本申請屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中α-淀粉酶活的方法。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌是一類分布廣泛的革蘭氏陽性桿狀好氧細(xì)菌，無致病性，不易產(chǎn)生抗藥性、與環(huán)境兼容性良好，并具有較強(qiáng)的向胞外分泌各種酶及抗生素的能力?？莶菅挎邨U菌應(yīng)用廣泛，目前涉及發(fā)酵、病蟲害防治、養(yǎng)殖業(yè)、污水處理等各個(gè)領(lǐng)域。然而，在芽孢形成的初級階段，枯草芽孢桿菌通過“同種相食”（Cannibalism）過程推遲芽孢形成，即將形成芽孢的細(xì)胞產(chǎn)生并向胞外釋放細(xì)菌毒素Skf（芽孢形成自殺因子）和Sdp（芽孢形成延遲蛋白），同時(shí)自身對毒素具有免疫機(jī)制，殺死未形成芽孢的姐妹細(xì)胞，利用死亡細(xì)胞釋放的營養(yǎng)物質(zhì)推遲芽孢的形成，由此造成培養(yǎng)過程中菌數(shù)的大量減少。

Sdp對應(yīng)的基因簇由sdpA、sdpB、sdpC、sdpI、sdpR基因構(gòu)成，sdpC基因?yàn)榫幋a細(xì)菌毒素前體的核心基因。其中sdpA基因編碼一種胞質(zhì)蛋白SdpA，對SdpC進(jìn)行修飾；sdpB基因編碼一種跨膜蛋白SdpB，同樣對SdpC進(jìn)行修飾；sdpC基因編碼含203個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)前體pro-SdpC，經(jīng)修飾后形成毒素Sdp；sdpI基因編碼SdpI蛋白，是一種跨膜蛋白，具有免疫及信號(hào)傳遞功能，可以感應(yīng)胞外細(xì)菌毒素Sdp，解除SdpR對SdpRI的抑制；sdpR基因編碼含90個(gè)氨基酸組成的調(diào)節(jié)蛋白SdpR，與sdpRI的啟動(dòng)子結(jié)合，阻止其轉(zhuǎn)錄，并同SdpI共同參與分泌細(xì)菌毒素的細(xì)胞對毒素自身免疫機(jī)制的形成。

基于上述研究，如果能夠?qū)莶菅挎邨U菌中的sdpC基因進(jìn)行突變，進(jìn)而減少Sdp的形成，則有可能大幅度提高枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培育效果，但現(xiàn)有技術(shù)中，尚未見到較好的報(bào)道成果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請主要目的在于提供一種改造枯草芽孢桿菌的方法，從而提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中α-淀粉酶活力。

本申請的主要技術(shù)方案如下所述。

一種提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中α-淀粉酶活的方法，該方法通過采用基因工程方法對枯草芽孢桿菌菌株基因組進(jìn)行改造實(shí)現(xiàn)，其基因組改造原理如圖1所示，因此，該方法主要包括如下步驟：

（1）設(shè)計(jì)引物，PCR克隆擴(kuò)增sdpBC部分序列DNA

PCR擴(kuò)增時(shí)引物序列設(shè)計(jì)如下：

sdp F：5’-CGGAATTCTAAAGAGTGGGCAGAAGGAAC-3’，（5’端GAATTC部分序列為EcorI酶切位點(diǎn)）

sdp R：5’-CGGGATCCTTTACTAACTTTTTACCTTCTGT-3’；（5’端GGATCC部分序列為BamHI 酶切位點(diǎn)）

以枯草芽孢桿菌168菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（2）酶切和連接

將步驟（1）中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（sdpBC部分序列DNA）與質(zhì)粒pMUTIN4，分別采用EcorI和BamHI進(jìn)行雙酶切；

對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收酶切產(chǎn)物；

對所回收的酶切產(chǎn)物采用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接；

（3）轉(zhuǎn)化、篩選并鑒定

將步驟（2）中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒即為所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒，保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）將所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，并檢測鑒定

