本發(fā)明涉及微生物酶學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種具有染料降解協(xié)同作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
：漆酶(laccase,EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物血漿中的銅藍(lán)蛋白一起同屬于銅藍(lán)氧化酶家族。漆酶能從底物或介體中獲得電子，然后再把電子傳遞給分子氧，最后形成水。由于漆酶催化機(jī)理的特殊性，使得其作用底物非常廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)漆酶能催化氧化6大類250余種化合物，包括酚類及其衍生物、芳胺類及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾體激素和生物色素、金屬有機(jī)化合物、以及其他的非酚類物質(zhì)等。漆酶底物的廣泛性及其在環(huán)境中的穩(wěn)定性，所以它在造紙工業(yè)、染料脫色、食品和飲料工業(yè)、生物傳感器和環(huán)境污染物的治理等方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值。染料工業(yè)中的廢水處理是目前漆酶應(yīng)用具有較大前景的領(lǐng)域之一。當(dāng)前，世界染料年產(chǎn)量約為9×105噸，其中約有10％-15％的染料隨著廢水排入環(huán)境中，造成水體透光率低，導(dǎo)致水體生態(tài)系統(tǒng)的破壞。國(guó)內(nèi)外常用的處理方法包括物理化學(xué)法和生物法。物理化學(xué)法包括絮凝沉降法、吸附法、化學(xué)氧化法、離子交換法和電解技術(shù)等，但是處理費(fèi)用高，可能造成二次污染的問(wèn)題。生物法是利用生物體或者酶來(lái)降解廢水中的染料。相比之下，生物法是一種經(jīng)濟(jì)有效的處理方法。其中，漆酶被認(rèn)為是一種非常有效環(huán)保的方法，因?yàn)槠崦缚稍谟醒鯒l件下，降解不同結(jié)構(gòu)的多種染料，并最終將它們轉(zhuǎn)化為CO2和H2O。真菌(特別是白腐真菌)是漆酶的主要生產(chǎn)者，是目前研究漆酶最廣泛和深入的生物體，主要集中在革蓋菌(Coriolus)、栓菌(Trametes)、原毛平革菌屬(Phanerochaete)和密孔菌(Pycnoporus)等各屬中。目前對(duì)于真菌漆酶的研究主要表現(xiàn)在漆酶活性誘導(dǎo)、漆酶理化性質(zhì)研究、漆酶的固定化、以及漆酶在污染物降解、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化、生物傳感器等方面。對(duì)于同種真菌中漆酶同工酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)研究較少，特別是同種真菌菌株中不同漆酶蛋白相互間的協(xié)同脫色能力未有報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有染料降解協(xié)同作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)制備法，其屬于誘導(dǎo)毛栓孔菌產(chǎn)生多種漆酶同工酶的培養(yǎng)方法以及對(duì)于染料降解具有協(xié)同作用的漆酶制備技術(shù)。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種具染料協(xié)同降解作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)制備法，包括如下步驟：1)、毛栓孔菌TrameteshirsutaMX2先在固體培養(yǎng)基上于28±0.5℃恒溫培養(yǎng)7±1天，從而實(shí)現(xiàn)活化；將活化后的毛栓孔菌放入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于150±10r/min、28±0.5℃下恒溫振蕩培養(yǎng)13±1天，所得的發(fā)酵液離心(4000±200rpm/min離心30±5min)，離心后所得上清液為粗酶液；2)、將上述粗酶液分離純化，得到兩種漆酶同工酶，分別記為ThLac1和ThLac2；所述分離純化包括超濾濃縮、硫酸銨沉淀透析、離子交換層析和凝膠層析；①、所述超濾濃縮為：將所述粗酶液放入濾膜孔徑為10kDa的超濾管中，離心(4℃、4000±200rpm/min離心30±5分鐘)，得超濾液；②、所述硫酸銨沉淀透析為：在超濾液中加入(緩慢加入)硫酸銨，使溶液中硫酸銨的質(zhì)量濃度達(dá)到80±2％，4℃過(guò)夜(即，12小時(shí))，離心(4000±200rpm/min離心30±5分鐘)，將沉淀用少量(即，為只需使沉淀溶解的量)0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)溶解，得酶液；將酶液裝入孔徑為12～14