本發(fā)明屬于功能肽領(lǐng)域，具體涉及一種牡蠣來源的新型功能肽及其用途。

背景技術(shù)：

牡蠣(Oyster)，屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Lanellibranchia)，異柱目(Anisomyaria)牡蠣科(Ostreidae)動(dòng)物，是一種食用價(jià)值和藥用價(jià)值都極高的海洋雙殼貝類。牡蠣的種類繁多，目前全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有100多種，而中國(guó)沿海地區(qū)盛產(chǎn)牡蠣，約有20多種，是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一。

牡蠣不僅風(fēng)味鮮美，且營(yíng)養(yǎng)成分全，可作藥用，中醫(yī)典籍中也有用牡蠣治病的記載。根據(jù)已有報(bào)道，干牡蠣肉中，蛋白質(zhì)含量約占45％～52％，氨基酸組成完善。據(jù)世界糧農(nóng)組織評(píng)定，牡蠣肉中必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于牛乳和人乳。干牡蠣肉中脂肪含量約為7％～11％，多為具有生理活性的復(fù)合磷脂、磷酸肌醇、二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)等，這些成分都可以防止動(dòng)脈硬化、抗血栓以及抗衰老等作用。牡蠣中總糖含量為19％～38％，據(jù)報(bào)道，牡蠣中的糖原可直接被機(jī)體吸收，從而可以減輕胰腺負(fù)擔(dān)，對(duì)糖尿病的防止十分有效。此外，還含有豐富的維生素A、B1、B2、D等，含碘量比牛乳或蛋黃高200倍。此外，牡蠣殼中含有80％～95％的鈣鹽(碳酸鈣、磷酸鈣和硫酸鈣)，同時(shí)也含有鎂、鐵、硅、鋁和鋅等金屬元素。

牡蠣等海洋生物已經(jīng)成為功能能肽的重要來源。功能肽又稱活性肽，通常包含3到20個(gè)氨基酸殘基，它們的生理活性依賴于它們的氨基酸組成和序列，由于其特殊的生理功能也越來越受到人們的關(guān)注，一些生物活性肽已應(yīng)用于保健品、藥品等領(lǐng)域。有研究表明：人們攝取蛋白質(zhì)通過消化道的多種酶水解后，不僅僅像以前認(rèn)為的那樣以氨基酸的形式吸收，更多的是以肽的形式被直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度要比同一組成的游離氨基酸更快。功能肽不僅可以提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有重要的生理功能，如清除自由基、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、防治肝病腦病、抗菌，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活力、提高人體免疫力以及延緩衰老等功能。目前，國(guó)內(nèi)商品化的生物活性肽產(chǎn)品，活性成分明確的，除酪蛋白磷酸肽外還不多見。目前雖有較多文獻(xiàn)報(bào)道利用牡蠣制備含功能肽的水解蛋白，但其中有效成分并不明確。深入研究牡蠣水解蛋白的有效成分，發(fā)現(xiàn)活性良好的新結(jié)構(gòu)活性肽類，明確其分子結(jié)構(gòu)，對(duì)于強(qiáng)效新產(chǎn)品的開發(fā)、明確活性產(chǎn)生機(jī)理、優(yōu)化生產(chǎn)工藝、強(qiáng)化質(zhì)量控制，乃至牡蠣資源的高效利用都有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有良好的清除生物體內(nèi)自由基功能的牡蠣來源的功能肽。

本發(fā)明的功能肽，含14個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列為半胱氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-亮氨酸-天冬酰胺酸-谷氨酰胺酸-谷氨酰胺酸-賴氨酸-纈氨酸-甘氨酸-色氨酸-丙氨酸-精氨酸(CLCVLNQQKVGWAR，其序列如SEQ ID NO.1所示)，是一個(gè)新結(jié)構(gòu)肽類。

本發(fā)明所述的功能肽是以牡蠣(Crassostrea gigas)為原料，用酶制劑，包括SCSIO 01819酶制劑、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶等，作為催化劑，在催化牡蠣蛋白的水解反應(yīng)，制備所得新型清除自由基活性的水解蛋白中的有效成分。經(jīng)超濾、色譜方法將其從水解蛋白中分離純化后，使用基質(zhì)輔助的飛行時(shí)間質(zhì)譜方法(MALDI-TOF-TOF)分析，鑒定其分子量為1618.83Da，氨基酸序列為半胱氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-亮氨酸-天冬酰胺酸-谷氨酰胺酸-谷氨酰胺酸-賴氨酸-纈氨酸-甘氨酸-色氨酸-丙氨酸-精氨酸(CLCVLNQQKVGWAR)。經(jīng)NCBI中的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，未發(fā)現(xiàn)明顯同源的序列，該結(jié)果可以表明這種純化的肽是從牡蠣產(chǎn)生的新結(jié)構(gòu)肽。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述功能肽在制備自由基清除劑中的應(yīng)用。