采用Spizizen低鹽環(huán)境感受態(tài)轉(zhuǎn)化法，將所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株，并進(jìn)一步進(jìn)行檢測鑒定，確定轉(zhuǎn)化后的枯草芽孢桿菌菌株構(gòu)建正確；

檢測鑒定時(shí)，以轉(zhuǎn)化后的枯草芽孢桿菌菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測鑒定，PCR檢測時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

sdpF-2：5’-CGGAATTCCATTATTAGATTCAAGGCGA-3’，（引物sdpF-2是理論整合位點(diǎn)處上游基因組的部分序列）

pMUTIN4 R：5’-CCACAGTAGTTCACCACCTTTTC-3’。

針對上述提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中α-淀粉酶活的方法，也可以理解為一種改造枯草芽孢桿菌的方法，該方法包括如下步驟：

（1）設(shè)計(jì)引物，PCR克隆擴(kuò)增sdpBC部分序列DNA

PCR擴(kuò)增時(shí)引物序列設(shè)計(jì)如下：

sdp F：5’-CGGAATTCTAAAGAGTGGGCAGAAGGAAC-3’，（5’端GAATTC部分序列為EcorI酶切位點(diǎn)）

sdp R：5’-CGGGATCCTTTACTAACTTTTTACCTTCTGT-3’；（5’端GGATCC部分序列為BamHI 酶切位點(diǎn)）

以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（2）酶切和連接

將步驟（1）中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（sdpBC部分序列DNA）與質(zhì)粒pMUTIN4，分別采用EcorI和BamHI進(jìn)行雙酶切；

對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收酶切產(chǎn)物；

對所回收的酶切產(chǎn)物采用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接；

（3）轉(zhuǎn)化、篩選并鑒定

將步驟（2）中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒即為所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒，保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）將所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，并檢測鑒定

采用Spizizen低鹽環(huán)境感受態(tài)轉(zhuǎn)化法，將所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，并進(jìn)一步進(jìn)行檢測鑒定，確定轉(zhuǎn)化后的枯草芽孢桿菌菌株構(gòu)建正確。

所述改造枯草芽孢桿菌的方法在α-淀粉酶制備中的應(yīng)用，通過該方法改造枯草芽孢桿菌168菌株，可以較好提高發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活。

總體而言，本申請以生理及轉(zhuǎn)化背景比較清楚、并已經(jīng)完成序列測定的枯草芽孢桿菌168菌株作為研究示例，通過同源重組的方法，對芽孢形成延遲蛋白基因sdpC進(jìn)行插入突變。初步研究表明，通過該方法所獲得的改造后的菌株，其活菌數(shù)及α-淀粉酶活均得到了較好提升，表現(xiàn)出較好的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也為其他菌株改造奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為枯草芽孢桿菌基因簇sdpBC插入構(gòu)建重組菌株技術(shù)原理示意圖；

圖2為sdpBC部分序列DNA片段的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，其中M：DM3100 1KB DNA Ladder；1：sdpBC中長724bp的DNA片段；

圖3為所構(gòu)建重組質(zhì)粒pMUTIN4+sdpBC電泳圖譜，其中M：DM3100 1KB DNA Ladder；1-3：重組質(zhì)粒pMUTIN4+sdpBC的電泳圖；

圖4為對所構(gòu)建重組質(zhì)粒pMUTIN4+sdpBC中sdpBC基因部分序列的PCR檢測圖，其中M：BM2000 DNA Marker；1：sdpC基因中長724 bp的DNA片段；

圖5為對枯草芽孢桿菌168同源單交換重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證，其中M：BM2000 DNA Marker；1:枯草芽孢桿菌168基因組；2-4:轉(zhuǎn)化子14號(hào)、16號(hào)和20號(hào)；

圖6為枯草芽孢桿菌168及其突變轉(zhuǎn)化子菌株培養(yǎng)24h后活菌數(shù)；

圖7為枯草芽孢桿菌168及其突變轉(zhuǎn)化子菌株培養(yǎng)48h后芽孢數(shù)；

圖8為枯草芽孢桿菌168及其突變轉(zhuǎn)化子α-淀粉酶活力對比。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步的介紹說明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中部分實(shí)驗(yàn)背景情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