kDa的透析袋中，用50±5體積倍于酶液的0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)透析24±1h，透析過(guò)程中更換相同體積量的醋酸鈉緩沖液2～4次(較佳為3次)；得透析液；③、所述離子交換層析為：將上述透析液上層析柱(例如以0.4mL/min的流速)，所述層析柱為DEAE-SepharoseFF層析柱(25×16mm)；用0～0.5mol/LNaCl溶液和0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)進(jìn)行洗脫(梯度洗脫)，流速0.8mL/min，將具有相同活性的組分進(jìn)行合并；收集由5.8％體積含量的NaCl溶液和94.2％體積含量的醋酸鈉緩沖液組成的洗脫液對(duì)應(yīng)的所得物，超濾濃縮，得ThLac1離子交換液；收集由13.3％體積含量的NaCl溶液和86.7％體積含量的醋酸鈉緩沖液組成的洗脫液對(duì)應(yīng)的所得物，超濾濃縮，得ThLac2離子交換液；④、所述凝膠層析為：將ThLac1離子交換液、ThLac2離子交換液分別進(jìn)行以下操作：將其(離子交換液)加入層析柱，所述層析柱為SephacrylS-200層析柱(90×1.6cm)；用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)以0.15mL/min的流速洗脫，將有活性的組分合并后超濾濃縮；ThLac1離子交換液對(duì)應(yīng)所得的為純化漆酶ThLac1；ThLac2離子交換液對(duì)應(yīng)所得的為純化漆酶ThLac2。作為本發(fā)明的具染料協(xié)同降解作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)制備法的改進(jìn)：步驟1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基為：碳源20克，酵母提取物10克，磷酸二氫鉀2克，硫酸銨2克，七水硫酸鎂0.5克，氯化鈣0.1克，蒸餾水1000ml。備注說(shuō)明：該發(fā)酵培養(yǎng)基pH自然。需常規(guī)滅菌(即，1.0×105Pa、121℃滅菌30min滅菌)。作為本發(fā)明的具染料協(xié)同降解作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)制備法的進(jìn)一步改進(jìn)：碳源為白楊、毛竹、或者木質(zhì)素磺酸鈉。具體而言：上述白楊、毛竹為過(guò)60目篩的木屑或竹屑。作為本發(fā)明的具染料協(xié)同降解作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)制備法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟1)的固體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。配方為：馬鈴薯(去皮)200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，蒸餾水1000ml，pH自然。1.0×105Pa、121℃滅菌30min滅菌即可。該配方屬于常規(guī)配方。作為本發(fā)明的具染料協(xié)同降解作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)制備法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟2)的步驟③和步驟④中的超濾濃縮均為：放入10kDa的超濾管中，離心(4℃、4000±200rpm/min離心30±5分鐘)。作為本發(fā)明的具染料協(xié)同降解作用的毛栓孔菌漆酶的培養(yǎng)制備法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟1)中：取1×1cm大小的活化后毛栓孔菌的菌餅放入至100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在本發(fā)明的培養(yǎng)制備法中，步驟③的離子交換層析具體為：將DEAE-SepharoseFF層析柱(25×16mm)接入AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)，以5mL/min流速的0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)平衡，使記錄儀上的UV信號(hào)與基線重合；再將上述透析液以0.4mL/min的流速上層析柱，待UV信號(hào)返回基線后，用0-0.5mol/LNaCl溶液和0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)進(jìn)行洗脫(梯度洗脫)，流速0.8mL/min，F(xiàn)ractionCollectorFrac-920收集器收集70管，每管1mL；測(cè)定每管的漆酶活性，將具有相同活性的組分進(jìn)行合并，即，將第6～11管合并(對(duì)應(yīng)的洗脫液中，NaCl溶液的體積含量為5.8％，醋酸鈉緩沖液的體積含量為94.2％)，將第19～23管合并(對(duì)應(yīng)的洗脫液中，NaCl溶液的體積含量為13.3％，醋酸鈉緩沖液的體積含量為86.7％)；將2種合并后的所得物分別進(jìn)行超濾濃縮，從而分別對(duì)應(yīng)的獲得ThLac1離子交換液和ThLac2離子交換液；步驟④的凝膠層析具體為：將SephacrylS-200層析柱(90×1.6cm)接入AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)，以1mL/min流速的0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)平衡，使記錄儀上的UV信號(hào)與基線重合；將上述離子交換液加入層析柱，然后用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)以0.15mL/min的流速洗脫，F(xiàn)ractionCollectorFrac-920收集器收集120管，每管1mL；測(cè)定每管的漆酶活性，將有活性的組分合并，具體為：ThLac1離子交換液凝膠層析收集第59～64管，ThLac2離子交換液凝膠層析收集第57～62管，將2種合并后的所得物分別進(jìn)行超濾濃縮，從而分別得純化漆酶ThLac1、純化漆酶ThLac2。即，ThLac1離子交換液凝膠層析超濾濃縮后的為ThLac1，ThLac2離子交換液凝膠層析超濾濃縮后的為ThLac2。本發(fā)明中是以ABTS作為底物來(lái)測(cè)定漆酶活性。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用方法制備所得的毛栓孔菌漆酶進(jìn)行的染料脫色法：將ThLac1與ThLac2混合，所述ThLac1占混合酶總酶活的50～80％，然后混合酶放入染料中直至含量為50IU/L，然后進(jìn)行脫色；脫色時(shí)間為≥3小時(shí)。本發(fā)明所用的毛栓孔菌為毛栓孔菌TrameteshirsutaMX2(駱靜怡，傅威銳，潘程遠(yuǎn).2015.木腐真菌的鑒定及對(duì)不同木材的腐朽能力.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，32(1)：1-10)是一種白腐真菌，于2012年12月采自浙江臨安馬溪木材廠，現(xiàn)保存于浙江農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)科微生物實(shí)驗(yàn)室。在本發(fā)明中，步驟③對(duì)兩種漆酶同工酶進(jìn)行了分離，步驟④對(duì)兩種漆酶同工酶進(jìn)一步純化，剔除雜蛋白。本發(fā)明利用不同碳源對(duì)毛栓孔菌TrameteshirsutaMX2漆酶進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，產(chǎn)生兩個(gè)漆酶蛋白，通過(guò)分離純化，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)漆酶蛋白的理化性質(zhì)不同以及對(duì)染料具有協(xié)同脫色作用。本發(fā)明所得的ThLac1漆酶具有如下一種或多種特性：①蛋白分子量61.4kDa，②以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物的最適pH值為2.0，最適溫度為60℃，③以2，6-二甲氧基苯酚(DMP)為底物的最適pH值為4.0，最適溫度為40℃，④對(duì)ABTS的Km值為0.0224mM，對(duì)DMP的Km值為0.7417mM，⑤以ABTS為底物，在pH6.0環(huán)境中，保溫72h后的酶活保持在80％以上。本發(fā)明所得的ThLac2漆酶具有如下一種或多種特性：①蛋白分子量59.1kDa，②以ABTS為底物的最適pH值為2.5，最適溫度為50℃，③以DMP為底物的最適pH值為4.0，最適溫度為70℃，④對(duì)ABTS的Km值為0.0234mM，對(duì)DMP的Km值為0.6130mM，⑤最適pH條件下，以ABTS作為底物，在60℃中保溫300min后的酶活保持在30％左右，其半衰期為3.12h。本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：(1)以白楊木屑或竹屑為碳源比直接用葡萄糖為碳源誘導(dǎo)漆酶的活性要高出18.6-20.8倍，而且白楊木屑或竹屑多為廢棄物，方便易得，可以降低發(fā)酵成本。(2)以白楊木屑或竹屑為碳源可以誘導(dǎo)毛栓孔菌TrameteshirsutaMX2產(chǎn)生兩種理化性質(zhì)各異的漆酶同工酶，ThLac1和ThLac2。ThLac1具有耐偏中性pH環(huán)境的能力(pH6.0下，保持72小時(shí)，殘余活性達(dá)80％以上)，而ThLac2具有較好的熱穩(wěn)定性。(3)ThLac1和ThLac2按一定比例混合使用對(duì)染料的降解脫色率顯著的高于單獨(dú)使用的脫色率。