本發(fā)明涉及一種污水處理廠活性污泥中自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的分離方法，屬于污水生物處理技術(shù)領(lǐng)域，用于對(duì)污水生物處理系統(tǒng)中自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的分離。

背景技術(shù)：

污水生物脫氮技術(shù)由于經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于污水處理領(lǐng)域。傳統(tǒng)的污水生物脫氮包括硝化過程和反硝化過程。其中硝化過程指好氧條件下游離氨和銨鹽被氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽的生物過程。硝化過程由特定的化能自養(yǎng)菌完成?；茏责B(yǎng)菌生物量合成所需的碳源來自溶解的CO₂，能量來源于將氨氧化為亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程。反硝化過程指缺氧條件下硝化過程產(chǎn)生的亞硝酸鹽和硝酸鹽被還原為氮?dú)獠奈鬯忻摮倪^程。反硝化過程由異養(yǎng)菌完成，其細(xì)胞合成需要有機(jī)碳源，同時(shí)需要有機(jī)碳作為電子供體還原亞硝酸鹽和硝酸鹽。因?yàn)橄趸^程和反硝化過程對(duì)溶解氧和碳源的需求不同，所以實(shí)際運(yùn)行工藝中將硝化過程和反硝化過程從時(shí)間上或空間上分開。隨著人們對(duì)生物脫氮技術(shù)的深入研究，在很多污水生物處理系統(tǒng)的好氧區(qū)發(fā)現(xiàn)了明顯的總氮損失現(xiàn)象，總氮損失率高達(dá)50％以上。實(shí)現(xiàn)好氧區(qū)總氮損失將大大簡(jiǎn)化生物脫氮工藝并提高脫氮效率，從而節(jié)省投資、提高處理效率，也可以節(jié)省碳源。好氧區(qū)總氮損失過程中，異養(yǎng)反硝化菌在自養(yǎng)硝化菌為優(yōu)勢(shì)的好氧環(huán)境中發(fā)揮作用，這一點(diǎn)對(duì)于低C/N比生活污水的處理意義重大，有悖于傳統(tǒng)自養(yǎng)硝化、異養(yǎng)反硝化的過程，所以不同微生物菌群對(duì)碳源的需求情況與代謝機(jī)理是好氧區(qū)總氮損失的一個(gè)核心問題。穩(wěn)定同位素和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)微生物特性研究提供了新的分析方法和手段。因此，采用穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)對(duì)不同菌群微生物的DNA進(jìn)行培養(yǎng)分離，并用分子生物學(xué)技術(shù)分析分離后的DNA樣品，研究標(biāo)記后微生物的菌群特點(diǎn)，能夠?yàn)槲鬯锩摰到y(tǒng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行提供有力保障。

穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)，是將復(fù)雜環(huán)境中微生物物種組成及其生理功能耦合分析的有力工具，該技術(shù)可以直接甄別復(fù)雜環(huán)境中微生物的物種組成及其生理功能，從群落水平分析重要微生物生理生態(tài)過程的分子機(jī)制。穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)與PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以及高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)合，可以在更高更復(fù)雜的整體水平上定向發(fā)掘復(fù)雜環(huán)境中的重要微生物資源，研究微生物的生理生態(tài)功能。目前對(duì)自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的鑒別，局限于對(duì)可分離純化菌種的研究，即通過投加無機(jī)或有機(jī)碳源測(cè)定微生物的生長(zhǎng)情況，分析微生物對(duì)碳源的代謝量和微生物的增長(zhǎng)量，從而確定微生物對(duì)碳源的代謝類型。這種方法不適用于污水處理廠活性污泥混合液中微生物自養(yǎng)或異養(yǎng)種類的鑒定。因?yàn)榛钚晕勰嗷旌弦褐形⑸锓N類繁雜，無法精準(zhǔn)確定混合液中哪種微生物代謝了投加碳源，更不能分別研究自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的微生物特性。而穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)可將自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌定向分離，并可進(jìn)一步借助分子生物學(xué)技術(shù)研究分離后各菌種的特性，分析好氧區(qū)總氮損失過程中各菌種的代謝功能，闡述總氮損失的形成機(jī)制。

