照組和實驗低劑量組脂肪細(xì)胞大小不一，能夠在一定程度上減少脂肪細(xì)胞的大小。洋高組及洋中組的脂肪細(xì)胞形態(tài)較為均一，且細(xì)胞直徑明顯小于高脂組，同一視野范圍內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量增加，且效果優(yōu)于陽性組，可以看出OPE比茶多酚更能夠減少脂肪細(xì)胞的累積，抑制脂肪細(xì)胞膨大。表10小鼠脂肪細(xì)胞的直徑及面積注：同一列不同字母表示同一指標(biāo)不同處理組間顯著性差異(p＜0.05)。脂肪細(xì)胞的直徑長短和面積大小從表10可以看出，高脂組脂肪細(xì)胞的直徑和面積均顯著(P<0.05)高于普通對照組，實驗組和陽性組與高脂組相比，脂肪的細(xì)胞直徑及細(xì)胞面積均有顯著(P<0.05)降低，中、高劑量組起到調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞大小的作用最優(yōu)，效果優(yōu)于陽性組。脂肪細(xì)胞大小表現(xiàn)出與脂肪組織累積的程度以及體重呈正相關(guān)，研究表明肥胖過程伴隨著體內(nèi)脂肪細(xì)胞增大增多，脂肪細(xì)胞在體內(nèi)累積增加，從而引起肥胖現(xiàn)象。推測OPE可能是通過加速體內(nèi)脂肪動員，阻礙脂肪在細(xì)胞內(nèi)累計過多，從而減小脂肪系數(shù)，達(dá)到減肥的效果。隨著物質(zhì)生活對品質(zhì)需求的提升以及個人保健意識的逐漸加強，人們對保持健康且形態(tài)美的身體顯得格外的重視，且肥胖給人們帶來的影響不言而喻，于是更多有發(fā)展有前景的抗肥胖產(chǎn)品的研發(fā)被提上日程。動物模型是研究抗肥胖藥物效果、吸收途徑以及作用機理的主要工具，選用正確合適的動物對象是實驗成功的前提。國內(nèi)外很多專家將C57BL/6J小鼠應(yīng)用于肥胖領(lǐng)域的研究，因為C57BL/6J小鼠已經(jīng)完成全基因組的測序，遺傳背景相對明確，個體間的差異較小，對高能量飼料敏感，C57BL/6J小鼠通過飲食誘導(dǎo)形成肥胖模型周期較短，易形成肥胖模型。劉芳等利用C57BL/6J、ICR和KM三種品系的小鼠建立肥胖模型，通過研究對比每個品系小鼠的體重、脂肪重量、機體酶活性及脂肪細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠比其它兩種小鼠更容易形成肥胖模型，相關(guān)指標(biāo)的波動幅度更具有代表性。C57BL/6J小鼠在肥胖領(lǐng)域的應(yīng)用有很多，為人們尋求健康和美做出了非常多的貢獻(xiàn)。如Stewart等以C57BL/6J小鼠為實驗對象，研究了槲皮素對高能量飲食后的能量消耗及抗炎水平的影響；顧芹等以C57BL/6J雄性肥胖小鼠為試驗對象，研究了不同干預(yù)治療對脂肪組織中TNF-α的影響；曹玉珍等用高脂飼料誘發(fā)C57BL/6J小鼠形成脂肪肝，對建模后小鼠的血脂、肝脂質(zhì)及相關(guān)轉(zhuǎn)氨酶進行了研究，結(jié)果表明C57BL/6J小鼠是建立脂肪肝模型非常匹配的品系；朱婷婷以C57BL/6J小鼠為研究對象，探討了高脂高膽固醇飲食是否會引發(fā)脂質(zhì)在肺組織和肺泡上皮細(xì)胞上的沉積。綜合以上報道表明，C57BL/6J小鼠非常適合作為試驗對象用于肥胖領(lǐng)域的研究，除此之外，C57BL/6J小鼠還可以廣泛用于遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)及老年病學(xué)研究中。體重、腹腔脂肪重量、Lee’s指數(shù)是判斷肥胖程度的主要標(biāo)準(zhǔn)。肥胖是指機體內(nèi)脂肪存積過多，使體重增加而引發(fā)的病癥，過多的脂肪蓄積常會伴隨血脂異常。