本發(fā)明涉及一種不同溶解性的貽貝蛋白及多肽的制備方法。

背景技術(shù)：

貽貝是貝類養(yǎng)殖事業(yè)中的重要種類，生產(chǎn)數(shù)量也很大。貽貝干品蛋白含量在60%左右，經(jīng)濟價值很高，也有一定的實用價值。為了更充分的開發(fā)利用貽貝，本發(fā)明采用分步提取的方法使原料的蛋白質(zhì)溶出，同時也較好的根據(jù)蛋白溶解性差異，把原料中的混合蛋白進行了分離，便于后期對不同的蛋白進行研究。

目前的研究中，關(guān)于貽貝蛋白的組成、含量等沒有確切的報道，貽貝蛋白中各種組分的氨基酸序列更是鮮有報道。這對于貽貝蛋白的深入研究，具有一定的限制。這種限制主要表現(xiàn)在兩個方面，簡述如下：

第一，由于蛋白質(zhì)在不同體系中的溶解性存在一定的差異，如果我們能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性進行分類，那么在液態(tài)食品體系中根據(jù)體系特性使用不同溶解性的蛋白質(zhì)，極有可能提高體系的穩(wěn)定性，有效保持產(chǎn)品品質(zhì)。因此，根據(jù)溶解性對蛋白進行分類提取制備具有一定的意義。

第二，貽貝中含有不同種類的蛋白質(zhì)，是通過生物酶解法獲得生物活性肽的良好蛋白質(zhì)來源。然而由于體系的復(fù)雜程度較大，對于我們進行定向酶切技術(shù)的應(yīng)用具有一定的限制。因此，通過溶解性的不同將貽貝蛋白進行分類制備，就可以一定程度上減少體系的復(fù)雜程度，同時可以為貽貝蛋白的進一步分離制備提供有效的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，該發(fā)明具有一定的實用價值。

貽貝，又名淡菜﹑海紅﹑海夫人，主要有條紋貽貝﹑紫貽貝和厚殼貽貝，貽貝在分類上屬于軟體動物門(mollusca)、瓣鰓綱(lamellibranchia)、異柱目(anisomyaria)、貽貝科(mytilidae)海洋生物。我國已發(fā)現(xiàn)的有近50種，分18個屬。它們的貝殼都呈三角形，表面有一層黑漆色發(fā)亮的外皮。貽貝味道極鮮，營養(yǎng)豐富，它所含蛋白質(zhì)﹑碘﹑鈣和鐵都比較多，但所含脂肪很少。產(chǎn)自浙江﹑福建﹑山東﹑遼寧等沿海省份，養(yǎng)殖量極大。在海產(chǎn)食品中，低值的貽貝并未充分利用，因此研究與開發(fā)貽貝提高它的利用價值就有十分重要的意義。本專利從蛋白質(zhì)的角度對貽貝進行初步分析，以便尋求新的思路提高貽貝的利用率。

貽貝中根據(jù)溶解性的不同分為肌漿蛋白，肌原纖維蛋白，基質(zhì)蛋白。利用肌漿蛋白溶于水溶液或稀鹽溶液，肌原纖維蛋白溶于一定濃度的鹽溶液，基質(zhì)難溶于水的特性，將貽貝中的混合蛋白進行了適當?shù)姆蛛x。

但目前報道的貽貝蛋白的提取技術(shù)方法有三個方面的局限性：

（1）對于三種溶解性蛋白的分步提取技術(shù)不明確；

（2）各種蛋白的提取率較低；

（3）制備出的蛋白質(zhì)未能經(jīng)過后續(xù)處理，并開發(fā)成可以直接應(yīng)用的產(chǎn)品。

國內(nèi)外對貽貝的藥用食用價值已經(jīng)做了大量的研究工作，取得了不少成績，部分已在醫(yī)藥及食品的生產(chǎn)中得到了應(yīng)用。但貽貝在我國養(yǎng)殖區(qū)域廣，產(chǎn)量大，無論從藥用的角度，還是從保健食療的角度均具有廣闊的開發(fā)前景。在我國，貽貝主要是新鮮或者粗加工后供民間食用，如果能夠結(jié)合研究成果，加強活性成分的確定，分離，提取，藥理和臨床等基礎(chǔ)研究，發(fā)展出相應(yīng)的保健食品及其藥品，不僅對疫病的預(yù)防和治療有貢獻，而且會產(chǎn)生較大的社會效益及經(jīng)濟效益。