枯草芽孢桿菌168菌株、枯草芽孢桿菌整合型質(zhì)粒pMUTIN4，購自杭州寶賽生物科技有限公司；

引物序列合成及測序，由北京華大基因公司提供完成；

實(shí)驗(yàn)試劑：

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，利用去離子水定容至1000mL，適度加熱使其充分溶解，按每瓶100mL的量分裝至500mL三角瓶當(dāng)中，121℃滅菌30min；（LB固體培養(yǎng)基，另外加入20g瓊脂粉）；

PCR擴(kuò)增用試劑盒，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品；

質(zhì)粒提取試劑盒，捷恩麥克生物科技公司產(chǎn)品；

實(shí)驗(yàn)儀器：

PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1

由于以質(zhì)粒pMUTIN4為基礎(chǔ)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建是本申請的基礎(chǔ)，具體過程如下。

（1）設(shè)計(jì)引物，PCR克隆擴(kuò)增sdpBC部分序列DNA

首先，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增用引物序列如下：

sdp F：5’-CGGAATTCTAAAGAGTGGGCAGAAGGAAC-3’，（5’端GAATTC部分序列為EcorI酶切位點(diǎn)）

sdp R：5’-CGGGATCCTTTACTAACTTTTTACCTTCTGT-3’；（5’端GGATCC部分序列為BamHI 酶切位點(diǎn)）

其次，以枯草芽孢桿菌168基因組DNA（DNA提取采用細(xì)胞/細(xì)菌/酵母基因組DNA小量提取試劑盒進(jìn)行提取，試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司）為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25μL擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)如下：

枯草芽孢桿菌168基因組DNA，1μL；

引物sdp F，1μL；

引物sdp R，1μL；

GenStar 2×TaqMix，12.5μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反應(yīng)程序如下：94℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、45s，34cycles；72℃、10min；

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖如圖2所示。從圖2中可以看出，PCR產(chǎn)物符合預(yù)期的724bp，進(jìn)一步經(jīng)北京華大基因公司測序后，表明擴(kuò)增產(chǎn)物序列正確。

（2）酶切和連接

將步驟（1）中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（sdpBC部分序列DNA）與質(zhì)粒pMUTIN4，分別采用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切，50μL酶切體系設(shè)計(jì)如下：

限制性內(nèi)切酶EcorI，1μL；

限制性內(nèi)切酶BamHI，1μL；

Cut Smart Buffer，5μL；

質(zhì)粒pMUTIN4（或sdpBC部分序列DNA），10μL；

ddH₂O，33μL；

37℃酶切3h。

對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收酶切產(chǎn)物。

對所回收的酶切產(chǎn)物采用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，10μL的線性化后質(zhì)粒pMUTIN4與DNA片段連接體系設(shè)計(jì)如下：

T4 DNA Ligase，1μL；

T4 DNA Ligase Buffer，1μL；

pMUTIN4線性化質(zhì)粒，1μL；

純化后兩DNA片段（即酶切后sdpBC部分序列），7μL；

16℃連接16h。

（3）轉(zhuǎn)化、篩選并鑒定

將步驟（2）中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；

提取質(zhì)粒后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。檢測結(jié)果可以看出，sdpBC部分序列已經(jīng)整合進(jìn)入質(zhì)粒pMUTIN4基因組中。

進(jìn)一步地，對所提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測鑒定，PCR檢測時(shí)，以所提取重組質(zhì)粒為模板，以步驟（1）中所設(shè)計(jì)sdp F和sdp R為擴(kuò)增引物，25μL擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)如下：

重組質(zhì)粒，1μL；

sdp F，1μL；

sdp R，1μL；

GenStar 2×TaqMix，12.5μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反應(yīng)程序如下：94℃、5min；94℃、30s，60.4℃、30s，72℃、2min03s，34cycles；72℃、10min；

