本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及與原發(fā)性膽汁性膽管炎關(guān)聯(lián)的白細(xì)胞介素21(IL21)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)，舊稱原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)，是一種累及肝內(nèi)膽管系統(tǒng)的慢性進(jìn)展性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性破壞伴門脈炎癥性改變，最終導(dǎo)致纖維化及肝硬化。本病主要發(fā)生于中年以上女性，男性病例僅占10％。隨著對(duì)PBC疾病認(rèn)識(shí)的不斷提高和診斷方法的建立，PBC的發(fā)病率和患病率在全球呈上升趨勢(shì)。2003年，在上海地區(qū)對(duì)5011個(gè)健康體檢者的(26-85歲)PBC特異性抗線粒體抗體(AMA)(PDC-E2)進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)AMA陽(yáng)性率高于0.16％，在中年女性中高于0.3％[5]。2006年，在廣東地區(qū)對(duì)8126個(gè)成年人(18-83歲)的普查中發(fā)現(xiàn)AMA(PDC-E2)的陽(yáng)性率高于0.05％，在中年女性中高于0.15％。最近在上海地區(qū)對(duì)19012個(gè)居民的AMA篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.40％的男性和0.94％的女性AMA陽(yáng)性，其中25人(0.13％)患有PBC。隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，PBC在我國(guó)將迅速發(fā)展成一種較常見的疾病，在2025年可能達(dá)到20-30萬(wàn)患者，到2050年可能高達(dá)35-50萬(wàn)患者。

早期診斷和治療是控制PBC疾病發(fā)展的最有效手段。目前對(duì)PBC的治療缺少有效的辦法，熊去氧膽酸是唯一對(duì)早期PBC患者(尤其是黃疸沒有出現(xiàn)的患者)進(jìn)行有效控制的藥物，但無(wú)治愈作用，而挽救晚期PBC患者的唯一手段是實(shí)施肝臟移植。我國(guó)是病毒性肝炎高發(fā)的國(guó)家，PBC的臨床癥狀與病毒性肝炎相似，PBC患者早期常被誤診為病毒性肝炎或藥物性肝炎，嚴(yán)重影響了PBC患者的診療。因此，對(duì)PBC患者進(jìn)行早期診斷和治療，具有重要的社會(huì)意義。

PBC具有很強(qiáng)的遺傳易感性，患者的第一代親屬的PBC發(fā)病率比一般人群高100倍。綜合北美、歐洲和日本的報(bào)道，PBC的家族發(fā)病率為3.8-9％。2005年，一項(xiàng)在北美的大規(guī)模調(diào)查結(jié)果顯示，PBC病人直系親屬發(fā)病的相對(duì)危險(xiǎn)度(odds ratio)高達(dá)10.7。通過PBC患者的同卵雙生子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其共同發(fā)病率達(dá)63％。我們團(tuán)隊(duì)在過去四年對(duì)國(guó)內(nèi)PBC患者的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了3對(duì)同卵雙生的PBC患者，三對(duì)患者的姐妹發(fā)病癥狀和發(fā)病時(shí)間都非常接近，結(jié)合國(guó)際已有數(shù)據(jù)，PBC患者的同卵雙生子共同發(fā)病率高達(dá)72.7％。

自2009年以來，對(duì)白人PBC患者全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的一系列結(jié)果顯示PBC具有很強(qiáng)的遺傳易感性。以申請(qǐng)人為核心成員的北美PBC合作組采用GWAS和特定位點(diǎn)高密度基因多態(tài)性分析的方法，對(duì)北美PBC患者和對(duì)照人群進(jìn)行隊(duì)列分析，證實(shí)了PBC的遺傳易感性與HLA-II類抗原、IL12A、IL12RB2、STAT4、IRF5、ch17q12-21、MMEL1和SPIB等位點(diǎn)密切相關(guān)，而且揭示了IL12信號(hào)傳導(dǎo)通路和Toll-like受體(TLR)/TNF信號(hào)傳導(dǎo)通路的異?？赡軐?dǎo)致PBC的發(fā)生。日本學(xué)者的小規(guī)模的GWAS研究也發(fā)現(xiàn)了TNFSF15位點(diǎn)與PBC密切相關(guān)。我國(guó)對(duì)PBC的遺傳學(xué)研究已有一定的基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)的學(xué)者分別就HLA和CTLA4等基因位點(diǎn)與漢族PBC遺傳易感性進(jìn)行了初步研究。

我們啟動(dòng)并完成了對(duì)1122例漢族PBC樣品的Illumina中華芯片掃描工作，結(jié)合4046例對(duì)照數(shù)據(jù)，進(jìn)行了大規(guī)模的隊(duì)列分析，在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了IL21的基因位點(diǎn)達(dá)到了GWAS顯著性，并首次發(fā)現(xiàn)IL21在PBC患者血液中異常高表達(dá)，其表達(dá)程度與肝臟組織纖維化程度呈正比。

目前國(guó)際上尚無(wú)專利文獻(xiàn)提及IL21基因位點(diǎn)以及IL21與PBC的關(guān)系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供了IL21在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)、篩查或預(yù)測(cè)原發(fā)性膽汁性膽管炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供了一系列與原發(fā)性膽汁性膽管炎顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)，并找出其中與原發(fā)性膽汁性膽管炎易感性關(guān)聯(lián)最顯著的代表性位點(diǎn)，從而提供將所述的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)用于評(píng)估原發(fā)性膽汁性膽管炎易感性的用途。

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供了IL21在制備PBC動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供了IL21在制備PBC治療藥物方面的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：第一方面，提供了IL21在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)、篩查或預(yù)測(cè)原發(fā)性膽汁性膽管炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用。我們啟動(dòng)并完成了對(duì)1122例漢族PBC樣品的Illumina中華芯片掃描工作，結(jié)合4036例對(duì)照數(shù)據(jù)，進(jìn)行了大規(guī)模的隊(duì)列分析，在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了IL21的基因位點(diǎn)達(dá)到了GWAS顯著性，并首次發(fā)現(xiàn)IL21在PBC患者肝臟組織中表達(dá)程度與肝臟組織纖維化程度呈正比；具體通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)IL21的基因多態(tài)性與PBC發(fā)病有密切關(guān)系。

第二方面提供了一系列與原發(fā)性膽汁性膽管炎易感性顯著相關(guān)的IL21的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，通過對(duì)1122例中國(guó)漢族PBC患者樣品和4036例正常人樣品為研究對(duì)象，使用了HumanOmniZhongHua-8(v1.1)掃描進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行基因多態(tài)性(SNP)的分型，利用芯片得到的數(shù)據(jù)，采用PLINK軟件對(duì)所有多態(tài)位點(diǎn)的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)IL21基因的多個(gè)SNP的頻數(shù)在PBC和正常人群中有顯著差異。與原發(fā)性膽汁性膽管炎易感性顯著相關(guān)的IL21的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)為：rs17005934，等位基因?yàn)镃/T；rs17005953，等位基因?yàn)門/C；rs28517551，等位基因?yàn)锳/G；rs925550，等位基因?yàn)锳/C；rs60318098，等位基因?yàn)镚/A；rs1026157，等位基因?yàn)镚/T；rs6811183，等位基因?yàn)門/G。

第三方面，本發(fā)明通過對(duì)IL21位點(diǎn)的SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)SNP與rs925550，rs17005934的連鎖關(guān)系。采用Sequenom的iPlex方法，針對(duì)其中rs925550，rs17005934多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)；并使用Impute2和PLINK軟件，邏輯回歸原理進(jìn)行，以性別為共變量，按疊加效應(yīng)模型分析；同樣發(fā)現(xiàn)有顯著差異；表1中的所有SNP均為在PBC和對(duì)照間有顯著差別的基因多態(tài)位點(diǎn)，可用于對(duì)PBC的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)。

第四方面，本發(fā)明通過使用PLINK軟件，邏輯回歸原理進(jìn)行分析評(píng)估每個(gè)SNP位點(diǎn)與原發(fā)性膽汁性膽管炎的關(guān)系，計(jì)算危險(xiǎn)等位基因的相對(duì)危險(xiǎn)度(Odd ratio，OR)和95％的可信區(qū)間，得到這一系列SNP位點(diǎn)的危險(xiǎn)等位基因。IL21的SNP位點(diǎn)的危險(xiǎn)等位基因分別是：rs17005934多態(tài)性位點(diǎn)為C；s17005953，多態(tài)性位點(diǎn)為T；rs28517551多態(tài)性位點(diǎn)為A；rs925550多態(tài)性位點(diǎn)為A；rs60318098多態(tài)性位點(diǎn)為G；rs1026157，多態(tài)性位點(diǎn)為G；rs6811183多態(tài)性位點(diǎn)為T。