一種自由基清除劑，其特征在于，包括上述功能肽作為活性物質(zhì)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述功能肽在制備具有自由基清除能力的功能食品或功能飼料中的應(yīng)用。

一種具有自由基清除能力的功能食品或功能飼料，其特征在于，包括上述功能肽作為活性物質(zhì)。

本發(fā)明的功能肽具有良好的清除生物體內(nèi)自由基的功能，因此本發(fā)明的功能肽可以用于制備自由基清除劑、以及具有自由基清除功能的功能食品和功能飼料。

附圖說明：

圖1是AHO–II-5-2ODS HPLC色譜圖；

圖2是目標(biāo)功能肽(CLCVLNQQKVGWAR)的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：牡蠣酶解蛋白的制備

1、原料和試劑

實(shí)施例中的牡蠣肉購(gòu)自廣州市黃沙水產(chǎn)市場(chǎng)市場(chǎng)，酶解前粉碎分袋包裝并密封，于-20℃保存。

SCSIO 01819酶制劑為自制，參照專利《一種海洋來源小單孢菌SCSIO 01819、酶制劑溶液及其制備方法和應(yīng)用》(申請(qǐng)?zhí)枺篊N201510366099.1，公開(公告)號(hào)：CN104894034A)中的方法制備，即為該專利中的SCSIO 01819酶制劑溶液-2。中性蛋白酶(酶活力為40萬U/g)，堿性蛋白酶(酶活力為40萬U/g)，木瓜蛋白酶(酶活力為40萬U/g)，菠蘿蛋白酶(酶活力為40萬U/g)，均購(gòu)自廣西南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶(酶活力為250U/mg),購(gòu)自美國(guó)sigma公司；DEAE-52纖維素陽離子交換樹脂購(gòu)自whatman公司，Sephadex G-15凝膠樹脂購(gòu)自GE公司。乙醇、甲醛、異丙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)用水均為超純水。

2、牡蠣的脫脂處理

將粉粹的牡蠣肉與異丙醇按照1g：4ml(w/v)的比例混合，在35℃下反應(yīng)3小時(shí)，過濾，在4500×g下離心20min，取下層脫脂的牡蠣肉，晾干，-20℃下保存。

3、牡蠣肉酶解蛋白的制備

步驟2脫脂后的牡蠣肉在表1所示的蛋白酶的最適酶解條件下分別進(jìn)行酶解，水解時(shí)間4小時(shí)，酶底比4000U/g。酶解結(jié)束后，在4℃，4500×g下離心，除去不溶性雜質(zhì)，再在15000r/min下低溫離心，所得上清液進(jìn)行過濾，使其透過0.22um的濾膜。將所得樣品溶液(濾液)凍干即得牡蠣水解蛋白，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1.六種酶催化牡蠣蛋白水解的溫度和pH值

4.DPPH自由基清除作用的測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)采用用DPPH實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)樣品的自由基清除能力。根據(jù)文獻(xiàn)(Hsu,K.C.；Lu,G.H.；Jao,C.L.,Antioxidative properties of peptides prepared from tuna cooking juice hydrolysates with orientase (Bacillus subtilis).Food Research International 2009,42,(5-6),647-652.)的方法，測(cè)定牡蠣肉酶解物的清除DPPH自由基活性的能力。將步驟3的牡蠣水解蛋白溶解于水中得樣品溶液，取100μl樣品溶液加入到96孔板第一行，使其終濃度為5mg/ml，用超純水進(jìn)行濃度梯度稀釋,再分別加入100μl濃度為2x10^-4mol/L的DPPH乙醇溶液，每個(gè)濃度做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，空白試驗(yàn)是由無水乙醇代替樣品溶液。將混合物放置37℃在黑暗處反應(yīng)30min。在517nm處測(cè)定吸光值。DPPH自由基的清除率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：S為樣品加DPPH的反應(yīng)后的吸光度；SB為樣品加的無水乙醇吸光度；C為無水乙醇加DPPH的吸光度；CB為空白對(duì)照的吸光度

根據(jù)結(jié)果繪制量效曲線，并計(jì)算DPPH清除活性的EC₅₀值(半數(shù)清除濃度)。用SCSIO 01618酶制劑、木瓜蛋白酶(papain)、中性蛋白酶(neutral protease)、胰蛋白酶(trypsin)、堿性蛋白酶(alcalase)、菠蘿蛋白酶(bromelain)制備的牡蠣水解蛋白，EC₅₀值分別為：0.62mg/ml，0.88mg/ml，0.71mg/ml，1.41mg/ml，1.92mg/ml，0.89mg/ml。

