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一種皮膚及毛囊再生的氣液界面三維培養(yǎng)方法與流程

文檔序號(hào):11899067閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種皮膚及毛囊再生的氣液界面三維培養(yǎng)方法,其特征在于:所述方法通過培養(yǎng)觸須毛囊外根鞘使毛囊再生,并重建毛囊的三維形態(tài),利用新生毛囊存活時(shí)間較長,新生形態(tài)規(guī)整,毛囊不易塌陷的特點(diǎn),培養(yǎng)小室模擬機(jī)體環(huán)境,培養(yǎng)毛囊外根鞘及胚胎皮膚。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括:

S1:制作氣液界面支架

使用40μL鼠尾I型膠原蛋白混合等量PBS,無菌條件下均勻涂抹在一次性的90mm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)壁上,無菌眼科鑷夾取Nuclepore聚碳酸酯膜,平鋪在涂滿鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中,封口膜封住培養(yǎng)皿,紫外線照射30min,待其鼠尾I型膠原蛋白和Nuclepore聚碳酸酯膜自然干燥后,放入4℃冰箱備用;

S2:制備培養(yǎng)液

使用低糖MEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,加入胎牛血清FCS,制作成5%FCS+MEM的培養(yǎng)液,2mL的5%FCS+MEM培養(yǎng)液中加入青鏈霉素100mg,培養(yǎng)毛囊外根鞘時(shí)加入BFGF(成纖維細(xì)胞堿性生長因子)10ng/mL,培養(yǎng)胚胎皮膚時(shí)加入EGF(表皮生長因子)8ng/mL;

S3:獲取觸須毛囊外根鞘并培養(yǎng)

斷頸法處死新生1-5d的乳鼠,整個(gè)乳鼠放入75%酒精中消毒,然后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái),在解剖顯微鏡下用眼科剪沿乳鼠嘴角剪下雙側(cè)觸須部皮膚組織,把皮膚組織放入無菌MEM培養(yǎng)液中,在無菌液體三維環(huán)境下利用眼科鑷,分離出完整的觸須毛囊,利用眼科顯微外科刀切除毛囊毛球部部分,拔出毛囊內(nèi)根鞘,不損傷毛囊外根鞘的中上部,獲得的形態(tài)完整的毛囊外根鞘中上部,保留毛囊隆突部的完整性;

S4:獲取并培養(yǎng)胚胎皮膚

在30mm培養(yǎng)皿中加入2mL配比好的培養(yǎng)液,將處理好的Nuclepore聚碳酸酯膜漂浮在培養(yǎng)液之上,利用無菌眼科鑷把毛囊外根鞘轉(zhuǎn)移到漂浮的Nuclepore聚碳酸酯膜上,放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法,其特征在于:S1中所述氣液界面的材料采用Nuclepore聚碳酸酯微孔膜,皮重輕,可漂浮,不污染培養(yǎng)液,所述的Nuclepore聚碳酸酯膜,由高質(zhì)量聚碳酸酯薄膜制成,每張Nuclepore聚碳酸酯膜成圓形,規(guī)格不同,孔徑不同。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法,其特征在于:S1中所述支架由Nuclepore聚碳酸酯微孔膜經(jīng)過I型鼠尾膠原蛋白處理制得。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法,其特征在于:S2中所述培養(yǎng)添加物為干細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU,激素,抗生素或細(xì)胞因子。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法,其特征在于:S2中所述氣液界面培養(yǎng)中的培養(yǎng)基為DMEM、MEM或RPMI-1640培養(yǎng)液。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法,其特征在于:S2中所述胎牛血清選用滅活支原體的進(jìn)口胎牛血清。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法,其特征在于:S3中所述小鼠觸須毛囊的獲取時(shí)間選取小鼠剛出生的1-5d,用于獲取小鼠觸須毛囊外根鞘,所述小鼠觸須毛囊外根鞘培養(yǎng)選取時(shí)間是1-6d。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法,其特征在于:S4中所述胎鼠皮膚獲取時(shí)間是E14-E17d,所述胎鼠皮膚培養(yǎng)選取時(shí)間是1-7d。

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