第五方面，本發(fā)明通過對(duì)IL21特異的組織化學(xué)分析對(duì)30例PBC患者，30例自身免疫肝炎患者(AIH)，25例慢性乙型肝炎患者(CHB)，和6例健康對(duì)照(HC)的肝臟組織切片進(jìn)行IL21蛋白的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)IL21在PBC患者肝臟組織中顯著升高(P<0.01)，IL21的表達(dá)水平與PBC患者肝臟組織的炎癥程度和纖維化程度呈正相關(guān)。

第六方面，本發(fā)明建立的動(dòng)物模型中引入IL21表達(dá)制備PBC動(dòng)物模型，并將此模型用于PBC治療藥物的篩選。

有益效果：本發(fā)明具有如下的特色和優(yōu)點(diǎn)：

1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)IL21的多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)與PBC的發(fā)生顯著相關(guān)，可用于PBC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的指標(biāo)之一。

2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IL21在PBC患者肝臟組織中顯著升高，是可用于PBC靶向治療的靶點(diǎn)。

3)發(fā)明的發(fā)現(xiàn)有可能通過在動(dòng)物模型中引入慢性IL21表達(dá)制備PBC動(dòng)物模型，并將此模型用于PBC治療藥物的篩選。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中所確定的IL21基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與PBC的關(guān)聯(lián)圖；圖1中：橫坐標(biāo)“Position on chr”為染色體上的位置(單位Mb)；縱坐標(biāo)為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與PBC的關(guān)聯(lián)顯著性P值(-log10(p-value))，右側(cè)Recombination rate為重組率，單位(CM/Mb)；代表位點(diǎn)rs925550以◆表示。

圖2為實(shí)施例3中組織化學(xué)分析IL21在30例PBC患者，30例自身免疫肝炎(AIH)患者，25例慢性乙型肝炎(CHB)患者，和6例健康對(duì)照(HC)的肝臟組織切片中的表達(dá)。圖2A為實(shí)施例3中在1例PBC患者組織肝臟組織切片的IL21的表達(dá)。圖2B為實(shí)施例3中在1例AIH患者組織肝臟組織切片的IL21的表達(dá)。圖2C為實(shí)施例3中在1例CHB患者組織肝臟組織切片的IL21的表達(dá)。圖2D為實(shí)施例3中在1例HC組織肝臟組織切片的IL21的表達(dá)。圖2E為實(shí)施例3中IL21在30例PBC患者，30例AIH患者，25例慢性乙型肝炎(CHB)患者，和6例健康對(duì)照(HC)的肝臟組織切片中的表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(**為P<0.01，*為P<0.05)。圖2F為實(shí)施例3中IL21在30例PBC患者的肝臟組織切片中的表達(dá)與PBC患者的肝臟組織炎癥程度相關(guān)性的分析結(jié)果。圖2G為實(shí)施例3中IL21在30例PBC患者的肝臟組織切片中的表達(dá)與PBC患者的肝臟組織纖維化程度相關(guān)性的分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

本發(fā)明實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑及配方如下：

主要實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑：

1、原發(fā)性膽汁性膽管炎患者和正常對(duì)照人群的DNA樣品和血清；

2、全基因組關(guān)聯(lián)分析芯片分析試劑盒：由Illumina公司生產(chǎn)的HumanOmniZhongHua-8(v1.1)分析試劑盒包括芯片和試劑。

主要溶液配制：

1、磷酸緩沖液(PBS，1L)：8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.628g Na₂HPO₄·12H₂O，雙蒸水定容至1L；

2、飽和氯化鈉溶液(5M NaCl，1L)：292.5g NaCl，雙蒸水溶解定容至1L；

3、1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)：30.3g Tris base溶于200ml雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至250ml；

4、0.5M EDTA(PH 8.0)：36.5g EDTA溶于NaOH溶液中，調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至250ml；

5、核裂解緩沖液(Nuclei Lysis Buffer，500ml)：40ml 5M NaCl，2ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，5ml 1M Tris-HCl(pH 8.0)，453ml雙蒸水；

6、蛋白酶K緩沖液(Proteinase K buffer，100ml)：50ml glycerol，100ul 1M Tris-HCl(pH 7.5)，200μl 1M CaCl₂，47ml雙蒸水；

7、蛋白酶K(Proteinase K Solution，10mg/ml)：100mg蛋白酶K粉末溶于10ml蛋白酶K緩沖液中；

8、消化液(Nuclei-SDS-Proteinase K-Master Mix Lysis buffer，504ml)：420ml Nuclei Lysis Buffer，3.5ml Proteinase K(10mg/ml)，17.5ml 10％SDS，0.35ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，62.65ml雙蒸水；