體重和脂肪量是最直觀、簡便評判肥胖與否的指標(biāo)，本實驗中高脂組小鼠體重顯著高于普通組，體重增長率高于20％，說明高脂小鼠成功造模。OPE試驗組的小鼠體重較高脂組相比有不同程度的降低，其中洋高組體重相對降低9.95％，洋中組相對降低了8.61％，兩組體重差異不顯著(P>0.05)。陽性組體重相對降低了4.73％，效果沒有中、高劑量OPE的好，但是高于洋低組，說明一定劑量的OPE比茶多酚能發(fā)揮更好的抑制體重增長的作用。小鼠攝食量沒有顯著差異，表明OPE沒有影響小鼠的食欲。實驗組小鼠的脂肪重量和脂肪系數(shù)低于高脂對照組，說明OPE可能是通過促進脂肪分解達(dá)到了抑制體重增長的作用，這可能與小鼠血漿和垂體中的生長激素(GH)水平有關(guān)。當(dāng)小鼠通過高脂膳食誘導(dǎo)形成肥胖后，血漿和垂體中GH含量會降低，從而使促進脂解的能力下降，脂肪細(xì)胞會變得膨大或聚積的越來越多，但這些激素的分泌和脂肪的變化都會受到OPE的影響。小鼠喂食高脂飼料易形成肥胖模型，可能因為小鼠的機體不能將攝入的脂肪及時地氧化，而且脂肪在漸漸向體內(nèi)臟器沉積的過程中會伴隨著碳水化合物的氧化，還有消耗能量的能力減弱。所以飼食高能量膳食的小鼠，比食用普通基礎(chǔ)飼料小鼠體重增加的快。本實驗中，各組小鼠對食物的攝入量沒有統(tǒng)計學(xué)差異，這說明在飼養(yǎng)過程中沒有因為灌胃操作而使小鼠生病、厭食，也說明小鼠對洋蔥特有的辛辣味沒有產(chǎn)生抵抗行為，日常生活中的攝食飲水都表現(xiàn)正常。食物利用率指小鼠對相同重量食物的吸收利用程度，與體重、攝食量有密不可分的關(guān)系。本實驗中，高脂對照組小鼠體重增長最顯著，同時食物的利用率也顯著(P<0.05)高于普通對照組；實驗組小鼠體重相對高脂組比有不同程度的降低，食物利用率的水平也呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢，說明OPE可能是通過抑制機體對食物的吸收利用率而達(dá)到控制體重的目的。動物的Lee’s指數(shù)相當(dāng)于人體評判肥胖的指標(biāo)BMI，數(shù)值越大，說明機體越肥胖。本實驗中高脂組的Lee’s指數(shù)顯著(P<0.05)高于普通組，再次證明了肥胖建模的成功。實驗組和陽性組的Lee’s指數(shù)與普通組不存在顯著性差異，說明OPE和茶多酚都有控制肥胖的作用。不過洋低組Lee’s指數(shù)降低較少，與高脂組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明OPE的減肥效果有量效關(guān)系。機體的肥胖與否和生長發(fā)育情況，一定程度上會在動物的臟器上體現(xiàn)，臟器指標(biāo)能夠從基礎(chǔ)上反映出機體的健康狀況及生長狀態(tài)。本實驗結(jié)果表明，各組小鼠的心臟、脾臟和腎臟的影響較小，沒有顯著性差異，說明OPE沒有損害心臟、脾臟和腎臟的功能，沒有明顯的副作用。在同等的飼養(yǎng)環(huán)境下，高脂對照組肝臟指數(shù)顯著(P<0.05)高于其他組，這可能是過多的能量攝入以脂肪的形式沉積在肝臟上，使肝臟發(fā)生腫大。同時肝臟是機體新陳代謝和消化吸收的重要器官，是最大的消化腺，自身很容易受到進入體內(nèi)的食物和周圍環(huán)境的影響。實驗組和陽性組的肝臟指數(shù)與高脂組比有顯著性差異(P<0.05)，肝臟指數(shù)降低，說明食用高脂飼料的同時灌胃OPE能減少脂肪在肝臟中的沉積，降低脂肪肝發(fā)生的幾率。KyeWonPark等的研究顯示，黃酮類物質(zhì)能很好的保護肝臟，減少肝臟脂肪的沉積，降低肝臟指數(shù)。TG是脂肪在人體內(nèi)主要的貯存方式，是脂類代謝的重要指標(biāo)，膽固醇也是脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)之一，是許多疾病的影響因子。血漿中TG和TC的濃度超過正常限定值，一般會被診斷為高脂血癥。