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1為不同碳源對(duì)毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶活性的影響對(duì)比圖；圖2是毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶ThLac1和Thlac2離子交換層析后的吸光值和漆酶活性圖；圖3是含漆酶活性離子交換液的凝膠層析后的吸光值和漆酶活性圖；A：離子交換柱峰1(ThLac1)漆酶活性收集液；B：離子交換柱峰3(ThLac2)漆酶活性收集液；圖4是native-PAGE(A)和SDS-PAGE(B)測(cè)定毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶ThLac1和Thlac2的分子量及酶譜的電泳圖；其中，M為蛋白質(zhì)分子量Marker，泳道1為粗酶液，泳道2為超濾液，泳道3為經(jīng)硫酸銨沉淀透析后的透析液，泳道4為經(jīng)DEAE-SepharoseFF離子交換層以及SephacrylS-200層析后純化的漆酶ThLac1，泳道5為經(jīng)DEAE-SepharoseFF離子交換層以及SephacrylS-200層析后純化的漆酶ThLac2；圖5為pH對(duì)漆酶ThLac1(A)和ThLac2(B)活性的影響對(duì)比圖；圖6為pH對(duì)漆酶ThLac1(A)和ThLac2(B)穩(wěn)定性的影響對(duì)比圖；圖7為溫度對(duì)漆酶ThLac1(A)和ThLac2(B)活性的影響對(duì)比圖；圖8為溫度對(duì)漆酶ThLac1(A)和ThLac2(B)穩(wěn)定性的影響對(duì)比圖；圖9為蒽醌類染料AB129化學(xué)式圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：實(shí)施例1、毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)將馬鈴薯葡萄糖(PDA)斜面培養(yǎng)基保存的毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)接種到固體培養(yǎng)基上活化，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，然后取1塊1*1cm的正方菌餅到含100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在150r/min、28℃下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔1天取1mL培養(yǎng)液到離心管中，4℃低溫10000r/min離心5min，得到上清液作為粗酶液測(cè)定漆酶活性。以ABTS作為底物來(lái)測(cè)定漆酶活性。活性測(cè)定在3mL反應(yīng)體系中：2.8mL濃度為0.5mmol/LABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)的0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)，加入200μL粗酶液。25℃啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)3min內(nèi)420nm處吸光度的變化，已知420nm處ABTS摩爾消光系數(shù)ε420＝3.6×104L/(mol·cm)。以1min轉(zhuǎn)化1μmolABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(IU)。活化用的固體培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯(去皮)200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，蒸餾水1000ml，pH自然。1.0×105Pa、121℃滅菌30min滅菌即可。發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為：碳源20克，酵母提取物10克，磷酸二氫鉀2克，硫酸銨2克，七水硫酸鎂0.5克，氯化鈣0.1克，蒸餾水1000ml，pH自然。1.0×105Pa、121℃滅菌30min滅菌即可。本漆酶誘導(dǎo)培養(yǎng)是通過(guò)改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源種類來(lái)實(shí)現(xiàn)，碳源類型分別為：過(guò)60目篩子的白楊木屑、過(guò)60目篩子的毛竹屑、木質(zhì)素磺酸鈉、葡萄糖、蔗糖和淀粉。各種碳源在14天連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)下對(duì)漆酶活性的影響如圖1所示。