9、TE緩沖液(PH 8.0)：1ml 1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，0.2ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，雙蒸水定容至100ml；

10、6×DNA點(diǎn)樣緩沖液(10ml):88mg EDTA，5mg溴酚藍(lán)，5mg二甲苯青，溶于4ml雙蒸水中，再加入3.6ml甘油后使用NaOH調(diào)節(jié)至PH7.0，定容至10ml；

11、50×TAE緩沖液：242g Tris-base，57.1ml冰乙酸，200ml 0.5M EDTA(PH 8.0)，雙蒸水定容至1L。

實(shí)施例1全基因組關(guān)聯(lián)分析

本發(fā)明通過下述方法和步驟發(fā)現(xiàn)IL21基因位點(diǎn)與原發(fā)性膽汁性膽管炎的關(guān)聯(lián)。

一、方法

首先在中國(guó)漢族人群中選取了1122例中國(guó)漢族PBC患者樣品和4036例正常人樣品為研究對(duì)象，進(jìn)行HumanOmniZhongHua-8(v1.1)掃描，進(jìn)行基因多態(tài)性(SNP)的分型，采用PLINK軟件對(duì)所有多態(tài)位點(diǎn)的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)IL21基因的多個(gè)SNP的頻數(shù)在PBC和正常人群中有顯著差異。

二、病例和對(duì)照樣本入選標(biāo)準(zhǔn)

所有納入研究的PBC患者均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1)、所有患者均為漢族；2)、AMA-M2血清學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性；3)、生化指標(biāo)顯示膽汁淤積證據(jù)，主要表現(xiàn)為ALP，GGT升高；5)、各類肝炎病毒感染以及人類免疫缺陷病毒感染指標(biāo)陰性(乙肝病毒表面抗原陰性、血清中乙肝病毒DNA小于200拷貝數(shù)/毫升、血清中丙肝病毒RNA小于500拷貝數(shù)/毫升、戊肝抗原陰性、人類免疫缺陷病毒抗體陰性)；6)、無(wú)血吸蟲感染史；7)病人主訴飲酒量小于100ml/日。

全基因組掃描對(duì)照人群樣品來自安徽，江蘇，山東的正常體檢人群，生化指標(biāo)正常，無(wú)臨床疾病表征，自述體健。病例是22～85歲之間篩選，平均年齡為54.7歲；對(duì)照為15歲到96歲之間篩選，平均年齡為34.8歲。

三、測(cè)試人群的基本特征

測(cè)試人群為芯片檢測(cè)樣本其基本特征如下：

表1

四、原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)患者和正常對(duì)照人群的基因組DNA樣品的制備

1、病人和正常人的非抗凝血由各醫(yī)院采集在非抗凝血收集管中。將收集管離心，分離血清和血凝塊。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將解凍的血樣上層的血清用移液器輕輕混勻，均分裝入4個(gè)1.5ml螺蓋保存管，保存于-80℃。

2、用長(zhǎng)柄勺取出分離膠，將血塊倒入稱量舟，用剪刀將血塊充分剪碎，再用塑料吸管將碎血塊轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。

3、用PBS緩沖液沖洗稱量舟及采血管，回收清洗液至50ml離心管，用塑料吸管混勻液體，離心，2500rpm，15min，4℃，棄上清。

4、加5ml消化液，混勻，放入水浴恒溫振蕩器，50℃，200rpm，過夜消化。

5、消化完全后加1.5ml 5M NaCl，混勻；室溫靜置10min,期間顛倒混勻多次，離心，3800rpm，30min，室溫。

6、轉(zhuǎn)移上清于50ml離心管，加2倍體積無(wú)水乙醇，充分混勻。

7、用移液器將可見的絮狀DNA沉淀轉(zhuǎn)移至含有500μl 70％乙醇的2ml EP管進(jìn)行清洗。

8、離心，13000rpm，5min，室溫，棄上清；再離心，13000rpm，1min，室溫，用移液器棄盡殘液，晾干，用雙蒸水溶解。

五、HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片掃描分型和全基因組關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)分析

HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片購(gòu)自ILLUMINA公司，分型按照產(chǎn)品方法要求進(jìn)行。具體操作嚴(yán)格步驟按Illumina公司HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，相關(guān)描述可同樣見發(fā)表的文獻(xiàn)[Adler,A.J.,Wiley,G.B.,Gaffney,P.M.Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications.J.Vis.Exp.(81),e50683,doi:10.3791/50683(2013).]。每個(gè)DNA樣品采用200納克(ng)，嚴(yán)格按照Illumina公司HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片的說明實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理。