目前，對貽貝蛋白的分離、提取及理化性質(zhì)的研究鮮有報道。針對蛋白分級的研究較多集中在小麥、大米、蕎麥等農(nóng)作物蛋白源，而對于貽貝蛋白的分級以及提取工藝的研究鮮有報道。

分別用這些蛋白進行酶解，得到不同的三種酶解多肽產(chǎn)物，具有不同的應(yīng)用方向和研究價值，提高了原料的利用率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先對原料進行充分的利用，一批次處理可以獲得三類蛋白，且蛋白具有一定特征分子量。分別用這些蛋白進行酶解，得到不同的三種酶解多肽產(chǎn)物，提高了原料的利用率。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一種不同溶解性貽貝蛋白的制備方法，清洗、去殼、去足絲，勻漿；依次分步進行肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、基質(zhì)蛋白的提取得到相應(yīng)的提取液，再分別進行超濾，最后進行噴霧干燥得到蛋白粉。

進一步地，肌漿蛋白提取液為0.05mol/l，ph=7的磷酸緩沖溶液，浸提時間30-90min，浸提次數(shù)2-3次，溫度2-4℃，料液比1:3-1:20，浸提后進行離心，最終蛋白液用10000da超濾膜過濾。

進一步地，肌漿蛋白提取液為0.05mol/l，ph=7的磷酸緩沖溶液，浸提時間30-90min，浸提次數(shù)2-3次，溫度2-4℃，料液比1:3-1:20，浸提后進行離心，最終蛋白液用10000da膜超濾過濾。

進一步地，基質(zhì)蛋白提取液為2%-5%的檸檬酸溶液，浸提時間60-90min，浸提次數(shù)2-4次，溫度30-70℃；浸提后進行離心，最終蛋白液用10000da膜超濾。

進一步地，采用噴霧干燥的進口溫度130-170℃，出口溫度60-90℃，進行噴霧干燥之前的可對蛋白液進行蒸發(fā)濃縮，使其固形物含量是15-50%。

進一步地，采用低溫噴霧干燥的方式進行干燥，進風溫度68-80℃，出風溫度30-45℃，固形物含量要求15-50%，干燥之后的樣品控制在5%以內(nèi)。

另外，用上述貽貝蛋白制備貽貝多肽的方法，對蛋白提取液酶解、滅酶、離心取上清液、超濾、再進行噴霧干燥得到多肽粉。

進一步地，所述酶解的條件是：胰蛋白酶ph8-9、溫度40-47℃、時間2-6h；加酶量3000-5000u/g。

進一步地，沸水浴5-15min進行滅酶。

進一步地，待滅酶后的樣品冷卻至室溫后，進行離心，轉(zhuǎn)速8000-10000g/min、時間5-15min。

進一步地，離心后將上清液經(jīng)過超濾，收集分子量3k以下的酶解液，除去大分子物質(zhì)。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明旨在以貽貝為原料，采用三步分別提取的技術(shù)，獲得了貽貝中大部分的蛋白。不僅解決了蛋白提取率低的問題，還使混合蛋白適當進行了分離。同時再酶解等方式，制備新型貽貝多肽?？蓮V泛應(yīng)用于保健食品，功能性食品等產(chǎn)品中，開闊了廣泛的市場前景。采用超濾技術(shù)和噴霧干燥技術(shù)，最大限度的保證了蛋白及多肽產(chǎn)品的純度問題，從而保證了其最終的活性發(fā)揮到最大（粒度分布、濕含量、生物活性、溶解性、色、味等）。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步解釋說明。

實施例1貽貝蛋白的制備方法：

1）前處理：清洗、去殼、去足絲、勻漿5000-8000rpm/min，時間15-30min。

2）肌漿蛋白提取液為0.05mol/l，ph=7的磷酸緩沖溶液，浸提時間30-90min，浸提次數(shù)2-3次，溫度2-4℃，料液比1:3-1:20.離心條件：8000-13000g，10-20min，4℃。最終蛋白液用10000da膜超濾2-6次。

3）肌原纖維蛋白提取液為0.1mol/l,ph=7含0.6mol/l氯化鈉的磷酸緩沖溶液；浸提時間30-60min；浸提次數(shù)2-3次；溫度2-4℃；料液比1:3-1:20；離心條件：8000-13000g，10-20min，4℃。最終蛋白液用10000da膜超濾2-6次。

