本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及線粒體全基因組檢測的引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
：線粒體病(mitochondriopathy)是由遺傳缺損引起線粒體代謝酶缺陷，導致ATP合成障礙，能量來源不足而出現(xiàn)的一組多系統(tǒng)疾病或組織特異性疾病。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生能量的細胞器。除了紅血細胞外，它存在于人體內(nèi)的每一個細胞中。線粒體的主要功能是提供細胞所需要的能量-三磷酸腺苷(ATP)。線粒體有自己的一套遺傳控制系統(tǒng)，同時也受到核DNA的控制。線粒體DNA(mtDNA)一旦發(fā)生突變，將會導致編碼線粒體氧化代謝過程必需的酶或載體發(fā)生障礙，糖原和脂肪酸等不能進入線粒體使得ATP合成受阻，導致能量代謝障礙和產(chǎn)生復雜的臨床癥狀。據(jù)文獻報道，線粒體病發(fā)病率大約為1/5000，線粒體病可由核基因組DNA突變或mtDNA突變導致，而由mtDNA突變導致的線粒體病大約占15％。常見的線粒體病主要有線粒體病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(MELAS)、肌陣攣性癲癇伴肌肉蓬毛樣紅纖維綜合征(MERRF)、慢性進行性眼外肌麻痹綜合征(KSS)、原發(fā)性線粒體腦病Leigh綜合征、Leber遺傳性視神經(jīng)病(LHON)、Pearson綜合征等。人類線粒體基因組全長16569bp，總共包含37個基因，其中13個編碼功能蛋白(呼吸鏈復合物)，2個編碼rRNA(16S和12S)，2個編碼tRNA。mtDNA突變在人群中非常普遍，據(jù)文獻報道，200個初生兒中就有一個攜帶有10個常見mtDNA致病性突變的其中一個突變。mtDNA突變遍布整個線粒體基因組，已發(fā)現(xiàn)的點突變種類就多達500多種，常見的點突變位點有m.3243A>G、m.3460G>A、m.1555A>G、m.8344A>G等。線粒體基因組結(jié)構(gòu)和常見突變位點的分布情況如圖1所示。對mtDNA進行檢測，常用的也是最簡單的方法就是設計特異性引物對線粒體基因組進行擴增，然后對擴增產(chǎn)物進行測序。目前用于mtDNA檢測的方法主要分為2大類：1.Sanger測序。該方法相對簡單，為目前主流的檢測方法。目前此方法存在的主要問題是擴增反應和測序反應數(shù)均較多，文獻報道的擴增反應數(shù)大多在10個以上(最少9個)，測序反應數(shù)最多達到66個。2.高通量測序(NGS)。檢測流程為先利用長片段PCR擴增出整個線粒體全基因組，之后將擴增產(chǎn)物片段化并進行文庫制備，然后將文庫上機測序，最后對測序數(shù)據(jù)進行分析和解讀。雖然該方法通量很高，但流程復雜，成本也較高。Sanger測序技術(shù)自從上世紀70年代誕生以來，目前已在臨床檢測領(lǐng)域廣泛應用，并成為基因檢測的金標準。Sanger測序讀長最大能達到1000bp。由于線粒體基因組全長16kb，要想通過Sanger測序技術(shù)獲得線粒體基因組全長必須設計多個引物分段擴增，測序后再進行拼接，雖然較小的擴增片段(500-1000bp)的最適合后續(xù)的Sanger測序，但需要做30-40個擴增反應以及40個以上的測序反應，不僅工作量大，檢測成本也較高。另外，雖然可以通過1-4個長片段PCR(Long-rangePCR)就能擴增出線粒體基因組全長，然而長片段的產(chǎn)物不適合進行后續(xù)的Sanger測序。綜合來看，用Sanger測序技術(shù)來檢測線粒體基因組其擴增產(chǎn)物大小在3000-4000bp最適宜。利用Sanger測序來檢測mtDNA最大的難點在于引物設計，主要原因是：1.線粒體基因組序列與核基因組序列具有高度同源性(核基因組中存在大量的NUMTs)，引物設計不當將會對核基因組DNA進行非特異性擴增。2.線粒體基因組序列具有高度的多態(tài)性，如果引物設計在具有多態(tài)性的位置，那么會由于引物與模板序列錯配而導致擴增失敗。我們經(jīng)過大量的工作和嘗試，在引物上精心設計，在擴增體系和條件上不斷優(yōu)化，最終開發(fā)出一個操作簡便、時間短、成本低的用于線粒體全基因組檢測的體系。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了線粒體全基因組的檢測引物、檢測體系和試劑盒。