HumanOmniZhongHua-8(v1.1)芯片分型數(shù)據(jù)由ILLUMINA公司的BeadStudio軟件處理并輸出，關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)分析按發(fā)表的文獻(xiàn)同樣進(jìn)行[Zuo,X.et al.Whole-exome SNP array identifies 15new susceptibility loci for psoriasis.Nat Commun 6,6793，2015]。BeadStudio輸出的分型數(shù)據(jù)采用PLINK分析，根據(jù)狀態(tài)同一配對(duì)原理(pairwise identity-by-state)，排除重復(fù)樣品和親緣樣品。采用smartpca軟件，根據(jù)主成分分析原理(principal component analysis)，排除群體異質(zhì)樣品，共有1,122PBC病人和4,036正常對(duì)照的結(jié)果，用于統(tǒng)計(jì)分析。排除分型成功率低于98％的SNP，排除在分析樣品中頻率(minor allele frequency，MAF)低于0.01的SNP，排除在正常對(duì)照樣品中Hardy–Weinberg equilibrium值P<1×10^-4的SNP。經(jīng)過排除，共有776,516個(gè)常染色體的SNP用于比較。采用PLINK軟件，SNP相關(guān)分析采用線性回歸的原理，以性別為共變量(covariate)，采用加性效應(yīng)原理(additive allelic effect)，評(píng)估每個(gè)SNP位點(diǎn)與PBC關(guān)聯(lián)的顯著性，計(jì)算危險(xiǎn)等位基因的相對(duì)危險(xiǎn)度(Odds ratio,OR)和95％的可信區(qū)間，分析中直接獲得OR值、可信區(qū)間和P值，從而得到所述位點(diǎn)的危險(xiǎn)等位基因。通過全基因組關(guān)聯(lián)(GWAS)分析計(jì)算獲得SNP芯片中每個(gè)位點(diǎn)與PBC關(guān)聯(lián)顯著性水平(P值)，按照顯著性水平(P值小于0.0001)找出與PBC之間存在潛在關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，并得到PBC易感性顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其等位基因。SNP的推算(Imputation)是以千人基因組項(xiàng)目中漢族人結(jié)果為參考值(Reference)，采用IMPUTE2軟件，結(jié)合1,122PBC病人和4,036正常對(duì)照的結(jié)果進(jìn)行推算。

分析結(jié)果參見表2和圖1，結(jié)果顯示在IL21基因區(qū)，有7個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(rs17005934，rs17005953，rs28517551，rs925550，rs60318098，rs1026157，rs6811183)的疾病相關(guān)單倍體頻率在PBC中顯著高于對(duì)照人群，p值為p值小于1.07×10^-5。這一系列單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其等位基因是：rs17005934，等位基因?yàn)镃/T；rs17005953，等位基因?yàn)門/C；rs28517551，等位基因?yàn)锳/G；rs925550，等位基因?yàn)锳/C；rs60318098，等位基因?yàn)镚/A；rs1026157，等位基因?yàn)镚/T；rs6811183，等位基因?yàn)門/G；其中危險(xiǎn)等位基因分別是：rs17005934多態(tài)性位點(diǎn)為C；rs17005953多態(tài)性位點(diǎn)為T；rs28517551多態(tài)性位點(diǎn)為A；rs925550多態(tài)性位點(diǎn)為A；rs60318098多態(tài)性位點(diǎn)為G；rs1026157多態(tài)性位點(diǎn)為G；rs6811183多態(tài)性位點(diǎn)為T。攜帶這些危險(xiǎn)等位基因的個(gè)體發(fā)生PBC的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)是沒有攜帶者的1.24-1.27倍。