本發(fā)明采用穩(wěn)定同位素核酸探針技術(shù)標(biāo)記并分離污水生物處理好氧區(qū)總氮損失過程中菌種的DNA，并用PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以及高通量測(cè)序技術(shù)分析分離后的DNA樣品，從而鑒別活性污泥系統(tǒng)中的自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌對(duì)好氧區(qū)總氮損失的貢獻(xiàn)。本發(fā)明在技術(shù)上不同于現(xiàn)有技術(shù)，主要體現(xiàn)在以下三方面：

(1)培養(yǎng)目標(biāo)菌群的方法?，F(xiàn)有技術(shù)對(duì)自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的鑒定主要針對(duì)純化分離的純菌。純化分離過程每次只能獲得一種微生物，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、成本高。而且純培養(yǎng)環(huán)境不同于污水處理廠的實(shí)際環(huán)境，純化培養(yǎng)后微生物發(fā)揮的作用也不同于微生物在污水處理廠活性污泥中的作用，更不能體現(xiàn)水廠活性污泥中特定微生物與環(huán)境中其它微生物之間的相互關(guān)系，無法探究微生物在水廠復(fù)雜環(huán)境中的生理特點(diǎn)。本發(fā)明原位培養(yǎng)污水處理廠活性污泥中的微生物菌群，不改變微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，并且可以定向分離自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌，進(jìn)一步分別研究?jī)煞N菌群的微生物特性。水廠活性污泥受廢水污染，其中含有大量未知的有機(jī)、無機(jī)污染物、顆粒物、雜質(zhì)等，還有其它大量共存的菌膠團(tuán)細(xì)菌，對(duì)目標(biāo)微生物的原位培養(yǎng)干擾較大，需要對(duì)原位培養(yǎng)的條件進(jìn)行探索和優(yōu)化。

(2)穩(wěn)定同位素的作用。目前，穩(wěn)定同位素主要應(yīng)用于地質(zhì)、水文、環(huán)境等領(lǐng)域?qū)ν凰刎S度的檢測(cè)，從而分析引起同位素含量與分布不同的環(huán)境因素。其在水污染治理中的應(yīng)用，一方面是作為示蹤劑推測(cè)水體中污染源的來歷，分析污染物隨時(shí)間的遷移與變化，從而達(dá)到對(duì)已發(fā)生的污染事件進(jìn)行仲裁、了解污染物的轉(zhuǎn)化途徑等目的。另一方面是探究微生物對(duì)某一污染物的代謝過程以及代謝產(chǎn)物，研究的目標(biāo)是獲得能夠代謝污染物的特定微生物。本發(fā)明是利用污水處理系統(tǒng)中微生物對(duì)碳源種類需求不同的特點(diǎn)，以含¹³C的碳源為標(biāo)記底物，原位培養(yǎng)污水處理廠活性污泥，在微生物中合成¹³C-DNA，進(jìn)一步利用超高速密度梯度離心法將混合液中不同特性微生物的DNA分離，研究分離后的DNA即可獲得混合液中微生物的分子生物學(xué)特性。

(3)菌群分析的方法。污水處理廠發(fā)揮作用的活性污泥中有大量微生物，目前可借助特定的引物或探針研究活性污泥中具有特殊功能的微生物，例如具有脫氮功能的硝化菌和反硝化菌、具有除磷功能的聚磷菌或聚糖菌等。本發(fā)明是從微生物營(yíng)養(yǎng)類型的角度，即對(duì)碳源需求的不同分析自養(yǎng)型和異養(yǎng)型微生物對(duì)污染物去除的貢獻(xiàn)。碳源是微生物進(jìn)行新陳代謝必不可少的基質(zhì)之一，微生物的自養(yǎng)與異養(yǎng)特性直接決定其對(duì)碳源種類的需求及對(duì)污染物的去除效果。因此了解微生物的自養(yǎng)與異養(yǎng)特性對(duì)污水生物處理過程優(yōu)勢(shì)菌群的選擇以及污水處理廠工藝的優(yōu)化意義重大。但是，目前對(duì)于鑒定活性污泥中微生物的自養(yǎng)與異養(yǎng)特性沒有明確的方法。本發(fā)明利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)活性污泥中的微生物，定向分離得到自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的DNA，從而利用分子生物學(xué)技術(shù)分別研究自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的微生物特性。相比目前直接研究活性污泥中的某種特定微生物，本發(fā)明是先將活性污泥微生物分為自養(yǎng)與異養(yǎng)，進(jìn)一步探究自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌在活性污泥中發(fā)揮的作用。