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。這一結(jié)果表明，所構(gòu)建的質(zhì)粒為同源單交換重組質(zhì)粒。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1所構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，并進(jìn)一步篩選獲得重組后的突變菌株，其對枯草芽孢桿菌168基因組改造的技術(shù)原理如圖1所示，基于同源單交換的原理進(jìn)行基因組整合，具體的轉(zhuǎn)化、篩選過程簡要介紹如下。

將實(shí)施例1所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，并檢測鑒定

采用Spizizen低鹽環(huán)境感受態(tài)轉(zhuǎn)化法，將實(shí)施例1所構(gòu)建的同源單交換重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，具體過程如下。

（1）制備枯草芽孢桿菌168菌株感受態(tài)細(xì)胞

將保存于-80℃超低溫冰箱中的枯草芽孢桿菌168菌株，劃線后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；

挑取菌落至2mL的SPI培養(yǎng)基中（均利用50mL離心管進(jìn)行操作），37℃、200 rpm培養(yǎng)過夜；

第二天上午取100μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接5mL的SPI培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長末期(約4-5h)；

取0.2mL培養(yǎng)液至2mL的SPII培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)90min；

加入20μL的10mmol/L的EGTA，再于37℃、200 rpm培養(yǎng)10min；分裝成0.5mL每管備用。

（2）轉(zhuǎn)化

在每支裝有感受態(tài)細(xì)胞的離心管中加入對應(yīng)的重組質(zhì)粒DNA（1μg左右），于37℃、100 rpm振蕩培養(yǎng)90min，之后于25℃、5000rpm條件下離心1min，棄去400μL上清液，將沉淀的菌體與剩余的上清液混勻，得到100μL菌懸液，涂布于含6μg/mL紅霉素的抗性平板中，37℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，挑取單菌落（擬轉(zhuǎn)化子）進(jìn)行檢測。

（3）轉(zhuǎn)化子的篩選

挑取單菌落（擬轉(zhuǎn)化子）于5mL含6μg/mL紅霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取基因組DNA（采用細(xì)胞/細(xì)菌/酵母基因組DNA小量提取試劑盒提?。┖筮M(jìn)行PCR檢測；

PCR上游引物sdpF-2，依據(jù)枯草芽孢桿菌168基因組設(shè)計(jì)；下游引物pMUTIN4 R，根據(jù)質(zhì)粒pMUTIN4設(shè)計(jì)，確保一次PCR檢測即確定插入突變陽性轉(zhuǎn)化子；具體引物序列設(shè)計(jì)如下：

sdpF-2：5’-CGGAATTCCATTATTAGATTCAAGGCGA-3’，（引物sdpF-2是理論整合位點(diǎn)處上游基因組的部分序列）

pMUTIN4 R：5’-CCACAGTAGTTCACCACCTTTTC-3’；

以轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，25μL擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)如下：

轉(zhuǎn)化子基因組DNA，1μL；

sdpF-2，1μL；

pMUTIN4 R，1μL；

GenStar 2×TaqMix，12.5μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反應(yīng)程序如下：94℃、5min；94℃、30s，54℃、30s，72℃、56s，34cycles；72℃、10min；

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，枯草芽孢桿菌168基因組中沒有得到PCR產(chǎn)物，而轉(zhuǎn)化子中可得到PCR產(chǎn)物，并符合預(yù)期大?。?24bp），表明轉(zhuǎn)化子染色體中已插入重組質(zhì)粒。進(jìn)一步地，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，表明序列順序和插入方向均正確，即，所獲得的重組菌株是正確的，符合預(yù)期。

對重組后的枯草芽孢桿菌菌株（轉(zhuǎn)化子）的生物學(xué)特性進(jìn)行評價(jià)，其中主要包括對轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)一定條件后的活菌數(shù)及芽孢數(shù)的生物量的統(tǒng)計(jì)，也包括發(fā)酵產(chǎn)物的α-淀粉酶活力的評價(jià)，以確定改造后菌株是否具有一定的應(yīng)用前景。相關(guān)過程簡要介紹如下。