本發(fā)明利用特異性擴增線粒體基因組的引物和對擴增產(chǎn)物進行測序的引物，通過PCR和Sanger測序技術(shù)，檢測線粒體基因組的微小變異，從而輔助診斷因mtDNA突變導致的線粒體病。利用本發(fā)明的引物和檢測體系，只需6個擴增反應和21個測序反應就可以對線粒體全基因組進行檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供線粒體全基因組檢測的引物組合，包括6組擴增引物對，分別是：用于擴增m.14835-m.1691區(qū)域MC1的引物對，其堿基序列為：MC1-F：GATGAAACTTYGGCTCACTCCTMC1-R：GGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC；用于擴增m.1216-m.3959區(qū)域MC2的引物對，其堿基序列為：MC2-F：CGATAAACCCCGATCAACCTCAMC2-R：CCTGCGGCGTATTCGATGTT；用于擴增m.3706-m.6808區(qū)域MC3的引物對，其堿基序列為：MC3-F：CGAGCAGTRGCCCARACAATCMC3-R：GYGTGTCTACGTCTATTCCTACTG；用于擴增m.6418-m.9776區(qū)域MC4的引物對，其堿基序列為：MC4-F：AACCCCCTGCCATAACCCAMC4-R：TCGGAAATRGTGAAGGGRGA；用于擴增的m.8963-m.12214區(qū)域MC5的引物對，其堿基序列為：MC5-F：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAAMC5-R：GCTTYCTCGGTAAAYAAGGGGT；用于擴增m.11965-m.15364區(qū)域MC6的引物對，其堿基序列為：MC6-F：CACAGCCCTATACTCCCTCTACATMC6-R：GTTTGATCCYGTTTCGTGYAA；其中上述擴增引物中的簡并堿基Y是C和/或T，并且簡并堿基R是A和/或G。以上擴增引物在線粒體基因組上的分布如圖2所示。MC1-MC6的擴增引物對的產(chǎn)物大小在2700-3500bp之間，并且相鄰的擴增產(chǎn)物具有重疊區(qū)間，重疊區(qū)間大于200bp。本發(fā)明的引物組合中的各對擴增引物的Tm值都在(60±3)℃的范圍內(nèi)，確保用于擴增的引物在相同體系及擴增條件下，所有的引物對均能出現(xiàn)明亮且較單一的目的條帶，確保用于測序的引物在相同體系和條件下均能對目標產(chǎn)物成功測序。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供線粒體全基因組檢測的擴增反應體系，所述擴增反應體系包括6個單獨的擴增反應體系，每個單獨的擴增反應體系分別包含MC1-MC6擴增引物對中的一對、聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP和模板DNA。在優(yōu)選的實施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更優(yōu)選地，所述聚合酶是熱啟動Taq酶。在優(yōu)選的實施方案中，所述反應體系的體積為25μl或50μl。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供線粒體全基因組檢測試劑盒，所述試劑盒包含上述任一種引物組合。在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒中還進一步包含聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP。在優(yōu)選的實施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更優(yōu)選地，所述聚合酶是熱啟動Taq酶。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供線粒體全基因組檢測方法，包括以下步驟：(1)制備上述擴增反應體系；(2)進行PCR擴增，擴增程序是：在95℃變性5-15分鐘；然后進行30-35個循環(huán)，每個循環(huán)中94℃變性30秒，然后60-65℃退火30-90秒，然后60-72℃延伸60-180秒；最后在60-72℃延伸10-30分鐘。在一些實施方案中，所述線粒體全基因組檢測方法還包括步驟(3)：對擴增獲得的序列進行測序。在優(yōu)選的實施方案中，所述測序為Sanger測序。