故本發(fā)明利用¹³C標(biāo)記底物原位培養(yǎng)污水處理系統(tǒng)的活性污泥，提取培養(yǎng)后活性污泥的DNA，超高速密度梯度離心分離DNA，獲得自養(yǎng)菌群與異養(yǎng)菌群的DNA。然后利用分子生物學(xué)技術(shù)分別測(cè)定兩種菌群的微生物群落結(jié)構(gòu)，分析活性污泥系統(tǒng)中對(duì)碳源種類需求不同的微生物在污水處理過程中的功能，未見相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可靠的污水處理廠活性污泥中自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的鑒定方法。利用微生物對(duì)碳源的不同需求，通過投加穩(wěn)定同位素標(biāo)記底物培養(yǎng)活性污泥。根據(jù)投加碳源種類，超高速離心、分離純化得到自養(yǎng)或異養(yǎng)菌的DNA。采用普通PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定分離得到的DNA樣品，動(dòng)態(tài)研究活性污泥系統(tǒng)中微生物對(duì)碳源的需求。可低成本、高效地研究活性污泥對(duì)碳源的代謝以及對(duì)生物脫氮的貢獻(xiàn)，用于污水處理廠活性污泥系統(tǒng)中自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的分離，指導(dǎo)實(shí)際污水處理廠的運(yùn)行調(diào)控，具有很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種污水處理廠活性污泥中自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的分離方法，其特征在于：分離自養(yǎng)菌時(shí)，將活性污泥混合液均分為兩份，一份中加入¹³C標(biāo)記的無機(jī)物作為實(shí)驗(yàn)組，另一份中加入¹²C標(biāo)記的無機(jī)物作為對(duì)照組，分別原位培養(yǎng)；分離異養(yǎng)菌時(shí)，將活性污泥混合液均分為兩份，一份中加入¹³C標(biāo)記的有機(jī)物作為實(shí)驗(yàn)組，另一份中加入¹²C標(biāo)記的有機(jī)物作為對(duì)照組，分別原位培養(yǎng)；提取培養(yǎng)后活性污泥微生物的基因組DNA；將DNA樣品與氯化銫溶液混合并進(jìn)行超高速密度梯度離心；采用重力法在離心管的頂部勻速注水，在離心管底部接收流出的離心液，分離得到不同密度層級(jí)的DNA溶液；用PEG6000和乙醇溶液純化各層級(jí)的DNA樣品；利用普通PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定分離后實(shí)驗(yàn)組中5-9層級(jí)的DNA樣品，分析自養(yǎng)或異養(yǎng)微生物的群落特征，并與對(duì)照組進(jìn)行比較；

上述用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的底物原位培養(yǎng)活性污泥的過程如下：

(1)取活性污泥系統(tǒng)的污泥混合液，用蒸餾水淘洗離心3次，將離心后的污泥定容至淘洗前體積的一半；

(2)取2個(gè)150mL錐形瓶，各加入50mL淘洗后的污泥，分別加入¹²C標(biāo)記的底物作為對(duì)照組、¹³C標(biāo)記的底物作為實(shí)驗(yàn)組；攪拌培養(yǎng)3個(gè)周期，每周期10小時(shí)，保持溫度為25℃；前2個(gè)周期結(jié)束后淘洗離心污泥，將污泥定容至50mL后，加入對(duì)應(yīng)的基質(zhì)進(jìn)行下一個(gè)周期的培養(yǎng)；