4）基質(zhì)蛋白提取液為2%-5%的檸檬酸溶液，浸提時間60-90min，浸提次數(shù)2-4次，溫度30-70℃；離心條件：8000-10000rpm，20-40min，4℃。最終蛋白液用10000da膜超濾2-6次。采用超濾技術(shù)目的在于除去蛋白溶液中的鹽分。在超濾之前對樣品進行兩次離心，以求快速超濾，防止堵塞，延長膜的使用壽命。

5）采用噴霧干燥技術(shù)對貽貝蛋白進行干燥，對采用噴霧干燥的進口溫度130-170℃，出口溫度60-90℃，進行噴霧干燥之前的可對蛋白液進行蒸發(fā)濃縮，使其固形物含量是15-50%。

相關(guān)測定方法

蛋白含量的測定：

（1）采用凱氏定氮的方法。

稱取充分混合的固體樣品0.2-2g，精確至0.001g移入干燥的250ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g五水硫酸銅，6g硫酸鉀，20ml濃硫酸，搖勻后放入消化爐中進行消化，選擇如下程序：220℃處理60min，440℃處理90min。完成后放入自動凱氏定氮儀中進行處理，硼酸吸收游離的氨，用濃度為0.0995-0.1005mol/l的標準鹽酸進行滴定。根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)6.25，即為蛋白質(zhì)的含量。

（2）采用考馬斯亮藍的方法

配置溶液：標準蛋白液：0.1g牛血清蛋白用超純水溶解并稀釋至1l；考馬斯亮藍g-250（0.01%）染液：稱取0.1g考馬斯亮藍g-250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml濃磷酸（85%）加蒸餾水定容至1000ml。

標準曲線制作：試管編號0123456

100ug/ml標準蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.6

超純水（ml）10.90.80.70.60.50.4

考馬斯亮藍試劑（ml）5555555搖勻，室溫靜置3min

以1號管為空白對照,在595nm處比色，標準曲線的繪制至少三組平行，使r*r>0.9980

樣品1ml加入5ml考馬斯試劑，混勻，室溫靜置3min以標準曲線中的1號管為空白對照，在595nm處比色。帶入標準曲線中，計算樣品蛋白含量。

該方法得到的貽貝蛋白的基本指標為：

①貽貝蛋白最終呈現(xiàn)粉末狀

②蛋白水分含量≤5%

③三種貽貝蛋白的蛋白含量（以n計）≥80%

④肌漿蛋白條帶分布較為廣泛，范圍在90-40kda，其中以45kda蛋白為主，肌原纖維蛋白分子量范圍70-120kda，其中以102kda蛋白為主，基質(zhì)蛋白分子量大致分布為103、87、72、17kda。三種蛋白各具有明顯的特征條帶?？偟鞍滋崛÷史秶鸀?5-85%。

⑤三種蛋白溶液超濾后制得蛋白粉的蛋白含量在65-90%范圍內(nèi)，明顯提高了蛋白純度。有利于后一步的研究工作。

用實施例1的方法得到的貽貝蛋白進一步進行酶解、滅酶、離心取上清液、超濾、再進行噴霧干燥得到多肽粉，具體的工藝步驟和條件為：

1）酶解條件：胰蛋白酶ph8-9、溫度40-47℃、時間2-6h；加酶量3000-5000u/g

2）滅酶：沸水浴5-15min

3）離心：待滅酶后的樣品冷卻至室溫后，進行離心，轉(zhuǎn)速8000-10000g/min、時間5-15min。

4）超濾：將上清液經(jīng)過超濾，收集分子量3k以下的酶解液，除去大分子物質(zhì)。

5）噴霧干燥：采用噴霧干燥技術(shù)對貽貝蛋白進行干燥，進口溫度130-170℃，出口溫度60-90℃，進行噴霧干燥之前的可對蛋白液進行濃縮，使其固形物含量是15-50%（根據(jù)實際生產(chǎn)需要和設(shè)備型號的樣品流變學特性確定具合適的固形物含量。也可采用低溫噴霧干燥的方式進行干燥，進風溫度68-80℃，出風溫度30-45℃，固形物含量要求15-50%。干燥之后的樣品控制在5%以內(nèi)。

本發(fā)明的制備方法得到多肽的分子量分布為：700-2700da，其中<1000da的占的比例為：21.74%；<2000da的比例為：85.51%。多肽得率為：60%-80%，三種多肽水分含量≤5%。三種多肽蛋白含量（以n計）≥95%。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。