在優(yōu)選的實施方案中，使用下述測序引物對擴增獲得的序列進行測序：用于對m.14835-m.1691區(qū)域MC1的擴增產(chǎn)物進行測序的引物，其堿基序列為：MC1-SP1：GATGAAACTTYGGCTCACTCCTMC1-SP2：CGTCCTTGCCCTATTACTATCMC1-SP3：CTGTATCCGACATCTGGTTCCTMC1-SP4：TCACCCCCCAACTAACACATT；用于對m.1216-m.3959區(qū)域MC2的擴增產(chǎn)物進行測序的引物，其堿基序列為：MC2-SP1：CGATAAACCCCGATCAACCTCAMC2-SP2：AGGAACAGCTCTTTGGACACTMC2-SP3：ACAAGTTACCCTAGGGATAACA；用于對m.3706-m.6808區(qū)域MC3的擴增產(chǎn)物進行測序的引物，其堿基序列為：MC3-SP1：CGAGCAGTRGCCCARACAATCMC3-SP2：TATTTCCTCACGCAAGCAACMC3-SP3：CACGCTACTCCTACCTATCT；用于對m.6418-m.9776區(qū)域MC4的擴增產(chǎn)物進行測序的引物，其堿基序列為：MC4-SP1：AACCCCCTGCCATAACCCAMC4-SP2：ACCCCGATGCATACACCACATGMC4-SP3：CATGAGCTGTCCCCACATTA；用于對m.8963-m.12214區(qū)域MC5的擴增產(chǎn)物進行測序的引物，其堿基序列為：MC5-SP1：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAAMC5-SP2：CACAGGCTTCCACGGACTTCMC5-SP3：TAGTCTTTGCCGCCTGCGAAMC5-SP4：AATACGCCTCACACTCATTC；用于對m.11965-m.15364區(qū)域MC6的擴增產(chǎn)物進行測序的引物，其堿基序列為：MC6-SP1：CACAGCCCTATACTCCCTCTACATMC6-SP2：TTAGTTACCGCTAACAACCTATMC6-SP3：GCAGGAATACCTTTCCTCACAGMC6-SP4：TTCTTCTTCCCACTCATCCT；其中這些測序引物中的簡并堿基Y是C和/或T，并且簡并堿基R是A和/或G。其中模板DNA為樣品的全基因組DNA。在優(yōu)選的實施方案中，所述擴增反應液的體積為25μl或50μl。在優(yōu)選的實施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更優(yōu)選地，所述聚合酶是熱啟動Taq酶。在優(yōu)選的實施方案中，步驟(2)的擴增程序是：95℃變性10分鐘；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)中94℃變性30秒，然后60℃退火30秒，然后65℃延伸2分鐘；最后65℃延伸10分鐘。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供上述任一種引物組合或擴增反應體系在制備用于檢測線粒體全基因組的試劑中的應用。在一些實施方案中，擴增引物中和/或測序引物中的任一個兼并堿基Y獨立地是C或T。在一些實施方案中，擴增引物中和/或測序引物中的任一個兼并堿基R獨立地是A或G。在一些實施方案中，擴增引物中和/或測序引物中的任一個包含簡并堿基Y的引物序列獨立地是簡并堿基Y為C的序列和簡并堿基Y為T的序列的混合物，優(yōu)選在該混合物中簡并堿基Y為C的序列和簡并堿基Y為T的序列的質(zhì)量比為1：1。在一些實施方案中，擴增引物中和/或測序引物中的任一個包含簡并堿基R的引物序列獨立地是簡并堿基R為A的序列和簡并堿基R為G的序列的混合物，優(yōu)選在該混合物中簡并堿基R為A的序列和簡并堿基R為G的序列的質(zhì)量比為1：1。本發(fā)明所述的熱啟動Taq酶是指通過對Taq酶進行修飾，使Taq酶的活性在低溫下被抑制并在高溫下被激活，使用熱啟動Taq酶可以提高PCR擴增特異性。本發(fā)明的優(yōu)勢在于：1.操作簡便，檢測時間短，檢測成本低。由于只需6個擴增反應和21個測序反應，操作起來非常簡便，檢測時間大大縮短，同時檢測成本大幅降低。2.檢測結(jié)果準確可靠。由于引入了簡并堿基，避免了由于多態(tài)性而導致擴增失敗或異質(zhì)性的現(xiàn)象。附圖說明圖1是線粒體基因組結(jié)構(gòu)及常見突變位點的分布示意圖。圖2是MC1-MC6擴增引物在線粒體全基因組上的分布示意圖。圖3是MC1-MC6引物特異性測試的電泳檢測結(jié)果。圖4是1例正常男性樣本m.3243位點的Sanger測序結(jié)果分析圖。圖5是1例MELAS患者m.3243A>G突變位點的Sanger測序結(jié)果分析圖。