上述超高速密度梯度離心過程如下：

(1)用分光光度計(jì)測(cè)定原位培養(yǎng)后活性污泥微生物的基因組DNA；

(2)采用Gradient Buffer緩沖液將2.0μg的活性污泥基因組DNA定容到100μL；

(3)在15mL的離心管中，依次加入4.9mL濃度為1.85g/mL的CsCl溶液、0.9mL Gradient Buffer緩沖液和步驟(2)中得到的100μL含2.0μg活性污泥DNA的溶液；

(4)采用渦旋振蕩儀將上述溶液完全混合；

(5)采用折光儀測(cè)定折光率，使上述溶液的目標(biāo)折射率為1.4029±0.0002，這一折射率對(duì)應(yīng)的浮力密度為1.725g/mL，如果目標(biāo)折射率偏大，添加Gradient Buffer緩沖液，20μL為一個(gè)添加單位；如果目標(biāo)折射率偏小，添加1.85g/mL的CsCl溶液，20μL為一個(gè)添加單位；

(6)采用10mL注射器移取步驟(5)的溶液5.1mL至6mL的離心管中，密封離心管；

(7)將離心試管放入超高速離心轉(zhuǎn)子，并使用螺帽將試管密封于轉(zhuǎn)子中。超高速離心的基本參數(shù)是：44小時(shí)；20℃；速度45krpm或190000×g；Time：hold；Accel：9；Decel：no break；

(8)離心完成后，將離心后的超高速密度梯度離心管固定于三腳架上，在超高速離心管底部放置15個(gè)1.5mL離心管，用6號(hào)針頭在超高速離心管底部扎一個(gè)小孔，然后在試管頂部未填充離心溶液的空隙處，將另外一個(gè)6號(hào)針頭插入并把它與固定流速泵相連，隨后啟動(dòng)固定流速泵；固定流速泵的流速設(shè)置為340μL/min；啟動(dòng)固定流速泵后，從離心管底部第一滴溶液流出開始計(jì)時(shí)，每隔1min更新放置于超高速離心管底部的1.5mL離心管的位置；均勻收集從超高速離心管流出的不同密度層級(jí)的DNA，得到15個(gè)不同密度層級(jí)的DNA用于后續(xù)分析；

上述各層級(jí)的DNA樣品的純化步驟如下：

(1)利用折光儀測(cè)定15層液體每層的折光率，評(píng)價(jià)分層效果；通過離心溶液密度計(jì)算的經(jīng)驗(yàn)公式ρ＝-75.9318+99.2031x-31.2551x²，推導(dǎo)各層液體的浮力密度，上述公式中ρ表示浮力密度，x表示折光值，使浮力密度的范圍在1.690～1.760g/mL之間；

(2)每層中加入550μL的PEG6000溶液，頭尾倒置若干次混勻溶液，室溫靜置2h或37℃加熱1h，沉淀DNA；

(3)在15-20℃下13000×g高速離心30min，除去上清液；

(4)加入500μL質(zhì)量百分比為70％乙醇清洗DNA沉淀，離心10min，除去上清液；

(5)再次加入500μL質(zhì)量百分比為70％乙醇清洗DNA沉淀，離心10min，除去上清液；

(6)將沉淀的DNA室溫干燥15min；

(7)確保DNA沉淀中無液體存在后，將其溶于30μL TE緩沖液，零下20℃保存。

本發(fā)明的有益效果

碳源是污水處理系統(tǒng)中微生物進(jìn)行生長(zhǎng)代謝的關(guān)鍵物質(zhì)之一，不同處理系統(tǒng)中的微生物對(duì)碳源的需求有差異。為了使污水處理系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行，必須探究系統(tǒng)中各類微生物所需要的碳源種類，從而向各類微生物提供合適的碳源，保證其正常的生長(zhǎng)代謝。本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確性高，操作方便的污水處理廠活性污泥中自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的分離方法，能夠從基因水平上將自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌分離開，并借助分子生物學(xué)方法分析分離之后樣品中的菌群結(jié)構(gòu)。該自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的分離方法可用于常規(guī)無法純化培養(yǎng)菌群的分離，可用于實(shí)驗(yàn)室自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的分析研究，指導(dǎo)實(shí)際污水處理廠的調(diào)控運(yùn)行。