（1）轉(zhuǎn)化子的活菌數(shù)及芽孢數(shù)的測定和評價(jià)

采用LB液體培養(yǎng)基，以原始出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌168作為對照，以所構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子16號(hào)和20號(hào)作為實(shí)驗(yàn)例（16號(hào)、20號(hào)僅是構(gòu)建過程中的實(shí)驗(yàn)編號(hào)，并不具有實(shí)際意義），分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)液，37℃、 220rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.5左右時(shí)，分別取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接接種至200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)；

培養(yǎng)至24h時(shí)，進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，此結(jié)果即為菌液中的活菌數(shù)；

培養(yǎng)至48 h時(shí)，各取1mL菌液，95℃保溫30 min，確?？莶菅挎邨U菌營養(yǎng)細(xì)胞在高溫的環(huán)境下全部被殺死（正常情況下，細(xì)菌營養(yǎng)細(xì)胞在70~80℃溫度下處理10min即可被全部殺死），然后進(jìn)行平板稀釋計(jì)數(shù)，此結(jié)果即是菌液中芽孢數(shù)。

活菌數(shù)測定結(jié)果如圖6所示。芽孢數(shù)測定結(jié)果如圖7所示。

從圖6中可見，培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)化子總菌數(shù)比出發(fā)菌株分別提高了48%及35%。從圖7中可見，培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)化子芽孢數(shù)比出發(fā)菌株分別提高了95%及84%。這一結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組菌株（轉(zhuǎn)化子）的sdpBC蛋白失去了活性，因而活菌數(shù)量和芽孢數(shù)量都得到了明顯增長。

（2）轉(zhuǎn)化子α-淀粉酶活力測定和評價(jià)

在上述“活菌數(shù)及芽孢數(shù)”測定評價(jià)過程中，在轉(zhuǎn)接后的菌液培養(yǎng)過程中，分別取培養(yǎng)至9h、12h、15h、18h、22h、26h、30h、34h的菌液，對菌液中的α-淀粉酶活力進(jìn)行測定，α-淀粉酶活采用DNS法進(jìn)行測定，具體測定步驟如下：

（1）取1mL菌液樣品，4℃、8000rpm/min離心20min，取上清液，即為粗酶液，將粗酶液平均分為兩份，其中一份煮沸20分鐘滅活作為對照；

（2）向步驟（1）中的粗酶液及對照樣分別加入2%可溶性淀粉溶液1mL、蒸餾水3mL，60℃保溫5min；

（3）向步驟（2）溶液中加入濃度為0.1mol/L的檸檬酸緩沖液（pH=6.5）1mL，60℃水浴保溫30min；

（4）向步驟（3）溶液中加入1.5mL DNS試劑，沸水浴5min，然后迅速冷卻，加蒸餾水定容至20mL；

（5）將步驟（4）溶液搖勻，分光光度計(jì)測定520nm處的OD值，并查閱麥芽糖溶液的吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對應(yīng)的麥芽糖含量。

在本發(fā)明中，酶活力單位定義為：在60℃、pH=6.5的條件下，30min釋放1mg麥芽糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

檢測結(jié)果如圖8所示。從圖8可見，轉(zhuǎn)化子16號(hào)菌株在9h、12h、15h、18h、22h、26h、30h和34h的培養(yǎng)時(shí)間中α-淀粉酶的酶活相比168出發(fā)菌株依次提高47.25%、129.06%、57.14%、 23.06 %、22.93%、50.49 %、37.16% 和33.87%；轉(zhuǎn)化子20號(hào)菌株在對應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)α-淀粉酶活相比168出發(fā)菌株依次提高38.71%、63.60%、33.05%、21.56%、19.07%、40.46% 、18.63% 和28.69%。這一結(jié)果表明，改造后菌株，其發(fā)酵液中α-淀粉酶的酶活得到了明顯提升，具有較好地應(yīng)用前景。