本發(fā)明克隆表達了一種脫羧酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業(yè)微生物領域。
背景技術：
脫羧酶通常是一種焦磷酸硫胺素(thiaminediphosphate)依賴性的非氧化酶，是由輔酶thdp、mg2+和蛋白質構成的全酶。
3,4-二羧基苯乙醛是一種重要的化學中間體，我們發(fā)現(xiàn)可以通過3,4-二羥基苯丙酮酸脫羧后得到。目前為止，已經在陰溝腸桿菌(enterobactercloacae),乳酸乳球菌(lactococcuslactis)等中發(fā)現(xiàn)了一些脫羧酶(studiesonstructure-functionrelationshipsofindolepyruvatedecarboxylasefromenterobactercloacae,akeyenzymeoftheindoleaceticacidpathway.europeanjournalofbiochemistry,2003，270(10),2322-2331)，這些脫羧酶可以脫苯丙酮酸或吲哚丙酮酸的羧基生成對應的醛。3,4-二羥基苯丙酮酸比苯丙酮酸多兩個羥基，有更大的空間位阻效應，已知的苯丙酮酸脫羧酶對其沒有活性。
本發(fā)明首次從奇異變形桿菌(proteusmirabilis)中克隆表達出一種新型的脫羧酶，該脫羧酶可以對3,4-二羥基苯丙酮酸進行脫羧，具有重要的應用價值。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明從奇異變形桿菌(proteusmirabilis)中克隆得到了一種脫羧酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究
本發(fā)明的技術方案如下：
1、菌株
本發(fā)明脫羧酶基因的來源菌株為：proteusmirabilisatcc25933，購自美國atcc菌種庫。
2、脫羧酶基因的克隆
提取proteusmirabilisatcc25933菌體基因組總dna。設計特異性引物，應用pcr方法，擴增出脫羧酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。
3、脫羧酶表達與純化
將重組質粒導入e.colibl21(de3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。
4、脫羧酶的酶學性質分析
以3,4-二羥基苯丙酮酸為底物研究ph對本發(fā)明所述脫羧酶酶活的影響。
以3,4-二羥基苯丙酮酸為底物研究溫度對本發(fā)明所述脫羧酶酶活的影響。
酶活測定方法為：根據(jù)physiologicalcharacterizationofthearo10-dependent,broad-substrate-specificity2-oxoaciddecarboxylaseactivityofsaccharomycescerevisiae.appliedandenvironmentalmicrobiology2005,71(6):3276-3284.所述方法進行。
本發(fā)表明的有益之處：從奇異變形桿菌中克隆表達出一種新型的脫羧酶，該酶可以催化脫羧3,4-二羥基苯丙酮酸生成3,4-二羥基苯乙醛，具有重要的工業(yè)應用價值。
具體實施方式
實施例1
本實施例為本發(fā)明所述脫羧酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構建。
1、proteusmirabilisatcc25933dna的提取
將proteusmirabilisatcc25933菌株在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rpm離心10min得到菌體，應用細菌基因組dna抽提試劑盒(takara公司)按照其操作提取菌體基因組總dna，放冰箱備用。
2、大腸桿菌感受態(tài)制備
(1)接種e.colidh5α和bl21(de3)分別于含有20mllb培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，37℃、200rpm培養(yǎng)過夜。
(2)按1％接種量接種于50mllb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600約0.6(約2～3h)。
(3)將菌液轉移到50ml預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm、4℃離心5min。
(4)棄上清，加入5ml預冷的0.1mol/lcacl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm、4℃離心5min。重復2次。
(5)棄上清，加入1.5ml預冷的0.1mol/lcacl2溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5ml)加入100μl菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。
3、脫羧酶基因的克隆
(1)引物設計
設計引物序列為：
引物1：5'gccggagctcatgacaaacacagttattaagtacg3'
引物2：5'gccgtctagattagaatgaatataatgaactttttg3'
(2)pcr擴增
用以上合成的兩條引物，以proteusmirabilisatcc25933的基因組dna為模板進行pcr擴增。
本步驟中擴增體系為：
擴增程序為：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應30個循環(huán)
72℃，10min
pcr產物送華大基因測序后得到該脫羧酶的基因序列，如seqidno:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如seqidno:2所示。
(3)雙酶切和連接
將pcoldⅱ質粒和pcr產物進行雙酶切，酶切體系為：10×cutbuffer3μl,dna4μl，酶sacι和xbai各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將dna片段克隆到pcoldⅱ載體上，并轉化到e.colidh5α感受態(tài)細胞中。連接體系：10×dnaligasebuffer2.5μl，dna片段8μl，載體dna2μl，t4dnaligase1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。
(4)轉化
步驟：
1在連接體系中加入100μldh5α感受態(tài)細菌，輕混勻，冰浴30min。
2放入預熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的lb培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復蘇。
5將菌體均勻涂布在含抗生素的lb平板上。
6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進行菌落pcr，核酸電泳驗證，提取重組質粒。將重組質粒導入bl21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例2
本實施例為本發(fā)明所述脫羧酶的誘導表達及分離純化。
1、加500μl重組菌液到50mllb培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加40μl0.5m的iptg，15℃下冷誘導培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進行離心(8000rpm，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/l，ph7.4)復溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rpm，10min)收集上清得到粗酶液。
2、將步驟1得到的粗酶液采用aktaavant150蛋白純化系統(tǒng)操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將a1、a2、b1、b2四根管路都放進水里，設置systemflow20ml/min流速，進行排氣。然后設置systemflow1ml/min、flowpath(columnposition3)、deltapressure0.3、pre-pressure0.5、gradient0、inseta1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把a1放進結合液中，b1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mm的高濃度咪唑緩沖液(b1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經冷凍干燥備用。
實施例3
本實施例為本發(fā)明所述脫羧酶的最適溫度。以3,4-二羥基苯丙酮酸(10mm)為底物，將底物與ph為7.4的磷酸緩沖液在20-70℃不同的溫度條件下水浴15min，測定脫羧酶的酶活，確定酶的最適反應溫度為40℃。
實施例4
本實施例為本發(fā)明所述脫羧酶的最適ph值。以3,4-二羥基苯丙酮酸(10mm)為底物，將底物在ph3-9，40℃水浴15min測定酶的酶活，結果發(fā)現(xiàn)在ph6.0條件下脫羧酶酶活最高。
實施例5
本實施例為脫羧酶在最佳反應條件下的脫羧效率。配制10ml反應體系，3,4-二羥基苯丙酮酸濃度為10mm，脫羧酶濃度為5μg/ml，ph6，40℃水浴搖床150r/min振蕩12小時，測定得到3,4-二羥基苯乙醛濃度為9.9mm。轉化率達到99％以上。3,4-二羥基苯丙酮酸和3,4-二羥基苯乙醛采用液相色譜測定，液相條件為：0-15min10-100％乙腈、90-0％水(0.1％甲酸)；15-20min100％乙腈、0水；20-30min10％乙腈、90％水(0.1％甲酸)，紫外檢測器280nm波長，waterssunfirec18色譜柱。
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