本發(fā)明分別以¹³C-標(biāo)記無機(jī)物(或有機(jī)物)和¹²C-標(biāo)記無機(jī)物(或有機(jī)物)為實(shí)驗(yàn)組碳源和對(duì)照組碳源，原位培養(yǎng)活性污泥，提純培養(yǎng)后污泥樣品的DNA，與氯化銫溶液混合，超高速離心分離并純化DNA樣品，測(cè)定分層純化后樣品的遮光率，計(jì)算得到樣品的浮力密度在1.690至1.760g/mL之間，分離效果好。測(cè)定分層后的DNA樣品濃度，重浮力密度層級(jí)的DNA濃度高于輕浮力密度層級(jí)。用分子生物學(xué)方法，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行比較，得到重浮力密度層級(jí)與輕浮力密度層級(jí)的樣品，分析二者的菌群結(jié)構(gòu)，確定所培養(yǎng)活性污泥中的自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌。本發(fā)明不改變微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，使原位培養(yǎng)并分離自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌成為可能，而且從基因水平上整體分離鑒定菌群結(jié)構(gòu)，操作方便，具有較高的推廣使用價(jià)值。

本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)

(1)本發(fā)明利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記污水處理廠活性污泥中微生物的DNA，分離純化得到自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌的DNA，從而可在基因水平分別研究自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌，確定實(shí)際污水處理廠各反應(yīng)池中發(fā)揮主要作用的微生物對(duì)碳源的需求情況，豐富了活性污泥系統(tǒng)中微生物分子生物學(xué)研究的內(nèi)容，為研究污水處理系統(tǒng)中代謝不同碳源的微生物提供技術(shù)支持。

(2)本發(fā)明采用活性污泥微生物原位培養(yǎng)方法獲得不同菌種的DNA，不需要純化培養(yǎng)，不改變微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，可大批量、整體分離污水處理廠活性污泥中的自養(yǎng)菌與異養(yǎng)菌，培養(yǎng)時(shí)間短、成本低、效率高。自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌的DNA保真性好，可用于后續(xù)分子生物學(xué)的研究，為準(zhǔn)確獲知污水處理廠各反應(yīng)池中微生物對(duì)碳源的需求以及代謝污染物的功能提供有力保障。

具體實(shí)施方式

1、穩(wěn)定性同位素標(biāo)記底物培養(yǎng)活性污泥

(1)配制2種基質(zhì)，分別為1號(hào)基質(zhì)，含有¹²C-標(biāo)記的碳酸鈉；2號(hào)基質(zhì)，含有¹³C-標(biāo)記的碳酸鈉；

(2)取活性污泥系統(tǒng)的污泥混合液，用蒸餾水淘洗離心三次，將離心后的污泥定容至淘洗前體積的一半；

(3)取2個(gè)150mL錐形瓶，各加入50mL淘洗后的污泥，分別加入1號(hào)基質(zhì)，作為對(duì)照組；加入2號(hào)基質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)組，保持溫度為25℃，攪拌培養(yǎng)3個(gè)周期，每周期10小時(shí)。前2個(gè)周期結(jié)束后淘洗離心污泥，將污泥定容至50mL后，加入對(duì)應(yīng)的基質(zhì)繼續(xù)下一個(gè)周期的培養(yǎng)。

2、總DNA的提取

取培養(yǎng)并冷凍干燥后的活性污泥，按照DNA提取試劑盒(Fast DNA Spin kit for soil，BIO 101system，USA)的操作說明提取基因組DNA。

3、超高速密度梯度離心DNA

將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的DNA進(jìn)行超高速離心分離，得到不同密度層級(jí)的DNA溶液，具體操作如下：

3.1用NanoDrop ND-1000(Thermo，American)分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)后活性污泥微生物總DNA。