IL21基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)序列：

如序列表中的SEQ ID NO.1所示：

rs17005934

AATGACTAATTAACAAAGTGCAGACCAGGAAAACACAGACTC[C/T]GTGAGATTTACCAAATTGGCTCCAAGACTACCCTGAAGTCACCCTTT

如序列表中的SEQ ID NO.2所示：

rs17005953

TTCACCCAGGCGTCATGAAAATAGGTGACCTTGGTTCTAGAAAATTATGA[T/C]GATGACTTCCCTATAGTTACATCCACCCAAAAAAGCCTG

如序列表中的SEQ ID NO.3所示：

rs28517551

ACGGGCATATCCCCAGCAGAGATGA[A/G]GAGTAGCCCTCCCAAGGGACGCTGC如序列表中的SEQ ID NO.4所示：

rs925550

AAAATCACATATTGTGCTACAAAATTAATATCTATCAAA[A/C]TGAATTTTATATTGGCTTCATTTGCCCTTTCTCCTTGTCCACAGA

如序列表中的SEQ ID NO.5所示：

rs60318098

GTATATATGTAGGTTTATGTTTTAT[A/G]TACTATCTCATTGGTTGGTTGTTGT

如序列表中的SEQ ID NO.6所示：

rs1026157

GGATGTTGACTGCATTGAATAGAAA[T/G]GCATCATGGCCAACCAAGAAGAGGT

如序列表中的SEQ ID NO.7所示：

rs6811183

CTGATTCACACGCTTGAGGGGAAGA[T/G]TGCTGGAAAGTAGTAAAATAGAGCG

表2與原發(fā)性膽汁性膽管炎顯著關(guān)聯(lián)的IL21基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)

其中“OR(95％CI)”，表示與攜帶正常的單倍體的個(gè)體相比，攜帶疾病相關(guān)單倍體的個(gè)體發(fā)生PBC的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。染色體位置為參照Human Genome GRCh37/hg19.。

實(shí)施例2rs17005934，rs925550的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過針對(duì)rs17005934，rs925550在907個(gè)PBC患者和2027個(gè)正常對(duì)照的驗(yàn)證，同樣發(fā)現(xiàn)有顯著差異。PBC患者驗(yàn)證樣品與實(shí)施例1中的標(biāo)準(zhǔn)一樣；正常對(duì)照樣品來自東南大學(xué)教師體檢，生化指標(biāo)正常，B超檢查無(wú)肝脾異常，無(wú)臨床疾病表征，自述體健。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)施中的材料和時(shí)間如無(wú)說明，均由Sequenom公司提供。

1、驗(yàn)證IL21基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)序列

rs17005934序列

AATGACTAATTAACAAAGTGCAGACCAGGAAAACACAGACTC[C/T]GTGAGATTTACCAAATTGGCTCCAAGACTACCCTGAAGTCACCCTTTTGGTTTGC

rs925550序列

AAAATCACATATTGTGCTACAAAATTAATATCTATCAAA[A/C]TGAATTTTATATTGGCTTCATTTGCCCTTTCTCCTTGTCCACAGA

2、引物設(shè)計(jì)

使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design軟件設(shè)計(jì)待測(cè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，并交由Integrated DNA Technologies合成。

設(shè)計(jì)使用DNA引物和探針如下：

rs17005934：

引物1序列，ACGTTGGATGAAAGTGCAGACCAGGAAAAC；

引物2序列，ACGTTGGATGAAAGGGTGACTTCAGGGTAG；

探針序列，GACCAGGAAAACACAGACTC

rs925550：

引物1序列，ACGTTGGATGGGGAGGGTAATTAAAATTAG；

引物2序列，ACGTTGGATGGGGCAAATGAAGCCAATATA；

探針序列，tTGCTACAAAATTAATATCTATCAAA

3、PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增采用多重PCR技術(shù)，在384孔板中進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)體系總體積為5μl。在一個(gè)新的1.5ml EP管中配制PCR master mix溶液。

配制PCR master mix液：

PCR Mix對(duì)每個(gè)反應(yīng)，μL

10×PCR Buffer 0.5μL

MgCl₂(25mM)0.4μL

dNTP mix(25mM)0.1μL

HotStar Taq(5U/μL)0.1μL

Water 1.9μL

PCR primer mix(引物1和2各0.5pmol)1μL

Total Volume 4μL

使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為4μL，在384孔板的每個(gè)加樣孔中加入PCR master mix液。該384孔板即為PCR反應(yīng)板。取出已經(jīng)制備好的DNA樣品384孔板，使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為1μL，每個(gè)5μlPCR反應(yīng)體系中包含模板DNA 20-50ng，Hotstar Taq 0.5U，每條擴(kuò)增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs。在兼容384孔板的PCR儀上設(shè)定PCR反應(yīng)條件為：94℃4分鐘；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分鐘，45個(gè)循環(huán)；72℃3分鐘；4℃保持。將384孔PCR反應(yīng)板放置于PCR儀上，啟動(dòng)PCR反應(yīng)。