根據(jù)圖1，我們得知：當(dāng)蔗糖和淀粉作為碳源時(shí)，毛栓孔菌產(chǎn)漆酶活力在第3、4d達(dá)到高峰，酶活27.40和40.51IU/L，之后逐步下降，葡萄糖作為碳源時(shí)，毛栓孔菌產(chǎn)漆酶活力在第11天達(dá)到高峰，酶活為15.3IU/L。白楊、毛竹和木質(zhì)素磺酸鈉作為碳源時(shí)，毛栓孔菌產(chǎn)漆酶活明顯優(yōu)于葡萄糖、蔗糖和淀粉，其中，白楊在第13天達(dá)到高峰，漆酶活性為318.70IU/L。毛竹、木質(zhì)素磺酸鈉作為碳源時(shí)，毛栓孔菌產(chǎn)漆酶活力較白楊效果次之。實(shí)施例2-1、毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶ThLac1和ThLac2的分離純化以白楊木屑作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，在150r/min、28℃下恒溫振蕩培養(yǎng)13天，將發(fā)酵液在4000rpm/min離心30min，離心后上清液即為粗酶液。將粗酶液經(jīng)過(guò)超濾濃縮、硫酸銨沉淀透析、離子交換層析和凝膠層析等步驟進(jìn)行分離純化，具體過(guò)程如下：①、超濾濃縮：將粗酶液放入濾膜孔徑為10kDa的超濾管中，在4℃、4000rpm/min離心30分鐘，即為超濾液。②、硫酸銨沉淀透析：在超濾液中緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨的最終濃度達(dá)到80％，4℃過(guò)夜，4000rpm/min離心30min，將沉淀用少量0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)溶解；將溶解的酶液裝入透析袋(孔徑為12-14kDa)中，用50倍于酶液的0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)透析24h，中間緩沖液更換3次，之后即為透析液。③、離子交換層析：將透析液以0.4mL/min的流速上樣到已平衡過(guò)的DEAE-SepharoseFF層析柱(25*16mm)中，在AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)用0.5mol/LNaCl和0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)梯度洗脫，流速0.8mL/min，用FractionCollectorFrac-920收集器每1mL收集1管，同時(shí)測(cè)定每管漆酶活性，洗脫曲線如圖2共出現(xiàn)3個(gè)峰，用ABTS分別檢測(cè)各峰值處洗脫液，發(fā)現(xiàn)峰1和峰3處具有很高的漆酶活性，分別記為ThLac1和ThLac2，并對(duì)ThLac1和ThLac2分別超濾濃縮，即為離子交換液。上述梯度洗脫時(shí)，0.5mol/LNaCl、0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)的體積含量如下表1所示。表1具體為：將第6～11管洗脫液合并(對(duì)應(yīng)的洗脫液中，NaCl溶液的體積含量為5.8％，醋酸鈉緩沖液的體積含量為94.2％)，放入10kDa的超濾管中，離心(4℃、4000rpm/min離心30分鐘)，得ThLac1的離子交換液。將第19～23管洗脫液合并(對(duì)應(yīng)的洗脫液中，NaCl溶液的體積含量為13.3％，醋酸鈉緩沖液的體積含量為86.7％)，放入10kDa的超濾管中，離心(4℃、4000rpm/min離心30分鐘)，得ThLac2的離子交換液。④凝膠層析為：分別對(duì)ThLac1和ThLac2的離子交換液上樣已平衡的SephacrylS-200層析柱(90×1.6cm)，用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.8)以0.15mL/min的流速洗脫，用FractionCollectorFrac-920收集器每1mL收集1管，同時(shí)測(cè)定每管漆酶活性。ThLac1離子交換液洗脫后在59～64管僅有一個(gè)漆酶活性峰(見(jiàn)圖3A)，將之合并，放入10kDa的超濾管中，離心(4℃、4000rpm/min離心30分鐘)，成為最終的純化漆酶ThLac1。ThLac2離子交換液洗脫后在57～62管也僅有一個(gè)漆酶活性峰(見(jiàn)圖3B)，將之合并，放入10kDa的超濾管中，離心(4℃、4000rpm/min離心30分鐘)，成為最終的純化漆酶ThLac2。在本發(fā)明中，針對(duì)粗酶液、超濾濃縮、硫酸銨沉淀透析、離子交換層析和凝膠層析等各步驟收集一定樣品進(jìn)行總蛋白含量測(cè)定及漆酶活性測(cè)定，蛋白質(zhì)含量測(cè)定使用Bradford原理，通過(guò)蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(上海生工)測(cè)定，漆酶活性使用ABTS為底物來(lái)測(cè)定。最終的純化漆酶ThLac1的比活力為29.80IU/mg，活性回收率為4.26％，純化倍數(shù)為22.25；漆酶ThLac2的比活力為12.22IU/mg，活性回收率為1.35％，純化倍數(shù)為9.12，見(jiàn)表2。