實(shí)施例2從酶解蛋白中分離制備新型功能肽

1、取實(shí)施例1中用SCSIO 01819酶制劑酶解得到的牡蠣水解蛋白5g，溶解于10mL水制成樣品溶液，用截留分子量為3kDa的超濾膜過濾，截留部分和濾液分別凍干，得兩個(gè)樣品：AHO-I(分子量>3kDa),AHO-II(分子量<3kDa)。

2、用離子交換柱對(duì)AHO-II(200mg)進(jìn)行分離，產(chǎn)生了5個(gè)色譜片段(AHO–II-1～5)，分別凍干后，檢測(cè)其DPPPH自由基清除活性的EC₅₀值，分別為3.53mg/ml，2.33mg/ml，2.88mg/ml，1.62mg/ml，0.461mg/ml(AHO–II-5)。

所述的用離子交換柱進(jìn)行分離，其分離條件為將AHO-II溶液加入預(yù)平衡的DEAE-52纖維素柱(1.6×50cm)，并依次用150mL的0.1，0.5和1.0M NaCl溶液洗脫，流速為1.0mL/min。按5mL/份收集洗脫流分(5mL)，根據(jù)UV譜圖(檢測(cè)波長(zhǎng)280nm)，合并為五個(gè)片段(AHO–II-1至AHO–II-5)，分別使用D101大孔樹脂對(duì)每個(gè)片段脫鹽，然后后凍干，測(cè)試DPPPH自由基清除活性。

3、取上一步驟中活性最強(qiáng)的AHO–II-5(52mg)，用G15凝膠柱進(jìn)行分離，獲得4個(gè)組分片段AHO–II-5-1～4，分別凍干后，檢測(cè)其DPPPH自由基清除活性的EC₅₀值，分別為1.17mg/ml，0.53mg/ml(AHO–II-5-2)，4.31mg/ml，0.93mg/ml，2.36mg/ml.

所述的G15凝膠柱分離，其分離條件為AHO–II-5樣品溶解于5mL去離子水中，并通過預(yù)先用純水平衡的Sephadex G-15凝膠過濾柱(2.6×100cm)純化。用去離子水以1mL/min的流速洗脫柱，按每份2.5mL收集洗脫液，根據(jù)UV(280nm)檢測(cè)的色譜圖，將洗脫液合并為4個(gè)片段(AHO–II-5-1、AHO–II-5-2、AHO–II-5-3、AHO–II-5-4)，分別凍干凍干保存。

4、取上一步驟制備的樣品片段中活性最強(qiáng)的片段AHO–II-5-2(12mg)，用HPLC(ODS柱)分離，收集22分鐘處色譜峰流分(圖2)，得目標(biāo)功能肽溶液，凍干后得到目標(biāo)功能肽，測(cè)試目標(biāo)功能肽的DPPPH活性，其EC₅₀值為0.22mg/mL。

所述的HPLC分離，其分離條件為AHO–II-5-2樣品溶于1mL0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液中。色譜儀為(RP-HPLC)Agilent1200HPLC型高效液相色譜儀，色譜柱為Zorbax，SBC-18柱(柱尺寸：4.6mm×250mm，5μm粒徑，Agilent)，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。溶劑系統(tǒng)：A，0.1％三氟乙酸水溶液，B，乙腈(默克公司，色譜純)。流速：1.0mL/min；洗脫程序：0-5分鐘，5％B；5-50min，5％B-95％B每次分離進(jìn)樣量50mL，收集保留時(shí)間22min處色譜峰片段(目標(biāo)功能肽)。共分離45次，合并峰片段后凍干。

5、結(jié)構(gòu)鑒定

使用基質(zhì)輔助-飛行時(shí)間質(zhì)譜方法(MALDI-TOF-TOF)，鑒定目標(biāo)功能肽的分子量為1618.83Da，分析目標(biāo)功能肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(圖1)，確認(rèn)目標(biāo)功能肽的氨基酸序列為：半胱氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-亮氨酸-天冬酰胺酸-谷氨酰胺酸-谷氨酰胺酸-賴氨酸-纈氨酸-甘氨酸-色氨酸-丙氨酸-精氨酸(CLCVLNQQKVGWAR)。經(jīng)NCBI中的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，未發(fā)現(xiàn)明顯同源的序列，該結(jié)果可以表明這種純化的肽是從牡蠣產(chǎn)生的新結(jié)構(gòu)肽。

序列表

<110> 中國(guó)科學(xué)院南海洋洋研究所

<120> 一種牡蠣來源的新型功能肽及其用途

<160> 1

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 牡蠣（ostrea gigas thunberg）

<400> 1

Cys Leu Cys Val Leu Asn Gln Gln Lys Val Gly Trp Ala Arg

1 5 10 14