本發(fā)明涉及腫瘤基因領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測肝癌的引物組及檢測方法。
背景技術(shù)：
：肝癌是世界上第五大最常見的惡性腫瘤，肝細(xì)胞癌是肝臟惡性腫瘤中最重要的病理類型，也在腫瘤相關(guān)的死亡原因中排名第三，從發(fā)現(xiàn)癥狀到死亡，患者生存時間不超過1年。肝癌的高病死率主要有兩個原因，其一是肝癌只有發(fā)展到較晚階段時才會出現(xiàn)臨床癥狀，其二是晚期肝癌缺乏有效的治療手段。因此，在大部分情況下，肝癌確診時已經(jīng)錯過了最佳治療時間。肝癌主要發(fā)生于亞洲等地區(qū)的發(fā)展中國家，具有較典型的地理區(qū)域分布特點(diǎn)。近幾十年中，在美國和歐洲的發(fā)達(dá)國家中，肝癌的發(fā)病率也有很大的提高。據(jù)估計，在未來的20年中，肝癌的發(fā)病率和病死率將再增加1倍。到目前為止，盡管多種對于腫瘤的治療措施可用于降低腫瘤相關(guān)的病死率，但是在包括英國和美國等很多發(fā)達(dá)國家中，肝癌的病死率仍然沒有顯著的降低。為了克服這個巨大的挑戰(zhàn)，當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)集中于怎樣對肝癌進(jìn)行早期診斷，以便于肝癌的及時治療.目前肝癌的診斷方法包括影像學(xué)檢查，細(xì)胞病理學(xué)和組織病理學(xué)診斷。影像學(xué)檢查包括CT掃描、核磁共振檢查等，但是其效率較低并且檢測準(zhǔn)確度不高。通常的細(xì)胞和組織病理學(xué)檢測包括細(xì)胞活檢，需要通過外科手術(shù)或者穿刺的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材。不但不方便，而且會對患者造成人體傷害。近來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測的出現(xiàn)給患者的檢測帶來了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學(xué)標(biāo)本如骨髓等相比，外周血標(biāo)本容易獲取，且對患者創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測較為理想的標(biāo)本來源。CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療方案。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，CTCs檢測可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，且對患者沒有副作用。CTC的檢測通常通過抽取一定體積的血液進(jìn)行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負(fù)選。正選主要是通過CTC表面標(biāo)志物或細(xì)胞的物理性質(zhì)(大小、密度)進(jìn)行捕獲；前者是基于免疫磁球技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，后者是基于過濾、離心的原理。負(fù)選則是通過白細(xì)胞表面標(biāo)志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴(yán)重依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，因此無法捕獲未表達(dá)表面腫瘤標(biāo)記物的CTC細(xì)胞。采用RT-PCR的方法檢測CTC細(xì)胞的特異性基因是CTC細(xì)胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過RT-PCR的方式檢測特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過檢測CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測CTCs費(fèi)用低，敏感度高，而且容易自動化。目前RT-PCR方法檢測肝癌的CTCs檢測的標(biāo)準(zhǔn)還沒有建立。我們通過檢測肝癌患者的CTCs特征基因，確定肝癌CTCs的檢測方法和檢測標(biāo)準(zhǔn)。這些檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物(包括NK和CAR-T免疫治療)的療效及制定個體化治療方案。針對上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測的試劑盒，通過聯(lián)合檢測AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90、CD133、CK19、CD10、ASGPR、CPS1、HER2、FolateReceptor17個基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期篩查或診斷。本發(fā)明設(shè)計運(yùn)用靶向特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達(dá)到98％，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測肝癌的引物組及檢測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種用于檢測肝癌的引物組，包含：本發(fā)明的引物組可通過以下兩種方法實(shí)現(xiàn)肝癌的檢測。方法1：PCR方法。(1)將權(quán)利要求1所述的17對引物分別加入到單個PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應(yīng)的每個循環(huán)的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權(quán)利要求1所述的17對引物分別加入到單個PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應(yīng)的每個循環(huán)的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個循環(huán)；每管設(shè)立三個復(fù)孔；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，并實(shí)時檢測熒光；(3)根據(jù)熒光檢測結(jié)果計算出的Ct值，判斷是否有標(biāo)志物靶基因表達(dá)于樣品中。