表2、毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶ThLac1和Thlac2的分離純化實(shí)施例2-2、將實(shí)施例2-1中的碳源由白楊木屑改成毛竹屑(過(guò)60目篩)，其余類同于實(shí)施例2-1；結(jié)果如下：最終的純化漆酶ThLac1的比活力為27.5IU/mg，活性回收率為4.02％，純化倍數(shù)為21.2；漆酶ThLac2的比活力為11.5IU/mg，活性回收率為1.02％，純化倍數(shù)為8.17。實(shí)施例2-3、將實(shí)施例2-1中的碳源由白楊木屑改成木質(zhì)素磺酸鈉，其余類同于實(shí)施例2-1；結(jié)果如下：最終的純化漆酶ThLac1的比活力為2.64IU/mg，活性回收率為0.57％，純化倍數(shù)為3.41；漆酶ThLac2的比活力為1.47IU/mg，活性回收率為0.15％，純化倍數(shù)為1.24。實(shí)施例2-4、將實(shí)施例2-1中的碳源由白楊木屑分別改成葡萄糖、蔗糖、淀粉；其余類同于實(shí)施例2-1；結(jié)果如下：當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，所得結(jié)果為：僅能獲得ThLac1，而不能獲得ThLac2；當(dāng)碳源為蔗糖時(shí)，所得結(jié)果為：僅能獲得ThLac1，而不能獲得ThLac2；當(dāng)碳源為淀粉時(shí)，所得結(jié)果為：僅能獲得ThLac1，而不能獲得ThLac2。實(shí)施例3、漆酶ThLac1和ThLac2分子量測(cè)定及酶譜分析純化漆酶ThLac1和ThLac2的分子量測(cè)定采用10％分離膠(w/v)和5％濃縮膠(w/v)的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行測(cè)算。凝膠電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色并顯示拍照保存，再根據(jù)膠中標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker估算分子量。純化漆酶ThLac1和ThLac2的酶譜分析采用10％分離膠(w/v)和5％濃縮膠(w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE)進(jìn)行，其中，凝膠配制中不添加SDS，而且酶液不經(jīng)過(guò)加熱變性直接上樣進(jìn)行電泳，電泳之后，取出凝膠放入含有0.5mmol/LABTS的染色液中活性染色，并顯示拍照保存。圖4(A)顯示的是毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶的native-PAGE酶譜圖，其中第1,2,3泳道中分別是粗酶液、濃縮液(即，超濾液)、透析液的酶譜圖，因?yàn)闆](méi)經(jīng)過(guò)分離，所以各泳道中都顯示出了ThLac1和ThLac2的圖譜(上為ThLac1，下為ThLac2)，第4,5泳道是經(jīng)凝膠層析過(guò)柱后最終的純化漆酶ThLac1和ThLac2的酶譜圖；圖4(B)顯示的是毛栓孔菌(TrameteshirsutaMX2)漆酶的SDS-PAGE電泳圖，其中第1,2,3泳道中分別是粗酶液、濃縮液(即，超濾液)、透析液的電泳圖，第4,5泳道是經(jīng)凝膠層析過(guò)柱后最終的純化漆酶ThLac1和ThLac2的電泳圖。實(shí)施例4、pH和溫度對(duì)漆酶ThLac1和ThLac2活性及穩(wěn)定性的影響1.pH對(duì)漆酶ThLac1和ThLac2活性及穩(wěn)定性的影響在25℃條件下，將純化漆酶ThLac1和ThLac2分別加入不同pH2.0-7.0的0.1mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中，測(cè)定不同pH下對(duì)ABTS和DMP的相對(duì)酶活性；pH對(duì)漆酶穩(wěn)定性的影響通過(guò)漆酶與不同pH2.0-7.0的0.1mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液混合保溫放置0～72h后，分別測(cè)定其對(duì)ABTS和DMP的殘余酶活性。以ABTS作為底物來(lái)測(cè)定漆酶活性?；钚詼y(cè)定在3mL反應(yīng)體系中：2.8mL1mmol/LABTS和相應(yīng)pH的0.1mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，加入200μL粗酶液。25℃啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)3min內(nèi)420nm處吸光度的變化，已知420nm處ABTS摩爾消光系數(shù)ε420＝3.6×104L/(mol·cm)。以1min轉(zhuǎn)化1μmolABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(IU)。