具體實施方式本文使用的術(shù)語“引物”是能夠指與靶核酸序列雜交以在合適的條件下引發(fā)引物延伸產(chǎn)物合成的短的線性寡核苷酸。在聚合反應體系中，引物可以是一條或多條。本文使用的術(shù)語“引物對”表示一組或一對引物，包括與靶核酸序列的5'末端的互補序列雜交的5'有義引物(也可被稱為“正向引物”或“上游引物”，可以用簡寫“F”表示)，以及與靶序列的3'末端雜交的3'反義引物(也可被稱為“反向”或“下游”，可以用簡寫“R”表示)。本文使用的術(shù)語“擴增”是指增加樣品中靶核酸序列拷貝數(shù)的體外方法，擴增反應通常由允許連續(xù)變性、退火和引物延伸循環(huán)的多輪重復溫度循環(huán)組成。典型的擴增反應是PCR(Polymerasechainreaction，聚合酶鏈式反應)。通常，PCR反應涉及一系列重復20-35次的熱循環(huán)，所述循環(huán)包括變性步驟、引物退火步驟和延伸/延長步驟。PCR反應常常以5-100μ1的反應體積在小反應管中于熱循環(huán)儀中進行。變性步驟在大約94℃-95℃的溫度使核酸能夠完全變性，這一步驟產(chǎn)生單鏈DNA。引物退火步驟通常在比引物-靶序列DNA雙鏈體的解鏈溫度低大約5℃的溫度下進行，在這一步驟中，寡核苷酸引物特異性結(jié)合于單鏈靶序列。延伸步驟在約72℃進行，但這依賴于所用的DNA聚合酶。例如TaqDNA聚合酶的最佳條件為72℃，在這一步中，DNA聚合酶通過從5'到3'方向上添加dNTP的引物延伸來合成與靶鏈互補的新DNA鏈。聚合酶是擴增體系的重要組分，本文使用的術(shù)語“聚合酶”是指能從核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸合成核酸鏈(例如RNA或DNA)的酶。本發(fā)明的“聚合酶”優(yōu)選地是DNA聚合酶，包括但不限于Taq酶。多種Taq酶都滿足本發(fā)明的需要，如Takara的LATaq和HSTaq、KAPA的HiFiTaq、Life的AmpliTaqGold酶等均能得到較好的擴增效率和特異性。本發(fā)明所使用的聚合酶優(yōu)選為熱啟動聚合酶，更優(yōu)選為熱啟動Taq酶。本文使用的術(shù)語“熱啟動聚合酶”是指這樣的聚合酶，它的酶活性在非許可溫度(例如大約25℃至大約45℃)下受到抑制而在與PCR反應相匹配的溫度(例如，大約55℃至大約95℃)下被激活或“熱誘導”。例如，Relia熱啟動酶是通過化學修飾的方法封閉酶的活性中心，低溫下化學小分子和酶活性中心結(jié)合，酶無活性，當溫度升高至大約95℃，兩者脫離，酶活性中心暴露，開始指導體系擴增。熱啟動聚合酶(例如熱啟動Taq酶)可以極大地提高擴增的特異性和靈敏度。熱啟動聚合酶是本領(lǐng)域眾所周知的，可以從市場上購買獲得。為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明了，下面結(jié)合具體實施方式并參照附圖，對本發(fā)明進一步詳細說明。應該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。1、引物組合的設計根據(jù)線粒體基因組序列設計擴增引物，引物序列如表1所示。表1：擴增引物序列引物名稱引物序列MC1-FGATGAAACTTCGGCTCACTCCT(SEQIDNO:1)MC1-RGGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC(SEQIDNO:2)MC2-FCGATAAACCCCGATCAACCTCA(SEQIDNO:3)MC2-RCCTGCGGCGTATTCGATGTT(SEQIDNO:4)MC3-FCGAGCAGTAGCCCAAACAATC(SEQIDNO:5)MC3-RGTGTGTCTACGTCTATTCCTACTG(SEQIDNO:6)MC4-FAACCCCCTGCCATAACCCA(SEQIDNO:7)MC4-RTCGGAAATGGTGAAGGGAGA(SEQIDNO:8)MC5-FATCAGCCTACTCATTCAACCAA(SEQIDNO:9)MC5-RGCTTTCTCGGTAAATAAGGGGT(SEQIDNO:10)MC6-FCACAGCCCTATACTCCCTCTACAT(SEQIDNO:11)MC6-RGTTTGATCCCGTTTCGTGCAA(SEQIDNO:12)為了驗證6對擴增引物的特異性(即特異性擴增線粒體基因組)，將全基因組DNA電泳后進行切膠回收以去除mtDNA(回收產(chǎn)物先用一對特異性擴增核基因組DNA的引物進行PCR，若能擴增出目的產(chǎn)物則說明回收成功)，然后用去mtDNA后的核基因組DNA做模板進行擴增，同時用切膠回收前的全基因組DNA做對照，結(jié)果顯示6對引物以全基因組DNA為模板均能擴增出目的產(chǎn)物，而以去除mtDNA后的核基因組DNA為模板則無擴增產(chǎn)物出現(xiàn)(如圖3所示)。