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過設(shè)計特異性PCR引物，開發(fā)出用于肝癌早期檢測的多基因聯(lián)合檢測方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90、CD133、CK19、CD10、ASGPR、CPS1、HER2、folatereceptor基因進(jìn)行聯(lián)合檢測；(2)通過同時對多個基因進(jìn)行檢測肝癌檢出率可達(dá)到98％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達(dá)水平均可檢出；(4)特異性強(qiáng)，正常人或非肝癌病人樣本不會產(chǎn)生非特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費(fèi)用低廉。附圖說明圖1為實(shí)施例中健康人外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖2為實(shí)施例中非肝癌患者外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖3為實(shí)施例中非肝癌患者癌組織樣本檢測陰性PCR圖。圖4為實(shí)施例中肝癌患者外周血檢測陽性PCR圖。圖5為實(shí)施例中肝癌患者肝癌組織檢測陽性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.AFP、2.GPC3、3.AFU、4.GOLPH2、5.IGF-II、6.EpCAM、7.hTERT、8.MAGE1、9.MAGE3、10.CD90、11.CD133、12.CK19、13.CD10、14.ASGPR、15.CPS1、16.HER2、17.FolateReceptor。具體實(shí)施方式本發(fā)明針對目前腫瘤中主要的驅(qū)動性突變基因，聯(lián)合檢測AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90、CD133、CK19、CD10、ASGPR、CPS1、HER2、FolateReceptor17個基因?qū)崿F(xiàn)肝癌的早期篩查或診斷。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復(fù)雜繁瑣，檢測所需時間長，無法滿足臨床檢測的實(shí)際需求。針對上述問題，設(shè)計出用于檢測上述17個基因的一整套特異性引物組。根據(jù)上述17個基因的參考序列設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，其PCR產(chǎn)物長度最優(yōu)是在180-200b之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設(shè)計軟件的要求。通過采用實(shí)時熒光PCR反應(yīng)檢測體系，實(shí)現(xiàn)多個基因聯(lián)合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊》(科學(xué)出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實(shí)施。其中，所用的(帶標(biāo)記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:基因選擇多項研究表明，單基因篩查敏感度約為10-30％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個基因檢測，其檢測敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度。Abeer,Bahnassy,Abdel-Rahman等人(Abeer,Bahnassy,Abdel-Rahman,etal.CirculatingtumorandcancerstemcellsinhepatitisCvirusassociatedliverdisease[J].WorldJournalofGastroenterology,2014,20(48):18240-18248.)同時檢測AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90基因，結(jié)果表明聯(lián)合檢測三個基因用于肝癌早期診斷的敏感度為66％。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預(yù)后，我們對肝癌組織和正常組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。我們通過大量比對實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90、CD133、CK19、CD10、ASGPR、CPS1、HER2、FolateReceptor組成的基因組對肝癌具有較高的檢出率，達(dá)到98％，相對于現(xiàn)有的檢測技術(shù)，產(chǎn)生了意想不到的技術(shù)效果，具有顯著的進(jìn)步。實(shí)施例2：引物篩選(1)設(shè)計引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3、j1～j3、k1～k3、l1～l3、m1～m3、n1～n3、o1～o3、p1～p3、q1～q3，具體為：利用生物信息學(xué)軟件對靶基因A-Q序列進(jìn)行分析，利用序列分析軟件設(shè)計特異性引物組，利用NCBI引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設(shè)計出3對特異性擴(kuò)增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3、j1～j3、k1～k3、l1～l3、m1～m3、n1～n3、o1～o3、p1～p3、q1～q3；表1：PCR檢測引物(2)外周血樣品的處理本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料是收集某醫(yī)院收治并經(jīng)病理證實(shí)的肝癌患者外周血，清晨7點(diǎn)，空腹，經(jīng)肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4小時。1.將抗凝管中的全血樣本加入等體積PBS(pH7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.加入等體積氯化銨紅細(xì)胞裂解液(可購自碧云天)，于室溫20rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；3.將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；4.吸棄上清，取細(xì)胞沉淀，洗滌，即得到PBMC；5.取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保護(hù)劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取1.