肥胖的人一般都帶有高脂血癥，使血液的粘滯程度增加，加大患心血管疾病的危險。HDL-C是逆向轉(zhuǎn)運膽固醇的載體，作用是將周圍組織中的膽固醇吸收起來，然后運送至肝臟使其分解，以清除因LDL攝入過多造成的膽固醇及膽固醇酯在血管壁上的沉積。體態(tài)肥胖者基本都會出現(xiàn)脂肪代謝異常，主要的特征就是TG、TC和LDL-C的濃度較正常人高，HDL-C含量相反地會降低。本實驗中，高脂組小鼠的血液生化指標(biāo)與此現(xiàn)象一致，脂肪代謝出現(xiàn)紊亂，這可能與肥胖者胰島素水平較高密切相關(guān)，高胰島素會加速脂肪的合成，同時也會減慢TG自身的降解速度。本實驗采用高脂膳食誘導(dǎo)的方法，通過高脂飼料誘導(dǎo)小鼠形成高脂血癥，使脂肪代謝紊亂，這與人類的單純營養(yǎng)性肥胖有一定的相似性。對血清生化指標(biāo)進行測定，結(jié)果表明，高脂組小鼠的TC、TG、LDL含量明顯高于普通組，HDL含量卻顯示降低，說明小鼠高脂血癥模型成功。實驗組和陽性組均能不同程度的降低TC、TG、LDL含量，說明OPE和茶多酚都能夠抑制高血脂小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平的升高，緩解HDL-C的降低，且OPE的效果更好。高脂組是由高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖模型，肥胖易導(dǎo)致代謝綜合征，使血清中FFA升高，因此會降低肝細(xì)胞胰島素受體對胰島素的結(jié)合能力，并會加速受體胰島素的降解，抑制肝臟對葡萄糖的攝取，引起脂毒性作用。FFA是TG被脂肪細(xì)胞分解后的產(chǎn)物，往往肥胖程度越大，脂肪堆積的量會越多，分泌FFA也會越多，中心型肥胖嚴(yán)重的危害性就是歸因于此。過量的FFA分泌，會損害胰島β-細(xì)胞，引發(fā)糖尿病，還會造成脂肪肝和高血壓等疾病。本實驗中，實驗組和陽性組都能減少FFA的分泌，中、高劑量組和陽性組的FFA含量與普通組無顯著差異，但洋低組降低的不明顯。有研究表明，黃酮類物質(zhì)主要是通過抗氧化作用來實現(xiàn)降血脂的作用，大量動物試驗及臨床研究證實，機體抗氧化能力的衰弱與肥胖有密切聯(lián)系。肥胖減弱機體抗氧化能力的途徑可能是通過降低抗氧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶的活性而達(dá)到的，而過多的脂質(zhì)過氧化物和ROS可消耗細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和維生素E，導(dǎo)致機體酶促及非酶促防御體系的抗氧化能力減弱。黃酮類化合物中某些成分可鰲合金屬離子，使其失去催化脂質(zhì)氧化的能力，阻礙氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而促進抗氧化能力提高。SOD是保護機體不受抗氧化損傷最重要的一類抗氧化酶，T-AOC則是反映機體總抗氧化水平高低的指標(biāo)，GSH是“抗氧化劑復(fù)合鏈”主要成員之一，是機體內(nèi)分解過氧化物的一類抗氧化劑。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)高能量飲食使高脂組小鼠肝勻漿中T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平明顯下降，增加了脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量，表明機體抵抗氧化損傷的體系被破壞，不能正常發(fā)揮清除自由基的作用。而實驗組可以使小鼠肝臟中MDA含量下降，T-AOC活力增強，提升機體防御體系，說明OPE可以有效提高SOD和GSH-Px的活性，降低MDA帶來的損害，并且能力的大小與劑量的多少呈相關(guān)性。