根據(jù)線粒體基因組序列和擴增產(chǎn)物分布情況設計測序引物，引物序列如表2所示。表2：測序引物序列引物名稱引物序列MC1-SP1GATGAAACTTCGGCTCACTCCT(SEQIDNO:13)MC1-SP2CGTCCTTGCCCTATTACTATC(SEQIDNO:14)MC1-SP3CTGTATCCGACATCTGGTTCCT(SEQIDNO:15)MC1-SP4TCACCCCCCAACTAACACATT(SEQIDNO:16)MC2-SP1CGATAAACCCCGATCAACCTCA(SEQIDNO:17)MC2-SP2AGGAACAGCTCTTTGGACACT(SEQIDNO:18)MC2-SP3ACAAGTTACCCTAGGGATAACA(SEQIDNO:19)MC3-SP1CGAGCAGTAGCCCAAACAATC(SEQIDNO:20)MC3-SP2TATTTCCTCACGCAAGCAAC(SEQIDNO:21)MC3-SP3CACGCTACTCCTACCTATCT(SEQIDNO:22)MC4-SP1AACCCCCTGCCATAACCCA(SEQIDNO:23)MC4-SP2ACCCCGATGCATACACCACATG(SEQIDNO:24)MC4-SP3CATGAGCTGTCCCCACATTA(SEQIDNO:25)MC5-SP1ATCAGCCTACTCATTCAACCAA(SEQIDNO:26)MC5-SP2CACAGGCTTCCACGGACTTC(SEQIDNO:27)MC5-SP3TAGTCTTTGCCGCCTGCGAA(SEQIDNO:28)MC5-SP4AATACGCCTCACACTCATTC(SEQIDNO:29)MC6-SP1CACAGCCCTATACTCCCTCTACAT(SEQIDNO:30)MC6-SP2TTAGTTACCGCTAACAACCTAT(SEQIDNO:31)MC6-SP3GCAGGAATACCTTTCCTCACAG(SEQIDNO:32)MC6-SP4TTCTTCTTCCCACTCATCCT(SEQIDNO:33)2、常規(guī)PCR擴增體系及條件的建立2.1Taq酶使用熱啟動Taq酶作為DNA聚合酶。2.2反應體積的選擇分別采用了25μl和50μl體系進行了復合擴增，這2種不同的體系效果相當(即產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中的條帶亮度相當，均無雜帶)。2.3反應程序的優(yōu)化退火及延伸溫度：考察了退火溫度從60℃到65℃之間各溫度下的擴增情況，結(jié)果顯示在60-65℃范圍內(nèi)擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中的條帶亮度相當，均無雜帶。在以下變性、退火及延伸溫度下各時間范圍內(nèi)(見表3)的擴增可以得到較好的結(jié)果(即產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中的條帶明亮，均無雜帶)：表3：溫度與時間溫度時間95℃(變性)5-15min60-65℃(退火)30-90s60-72℃(延伸)30-60s65-72℃(最后延伸)10-30min擴增循環(huán)數(shù)：考察了循環(huán)數(shù)在30至35之間各循環(huán)數(shù)下的擴增情況，結(jié)果顯示在30-35范圍內(nèi)均能得到較好結(jié)果(即產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中的條帶明亮，均無雜帶)。3、實驗驗證在以下實施例中，采用本發(fā)明的檢測體系分別對1例MELAS患者血液樣本和1例正常男性血液樣本進行檢測。3.1DNA提取采用QIAGEN公司的FlexiGeneDNAKit對2例血液樣本進行全基因組DNA提取，具體操作按說明書進行。3.2PCR反應將6對擴增引物干粉(引物序列見表2)分別溶解并配成濃度為5μM的工作液。將各反應試劑(ddH2O、2×GoldStarTaqMasterMix、Primer)振蕩混合后按表4體積比配成PCR反應混合液(模板除外)，分裝23μlPCR反應混合液于PCR反應管中，每個樣本包括分別以MC1-MC6為擴增引物的6個PCR反應，共包括6個PCR反應管，每個PCR反應管含有MC1-MC6中的一對擴增引物，最后往各反應管加入2μl模板，離心后進入下一步。