取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混勻；2.將裂解液轉(zhuǎn)移至gDNA清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.加入1倍體積的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混勻；4.將樣品轉(zhuǎn)移至RNeasyMinElute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；5.在RNeasyMinElute離心柱中加入700μLBufferRW1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；6.在RNeasyMinElute離心柱中加入500μLBufferRPE，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；7.將RNeasyMinElute離心柱置于新的2mL收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發(fā)；8.將RNeasyMinElute離心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫RNA。(4)模板cDNA的獲得1.準(zhǔn)確測得樣品RNA濃度；2.嚴(yán)格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系；成分體積5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL輕柔混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機(jī)短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cDNA；(5)普通PCR擴(kuò)增用TaqDNA聚合酶配置反應(yīng)體系，，用引物為a-q和人內(nèi)參基因(B2M)進(jìn)行PCR擴(kuò)增各樣品，產(chǎn)物1％凝膠檢測；擴(kuò)增體系成分體積2×Mix10μLcDNA2μL引物-F0.8μL引物-R0.8μLRNase-freeH2O6.4μLPCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性3分鐘，1個循環(huán)；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計的特異引組a-q，通過熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下：95℃預(yù)變性20s，1個循環(huán)；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)；每管設(shè)立三個復(fù)孔；根據(jù)步驟5和6的PCR結(jié)果，篩選出以下引物組，作為本發(fā)明用于檢測肝癌的引物組。實(shí)施例3：效果驗(yàn)證根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對100個腫瘤樣本進(jìn)行檢測。其中，EGFR的正向引物為GACTTCCAGAACCACCTGGG，反向引物為TGCAGCACACTGGTTGTGGC，CEA的正向引物為ACAGTCACGACGATCACAGT，反向引物為CAGCTGCAGCCTGGGACTGA，MUC1的正向引物為GCCTCTCGATATAACCTGAC，反向引物為TCGGCGGCACTGACAGACAG。1～8號引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數(shù)量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進(jìn)一步地，通過比較5～8號引物組可以發(fā)現(xiàn)，引物組內(nèi)的組合對于檢出率的高低有重要影響。同時在相同的檢測基因數(shù)量情況下，5號引物組的檢出率高于6～8號引物組。因此，我們優(yōu)選5號引物組的基因組合用于肝癌的檢測。進(jìn)一步通過研究發(fā)現(xiàn)，5號引物組中，AFP可以在大約80％的肝癌患者血清中升高，在生殖細(xì)胞腫瘤出現(xiàn)AFP陽性率為50％。在其它腸胃管腫瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出現(xiàn)不同程度的升高。EPCAM是一種由GA-733-2基因編碼的分子量為40kDa的跨膜糖蛋白，作為嗜同種的鈣非依賴性的上皮細(xì)胞間粘附分子在上皮癌變過程中發(fā)揮著作用。GPC3基因定位于人染色體X26.10，它參與了生長、發(fā)育以及細(xì)胞對生長因子的反應(yīng)等生命過程。人端粒酶(humantelomerase)是一種核糖核酸酶，由模板RNA(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(hTEP1)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)構(gòu)成。端粒酶的激活是細(xì)胞永生化過程中的重要事件之一，和腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，因而端粒酶的激活機(jī)制研究日益受到重視。由上可知，本發(fā)明并不是將17對引物進(jìn)行簡單疊加組合，17對引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術(shù)效果。綜上所述，本發(fā)明中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測出肝癌的細(xì)胞生物學(xué)特征。實(shí)施例4：特異性分析根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對正常人外周血樣本(圖1)、非肝癌病人的外周血(圖2)和腫瘤組織樣本(圖3)、肝癌病人的外周血(圖4)和組織樣本(圖5)進(jìn)行檢測。圖中1-17基因分別為：1.B2M；2.AFP、3.GPC3、4.AFU、5.GOLPH2、6.IGF-II、7.EpCAM、8.hTERT、9.MAGE1、10.MAGE3、11.CD90、12.CD133、13.CK19、14.CD10、15.ASGPR、16.CPS1、17.HER2、18.FolateReceptor。檢測結(jié)果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非肝癌病人的外周血(圖2)和腫瘤組織樣本(圖3)中均未或較弱檢測到基因的表達(dá)，而在肝癌病人的外周血(圖4)和組織樣本(圖5)中可檢測到多個基因的強(qiáng)表達(dá)，分別是14/18和16/18，說明本發(fā)明中所述引物組具有高度的特異性。當(dāng)前第1頁1 2 3