4、PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理

在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。

(1)配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)液，SAP Mix。

SAP Mix對(duì)每個(gè)反應(yīng)，μL

H₂O1.53

SAP Buffer(10x)0.17

SAP Enzyme(1.7U/μL)0.3

Total Volume 2

(2)使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為2μL，將SAP Mix加入384孔PCR反應(yīng)板。對(duì)于每個(gè)堿性磷酸酶處理反應(yīng)孔，反應(yīng)體系總體積為7μl，其中PCR產(chǎn)物5μl，SAP Mix 2μl。

(3)將384孔板放置在兼容384孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件：37℃40分鐘；85℃5分鐘；4℃維持，啟動(dòng)PCR儀進(jìn)行堿性磷酸酶處理。

5、單堿基延伸

(1)在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積9μl。

(2)配制單堿基延伸反應(yīng)液，EXTEND Mix。

EXTEND Mix對(duì)每個(gè)反應(yīng)，μl

(3)使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為2μL，將EXTEND Mix對(duì)應(yīng)加入384孔反應(yīng)板。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)孔，單堿基延伸反應(yīng)體系包含SAP處理后PCR產(chǎn)物7μl及EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反應(yīng)引物混合物0.94μl，iPLEX酶0.041μl，延伸混合物0.2μl)。

(4)將384孔板放置在兼容384孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件：

I.94℃for 30seconds；

II.94℃for 5seconds；

III.52℃for 5seconds；

IV.80℃for 5seconds；

V.GOTO III，4more times；

VI.GOTO II，39more times；

VII.72℃for 3minutes；

VIII.4℃forever；

啟動(dòng)PCR儀進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。

6、樹脂純化

(1)將Clean Resin樹脂平鋪到6mg的樹脂板中；

(2)加16μl水到延伸產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)孔內(nèi)；

(3)將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速垂直旋轉(zhuǎn)30分鐘，使樹脂與反應(yīng)物充分接觸；

(4)離心使樹脂沉入孔底部。

7、芯片點(diǎn)樣

啟動(dòng)MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP芯片上。

8、質(zhì)譜檢測(cè)

將點(diǎn)樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)分析，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER 4.0軟件(sequenom)分型并輸出結(jié)果。共907個(gè)PBC樣品和2127個(gè)對(duì)照樣品得到了有效的結(jié)果。

采用PLINK軟件，邏輯回歸原理進(jìn)行，以性別為共變量，按疊加效應(yīng)模型對(duì)907個(gè)PBC樣品和2127個(gè)對(duì)照樣品的結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。rs17005934的疾病相關(guān)單倍體(G)頻率在PBC中(0.428)顯著高于對(duì)照人群(0.362)，p值為1.25×10^-6。rs925550的疾病相關(guān)單倍體(A)頻率在PBC中(0.427)顯著高于對(duì)照人群(0.353)，p值為7.44×10^-8。將1,122PBC病人和4,036正常對(duì)照的GWAS結(jié)果，與在907個(gè)PBC樣品和2127個(gè)對(duì)照樣品的結(jié)果進(jìn)行疊加分析，采用fixed-effect model(I2<25％)的原理，統(tǒng)計(jì)分析共包括2029個(gè)PBC樣品和6163個(gè)對(duì)照樣品。結(jié)果表明：rs17005934的疾病相關(guān)單倍體(G)頻率在PBC中顯著高于對(duì)照人群，p值為1.06×10^-11，相對(duì)危險(xiǎn)度(odds ratio)值(96％CI)為1.29(1.21-1.39)；rs925550的疾病相關(guān)單倍體(A)頻率在PBC中顯著高于對(duì)照人群，p值為3.87×10^-13，相對(duì)危險(xiǎn)度值(96％CI)為1.31(1.21-1.40)(見表3)。

表3：IL21多態(tài)位點(diǎn)rs17005934和rs925550在全基因組關(guān)聯(lián)分析和驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)中的結(jié)果

實(shí)施例3原發(fā)性膽汁性膽管炎患者肝臟組織中IL21的表達(dá)分析

所有肝組織，包括30例PBC患者，30例自身免疫肝炎(AIH)患者，25例慢性乙型肝炎(CHB)患者均為在上海仁濟(jì)醫(yī)院超聲指導(dǎo)的肝活檢組織。6例健康對(duì)照(HC)的肝臟組織來自肝臟移植供體。肝組織經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋保存。肝組織的炎癥和纖維化程度按照“Scheuer”評(píng)分系統(tǒng)評(píng)定。