表4PCR體系備注：2×GoldStarTaqMasterMix購于北京康為世紀生物科技有限公司，由GoldStarTaqDNAPolymerase、PCRBuffer、Mg2+、dNTPs及PCR穩(wěn)定劑和增強劑組成。3.3PCR反應程序?qū)CR反應管置于擴增儀(ABI2720循環(huán)擴增儀)上，運行如下程序：第1步：95℃變性10分鐘，第2步：94℃變性30秒，第3步60℃退火30秒，第4步：65℃延伸2分鐘，重復2至4步30次，最后65℃延伸10分鐘。運行結(jié)束置于冰箱4℃保存。3.4瓊脂糖凝膠電泳檢測(儀器為六一牌DYCP-31CN型電泳儀)預先配制1.5％的瓊脂糖凝膠，取上一步得到的PCR擴增產(chǎn)物3μl點樣于凝膠上，電壓100v條件下進行電泳，30min后置于凝膠成像儀上觀察結(jié)果并拍照保存。3.5Sanger測序(儀器為ABI3500Dx)將每一PCR反應管中剩余的22μl擴增產(chǎn)物進行純化(純化試劑為購至康為世紀的快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒CW2301S，操作按標準Protocol)，然后進行測序模板的制備(各擴增片段對應的測序引物如表5所示，測序試劑為購自Invitrogen公司的BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit，操作按標準Protocol)，最后將測序模板(每個樣本21個)置于96孔PCR板上，加入10μl甲酰胺(Hi-DiTMFormamide，Invitrogen)，變性后置于ABI3500Dx測序儀上進行測序。表5擴增片段與測序引物對應表3.6測序結(jié)果分析3.6.1序列組裝(軟件：DNAStar，美國DNASTAR公司)將正常男性樣本測序所得的21個測序結(jié)果(原始文件)導入DNASTAR軟件的SeqMan程序中，添加要拼接的序列，手工去除序列兩端質(zhì)量差的序列后進行序列拼接，以FASTA格式導出拼接好的序列，并與從MITOMAP網(wǎng)站下載的RevisedCambridgeReferenceSequence(rCRS)oftheHumanMitochondrialDNA參考序列進行比對，結(jié)果(未展示)顯示除少數(shù)多態(tài)性位點的堿基不同外，其余序列均一致，說明通過所設計的6對擴增引物得到的擴增片段經(jīng)21個測序反應后能得到全部的線粒體基因組序列。3.6.2變異位點分析(軟件：MutationSurveyor，美國SoftGenetics公司)將正常男性樣本和MELAS患者測序所有的測序結(jié)果(原始文件)分別導入MutationSurveyor軟件中，將正常男性樣本的結(jié)果做為參照，然后將MELAS患者的序列與之比較，發(fā)現(xiàn)在m.3243位點處發(fā)生A>G的異質(zhì)性突變，如圖5所示(正常樣本該位點為A，如圖4所示)。參考文獻:1.BiochimicaetBiophysicaActa.2010；1797:113–1282.ColdSpringHarbPerspectBiol2013；5:a0212203.PNAS.2014；111(29):10654–106594.Electrophoresis.2009；30:1587–1593SEQUENCELISTING<110>北京圣谷智匯醫(yī)學檢驗所有限公司<120>用于線粒體全基因組檢測的引物組合及試劑盒<130>2016<160>33<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1gatgaaacttcggctcactcct22<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2gggtttggggctaggtttagc21<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3cgataaaccccgatcaacctca22<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4cctgcggcgtattcgatgtt20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5cgagcagtagcccaaacaatc21<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6gtgtgtctacgtctattcctactg24<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>7aaccccctgccataaccca19<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8tcggaaatggtgaagggaga20<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>9atcagcctactcattcaaccaa22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10gctttctcggtaaataaggggt22<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>11cacagccctatactccctctacat24<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12gtttgatcccgtttcgtgcaa21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13gatgaaacttcggctcactcct22<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>14cgtccttgccctattactatc21<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>15ctgtatccgacatctggttcct22<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16tcaccccccaactaacacatt21<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>17cgataaaccccgatcaacctca22<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18aggaacagctctttggacact21<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>19acaagttaccctagggataaca22<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>20cgagcagtagcccaaacaatc21<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21tatttcctcacgcaagcaac20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22cacgctactcctacctatct20<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>23aaccccctgccataaccca19<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>24accccgatgcatacaccacatg22<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>25catgagctgtccccacatta20<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26atcagcctactcattcaaccaa22<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>27cacaggcttccacggacttc20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28tagtctttgccgcctgcgaa20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29aatacgcctcacactcattc20<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>30cacagccctatactccctctacat24<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>31ttagttaccgctaacaacctat22<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>32gcaggaatacctttcctcacag22<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>33ttcttcttcccactcatcct20當前第1頁1 2 3