單純性脂肪肝主要是脂肪、脂肪酸和TG在肝臟上聚積形成負(fù)荷，肝臟動態(tài)平衡被破壞，F(xiàn)FA含量增多被陸續(xù)運送至肝組織，而肝臟對FFA的氧化能力下降，加重TG血癥。用400倍顯微鏡觀察肝臟切片，飼喂基礎(chǔ)飼料的普通組肝組織的結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀規(guī)則地排列在中央靜脈周圍，并且肝小葉的結(jié)構(gòu)非常清晰。但是高脂組的肝組織切片呈現(xiàn)出片狀模糊，肝細(xì)胞發(fā)生腫脹，細(xì)胞中含有大小不等的脂肪滴空泡，出現(xiàn)脂肪細(xì)胞浸潤。陽性組的肝細(xì)胞脂肪浸潤數(shù)量少于高脂組，能一定程度的減少肝臟上脂肪的堆聚，經(jīng)大量報道證實，茶多酚起到減肥作用的主要途徑就是抑制膽固醇在體內(nèi)的吸收，以及加速機體內(nèi)不必要的脂肪分解。從染色后的肝組織顯微圖片看，中、高劑量組的肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪滴的數(shù)量比陽性組更少，說明一定劑量的OPE會比茶多酚更能抑制脂肪沉積，OPE的效果更佳。肥胖患者一般對外界的應(yīng)激反應(yīng)不是很敏感，能量消耗的較少，多余的能量就會以中性脂肪的形式儲存起來，形成白色脂肪組織，這也是為什么肥胖的人不容易瘦下來的原因。脂肪細(xì)胞是評價能量代謝平衡的關(guān)鍵指標(biāo)，可以通過分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)和控制機體的行為和功能，還可通過自身的氧化能力調(diào)節(jié)脂類的數(shù)量。有研究表明，大多數(shù)成人體內(nèi)脂肪細(xì)胞的數(shù)量不會發(fā)生顯著變化，肥胖者一般不是脂肪細(xì)胞的個數(shù)增多，而是體積的膨大，越來越多大型的脂肪細(xì)胞堆積在一起，就導(dǎo)致了脂肪細(xì)胞的變性而形成肥胖。通過對各組小鼠脂肪細(xì)胞直徑及面積的測定，我們可以看出實驗組和陽性對照組能夠顯著抑制脂肪細(xì)胞體積的膨大。OPE對飲食誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖小鼠有明顯的抑制肥胖效果，并且減肥的作用程度與劑量大小呈正相關(guān)。OPE濃度過低不能發(fā)揮出理想的減肥效果，中、高劑量的作用效果比較可觀，效果比同等劑量的茶多酚突出，說明OPE能夠發(fā)揮出良好的抑制脂肪細(xì)胞膨大、緩解脂肪細(xì)胞堆積的作用。通過本發(fā)明，1.洋蔥皮中黃酮類化合物蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量分別為0.2785mg/g、70.85mg/g、0.7mg/g，槲皮素是洋蔥皮中主要的黃酮類物質(zhì)；2.OPE能夠減輕小鼠因攝食高脂飼料導(dǎo)致的營養(yǎng)性肥胖，對攝食量沒有顯著影響，說明OPE不是通過降低食欲達(dá)到減肥的作用，小鼠糞便形態(tài)正常，不會引起腹瀉；3.OPE能夠有效改善小鼠的血脂水平，加快體內(nèi)脂質(zhì)的代謝，并提高機體的抗氧化能力，降低患動脈粥樣硬化的風(fēng)險；4.OPE能有效抑制脂肪細(xì)胞的膨大，減小脂肪細(xì)胞體積，并可清除脂肪在肝臟上的沉積，加快脂肪細(xì)胞的動員與代謝，預(yù)防脂肪肝的發(fā)生；5.OPE降脂減肥的作用與劑量有關(guān)，存在劑量效應(yīng)，中、高劑量效果最為明顯，沒有顯著性差異，而低劑量的效果不很明顯，說明一定劑量的OPE具有預(yù)防肥胖的作用。通過本發(fā)明的制備方法得到的產(chǎn)品，其粗提產(chǎn)品適用于制備各種功能性保健食品，精提產(chǎn)品既可適用于功能性保健食品的制備，也可適用于抗氧化藥品及減肥藥品的制備。當(dāng)前第1頁1 2 3