1、肝組織切片在檸檬酸鈉緩沖液中浸泡20分鐘；

2、加入1：200稀釋的抗IL21抗體(ab5978，Abcam，Cambridge，USA)，室溫保持20分鐘；

3、用磷酸鈉緩沖液清洗玻片；

4、加入1：2000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(全自動(dòng)免疫組化機(jī)二抗組合，47101，Leica)，采用Leica全自動(dòng)免疫組化機(jī)進(jìn)行免疫組化染色操作；

5、對(duì)染色的玻片進(jìn)行分析，在40*10放大的顯微鏡下隨即選取5個(gè)鏡下區(qū)域，記錄染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，最終結(jié)果按平均值加標(biāo)準(zhǔn)差表述。Mann–Whitney U分析原理(Mann–Whitney U-test)用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，P值小于0.05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。所有分析采用Prism軟件系統(tǒng)(Prism software Version 6.0，Graphpad Software,La Jolla,CA,USA).進(jìn)行處理。

結(jié)果表明，相比于乙型肝炎，自身免疫性肝炎和正常肝組織，IL21在PBC患者肝組織中表達(dá)顯著升高。在PBC患者中，IL21陽(yáng)性的細(xì)胞是在肝臟門管區(qū)周邊的炎性肝細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎癥淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL21陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目與肝臟的炎癥程度和肝臟的纖維化程度呈正比。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)IL21陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目與肝臟的炎癥程度(hepatic inflammation degree)正相關(guān)(r＝0.45,p<0.05)；與肝臟的的纖維化程度(hepatic fibrosis degree)正相關(guān)((r＝0.66,p<0.01)，相關(guān)結(jié)果見圖2。

上述僅為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這些也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 東南大學(xué)

<120> 與原發(fā)性膽汁性膽管炎關(guān)聯(lián)的白細(xì)胞介素21及其應(yīng)用

<130> SG20161226001

<160>13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211>90

<212> DNA

<213>rs17005934

<221> misc_feature

<223> n is c or t

<400> 1

aatgactaat taacaaagtg cagaccagga aaacacagac tcngtgagat ttaccaaatt 60

ggctccaaga ctaccctgaa gtcacccttt 90

<210>2

<211> 90

<212> DNA

<213> rsrs17005953

<221> misc_feature

<223> n is t or c

<400>2

ttcacccagg cgtcatgaaa ataggtgacc ttggttctag aaaattatga ngatgacttc 60

cctatagtta catccaccca aaaaagcctg 90

<210>3

<211> 51

<212> DNA

<213>rs28517551

<220>

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400>3

acgggcatat ccccagcaga gatgangagt agccctccca agggacgctg c 51

<210>4

<211>85

<212> DNA

<213>rs925550

<221> misc_feature

<223> n is a or c

<400>4

aaaatcacat attgtgctac aaaattaata tctatcaaan tgaattttat attggcttca 60

tttgcccttt ctccttgtcc acaga 85

<210>5

<211> 51

<212> DNA

<213>rs60318098

<221> misc_feature

<223> n is a or g

<400>5

gtatatatgt aggtttatgt tttatntact atctcattgg ttggttgttg t 51

<210>6

<211> 51

<212> DNA

<213>rs1026157

<221> misc_feature

<223> n is t or g

<400>6

ggatgttgactgcattgaatagaaangcatcatggccaaccaagaagaggt 51

<210>7

<211> 51

<212> DNA

<213>rs6811183

<221> misc_feature

<223> n is t or g

<400>7

ctgattcacacgcttgaggggaagantgctggaaagtagtaaaatagagcg 51

<210>8

<211> 30

<212> DNA

<213> rs17005934的引物1序列

<400>8

acgttggatg aaagtgcaga ccaggaaaac 30

<210>9

<211> 30

<212> DNA

<213> rs17005934的引物2序列

<400>9

acgttggatg aaagggtgac ttcagggtag 30

<210>10

<211> 20

<212> DNA

<213> rs17005934的探針序列

<400>10

gaccaggaaa acacagactc 20

<210>11

<211> 30

<212> DNA

<213> rs925550的引物1序列

<400>11

acgttggatg gggagggtaa ttaaaattag 30

<210>12

<211> 30

<212> DNA

<213> rs925550的引物2序列

<400>12

acgttggatg gggcaaatga agccaatata 30

<210>13

<211> 26

<212> DNA

<213> rs925550的探針序列

<400>13

ttgctacaaa attaatatct atcaaa 26