3.2采用Gradient Buffer(GB)將2.0μg的活性污泥總DNA定容到100μL。

3.3在15mL的離心管中，依次加入：4.9mLCsCl(1.85g/mL)、0.9mL GB和100μL含2.0μg活性污泥DNA的GB溶液。

3.4采用渦旋振蕩儀將離心液完全混合。

3.5采用折光儀測(cè)定折光率，使超高速離心溶液的目標(biāo)折射率，nD-TC為1.4029±0.0002，這一折射率對(duì)應(yīng)的浮力密度為1.725g/mL，如nD-TC偏大，添加GB(20μL約為一個(gè)添加單位)；如nD-TC偏小，添加CsCl(20μL約為一個(gè)添加單位)。

3.6采用10mL注射器將5.1mL的超高速離心混合液轉(zhuǎn)移到6mL的離心管中，密封離心試管。

3.7將離心試管放入超高速離心轉(zhuǎn)子，并使用螺帽將試管密封于轉(zhuǎn)子中。超高速離心的基本參數(shù)是：44小時(shí)，20℃，速度45krpm(190000×g)，time：hold，Accel：9；Decel：no break。

3.8離心完成后，將離心后的超高速密度梯度離心試管固定于三腳架上，在超高速離心管底部放置15個(gè)1.5mL離心管，用6號(hào)針頭在超高速離心管底部扎一個(gè)小孔，然后在試管頂部未填充離心溶液的空隙處，將另外一個(gè)6號(hào)針頭插入并把它與固定流速泵相連，隨后啟動(dòng)固定流速泵。固定流速泵的流速設(shè)置為340μL/min，啟動(dòng)固定流速泵后，從離心管底部第一滴溶液流出開始計(jì)時(shí)，每隔1min更新放置于超高速離心管底部1.5mL離心管的位置。均勻收集從超高速離心管流出的不同密度層級(jí)的DNA；得到15個(gè)不同密度層級(jí)的DNA用于后續(xù)分析。一般將離心液分為15層，但需多放一層，以保證第15層DNA液體體積的準(zhǔn)確。

4、DNA純化

4.1利用折光儀測(cè)定15層液體每層的折光率，評(píng)價(jià)分層效果。通過離心溶液密度計(jì)算的經(jīng)驗(yàn)公式(ρ＝-75.9318+99.2031x-31.2551x²，ρ表示浮力密度，x表示折光值)推導(dǎo)各層液體的浮力密度，使浮力密度的范圍在1.690～1.760g/mL之間。

4.2每層中加入550μL的PEG6000溶液，頭尾倒置若干次混勻溶液，室溫靜置2h或37℃加熱1h沉淀DNA；

4.3在15-20℃下13000×g高速離心30min，除去上清液；

4.4加入500μL 70％乙醇清洗DNA沉淀，離心10min，除去上清液；

4.5再次加入500μL 70％乙醇清洗DNA沉淀，離心10min，除去上清液；

4.6室溫干燥沉淀DNA 15min；

4.7確保DNA沉淀中無液體存在后，將其溶于30μL TE緩沖液，零下20℃保存。

分離純化后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別得到15個(gè)不同密度層級(jí)的DNA溶液，實(shí)驗(yàn)組中，¹³C標(biāo)記DNA在5-9層，既為自養(yǎng)微生物DNA，而對(duì)照組5-9層中沒有對(duì)應(yīng)的DNA層級(jí)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組10-14層為¹²C-DNA。用類似方法，以¹³C-有機(jī)物(實(shí)驗(yàn)組)和12C-有機(jī)物(對(duì)照組)為碳源培養(yǎng)活性污泥，可離心、分離并純化得到異養(yǎng)微生物DNA。

5、¹³C-DNA鑒定

采用普通PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)以及高通量技術(shù)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)組5-9層中的DNA樣品，并與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，得出異養(yǎng)微生物或自養(yǎng)微生物的生物學(xué)特性。

藥品與試劑

(1)Tris-HCl(1.0M，pH＝8.0)；

(2)Tris-EDTA[10mMTris-HCl(pH＝8)，1mM EDTA(pH＝8.0)]；

(3)GB緩沖液[0.1MTris-HCl(pH＝8.0)，0.1MKCl，1.0mM EDTA]；

(4)70％乙醇；

(5)氯化銫溶液(密度為1.88～1.89mg/mL)；

(6)Polyethylene Glycol 6000(PEG6000)溶液。