以DMP為底物，反應(yīng)體系和步驟同ABTS，不同處在于，測(cè)定470nm處吸光度的變化以及470nm處DMP摩爾消光系數(shù)ε470＝1.48×104L/(mol·cm)。pH對(duì)漆酶ThLac1和ThLac2活性影響如圖5所示。在25℃條件下，在酸性環(huán)境中(pH2.0-4.0)，ThLac1和ThLac2表現(xiàn)出較好的活性。以ABTS作為底物，ThLac1的最適反應(yīng)pH值為2.0，ThLac2的最適反應(yīng)pH值為2.5；以DMP作為底物，ThLac1和ThLac2的最適反應(yīng)pH值均為4.0。圖5中也可以發(fā)現(xiàn)，ABTS作為底物時(shí)，ThLac1在pH2-3.5范圍內(nèi)酶活受pH影響不大，相對(duì)酶活力保持在90％以上，而ThLac2酶活受pH值影響較大，當(dāng)pH大于2.5時(shí)，酶活隨pH上升酶活力不斷下降。pH對(duì)漆酶ThLac1和ThLac2穩(wěn)定性影響如圖6所示。在偏中性環(huán)境中(pH6.0)，ThLac1和ThLac2均表現(xiàn)出較好的pH穩(wěn)定性。以ABTS作為底物，在pH6.00.1mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中保溫72h后，ThLac2的殘余活性保持在55％左右，而ThLac1表現(xiàn)出更穩(wěn)定的特性，殘余活性保持在80％以上，說(shuō)明在偏中性環(huán)境中，ThLac1的穩(wěn)定性優(yōu)于ThLac2的穩(wěn)定性。2.溫度對(duì)漆酶ThLac1和ThLac2活性及穩(wěn)定性的影響在最適pH條件下，將純化漆酶ThLac1和ThLac2分別加入不同溫度10～85℃的緩沖液中，測(cè)定ABTS和DMP為底物的酶活性；溫度對(duì)漆酶熱穩(wěn)定性的影響通過(guò)漆酶在不同溫度50～80℃的緩沖液中，混合保溫放置0～300min后，然后迅速冷卻至室溫，分別測(cè)定其對(duì)ABTS和DMP的殘余酶活性。漆酶對(duì)ABTS和DMP的活性測(cè)定同上所述。溫度對(duì)漆酶ThLac1和ThLac2活性影響如圖7所示。最適pH條件下，ThLac1和ThLac2的活性先隨著溫度的升高而增加，基本上高于50℃達(dá)到最適反應(yīng)溫度，然后漆酶活性隨著溫度的升高開(kāi)始下降。以ABTS作為底物，ThLac1的最適反應(yīng)溫度為60℃，ThLac2的最適反應(yīng)溫度為50℃；以DMP作為底物，ThLac1的最適反應(yīng)溫度為40℃，ThLac2的最適反應(yīng)溫度為70℃。圖7中也可以發(fā)現(xiàn)，ABTS作為底物時(shí)，ThLac1在60-85℃范圍內(nèi)酶活受溫度影響較大，相對(duì)酶活力快速下降，而ThLac2酶活受高溫影響不大，在85℃時(shí)，相對(duì)酶活力仍有65％左右，遠(yuǎn)高于Lac1的16.4％。以DMP作為底物時(shí)，在高溫條件下，ThLac2同樣表現(xiàn)出優(yōu)于ThLac1的活性。溫度對(duì)漆酶ThLac1和ThLac2穩(wěn)定性影響如圖8所示。最適pH條件下，以ABTS作為底物，在60℃0.1mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中保溫300min后，ThLac2的殘余活性保持在30％左右，而ThLac1的殘余活性只有1.9％，說(shuō)明ThLac2表現(xiàn)出優(yōu)于ThLac1的熱穩(wěn)定性。表3顯示了不同溫度下，ThLac1和ThLac2的半衰期。在50℃和60℃條件下，ThLac1的半衰期是4.19h和0.88h，而ThLac2在相同溫度下表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性，半衰期是9.58h和3.12h。表3、不同溫度下漆酶ThLac1和ThLac2的失活常數(shù)和半衰期實(shí)施例5、漆酶ThLac1和ThLac2對(duì)ABTS和DMP米氏常數(shù)Km的測(cè)定在最適pH和最適溫度下，測(cè)定純化漆酶ThLac1和ThLac2對(duì)底物ABTS和DMP的米氏常數(shù)。底物的濃度范圍在0.01～1.0mmol/L之間，酶活測(cè)定方法同實(shí)施例4，然后作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖求Km值。與其他真菌漆酶一樣，ThLac1和ThLac2能催化氧化不同的漆酶底物，并對(duì)底物表現(xiàn)出相似的特異性。表4顯示了漆酶ThLac1和ThLac2分別催化非酚類底物ABTS和酚類底物DMP時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。ABTS的米氏常數(shù)較小，分別為0.0224mmol/L和0.0234mmol/L，而DMP的米氏常數(shù)達(dá)到0.7417mmol/L和0.613mmol/L，表明ThLac1和ThLac2與ABTS的親和性較好。另外，兩種漆酶對(duì)ABTS的催化效率也較高，達(dá)到4092.86S-1mM-1和1547.72S-1mM-1。表4、漆酶ThLac1和ThLac2對(duì)ABTS和DMP的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)實(shí)施例6、漆酶ThLac1和ThLac2對(duì)染料的協(xié)同脫色作用本實(shí)施例中所用染料為蒽醌類的AcidBlue129(AB129)，化學(xué)式見(jiàn)圖9。該染料的最大吸收波長(zhǎng)為629nm，在吸光度OD629為1時(shí)的濃度為208.3mg/L。脫色反應(yīng)步驟為：在1mL的含有208.3mg/LAB129的醋酸鈉緩沖液(0.05mol/L，pH4.8)中加入50IU/L按一定比例配制的ThLac1和ThLac2混合酶量，啟動(dòng)脫色反應(yīng)，3小時(shí)后，分別測(cè)定反應(yīng)前后吸光度OD629，計(jì)算漆酶對(duì)染料的脫色率D％。A0是反應(yīng)前吸光值，A是反應(yīng)后吸光值。脫色率計(jì)算公式為：D％＝(A0-A)/A0×100。其中，ThLac1和ThLac2的比例(在總酶活為0.05IU中的酶活比例)配制為：0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0。漆酶ThLac1和ThLac不同比例下對(duì)AB129染料3小時(shí)后的降解脫色率見(jiàn)表5。當(dāng)單獨(dú)用漆酶ThLac1和ThLac2時(shí)對(duì)AB129的脫色率分別為44.6％和10.1％，顯然，ThLac1的脫色效果要好于ThLac2。但是當(dāng)兩種漆酶以不同比例混合后，其脫色率都要高于兩種漆酶單獨(dú)使用時(shí)脫色率之和。特別是，當(dāng)ThLac1和ThLac2比例在5:5-8:2之間時(shí)，混合脫色率都在80％以上，明顯高于兩種漆酶單獨(dú)使用時(shí)脫色率之和的54.7％，表現(xiàn)出了兩種漆酶對(duì)AB129脫色的協(xié)同增效作用，這為以后染料脫色工業(yè)或者染料廢水處理提供了一條新的思路。表5、漆酶ThLac1和ThLac不同比例下對(duì)AB129染料3小時(shí)后的降解脫色率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)ThLac1:ThLac2比例降解脫色率(％)0:1010.1±2.41:961.6±2.22:868.4±3.83:770.6±3.64:675.6±2.85:580.5±1.96:485.3±3.37:386.8±2.68:285.4±4.29:172.3±1.810:044.6±3.2對(duì)比例1-1、將實(shí)施例2-1“離子交換層析”步驟中的洗脫流速工藝參數(shù)由0.8mL/min改成1.6mL/min或者更快的流速，其余等同于實(shí)施例2-1。所得結(jié)果為：兩種漆酶同工酶會(huì)一起脫洗下來(lái)，達(dá)不到分離效果，具體表現(xiàn)為：脫洗液中只產(chǎn)生一個(gè)漆酶活性波峰，或者兩個(gè)漆酶活性波峰緊密相連，不易分離。對(duì)比例1-2、將實(shí)施例2-1“離子交換層析”步驟中的脫洗液中醋酸鈉緩沖液的pH值工藝參數(shù)由4.8改成4.3或者更低，其余等同于實(shí)施例2-1。所得結(jié)果為：漆酶蛋白不能有效的結(jié)合到離子交換層析柱中，具體表現(xiàn)為：離子交換層析后漆酶的回收率偏低，由目前的(當(dāng)醋酸鈉緩沖液pH為4.8時(shí))8.25％(ThLac1)和6.16％(ThLac2)減少到1.34％(ThLac1)和0.67％(ThLac2)或者更低。對(duì)比例2-1、將實(shí)施例2-1“凝膠層析”步驟中的醋酸鈉緩沖液的脫洗流速工藝參數(shù)由0.15mL/min改成0.4mL/min或者更快的流速，其余等同于實(shí)施例2-1。所得結(jié)果為：漆酶中的雜蛋白不能有效分離，達(dá)不到凝膠層析的目的，具體表現(xiàn)為：脫洗液中蛋白質(zhì)吸收峰僅表現(xiàn)為一個(gè)，或者波峰緊密相連。對(duì)比例2-2、將實(shí)施例2-1“凝膠層析”步驟中的醋酸鈉緩沖液的脫洗流速工藝參數(shù)由0.15mL/min改成0.05mL/min或者更慢的流速，其余等同于實(shí)施例2-1。所得結(jié)果為：凝膠層析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，更加費(fèi)時(shí)；具體表現(xiàn)為：當(dāng)流速為0.05mL/min或者更慢時(shí)，由目前0.15mL/min流速下7.7小時(shí)就可以分離出的ThLac1或者ThLac2，則需要23.3小時(shí)左右才能分離出ThLac1或者ThLac2，層析用時(shí)要增加2倍。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3