本發(fā)明屬于工程菌改造
技術領域：
以及利用工程菌合成聚乳酸的
技術領域：
，具體涉及一種利用細胞修飾后形態(tài)改變的工程大腸桿菌的構建方法、工程大腸桿菌及應用。
背景技術：
：聚乳酸(polylacticacid)是乳酸分子脫水縮合的產物。相比傳統(tǒng)的石油基熱塑材料，聚乳酸制品具有可降解性，生物相容性，低毒性等突出的優(yōu)點；相比其他的生物可降解聚合物，聚乳酸熔點高，結晶度大，熱穩(wěn)定性好，有良好的抗溶劑性，能用多種方式進行加工。因此，聚乳酸廣泛應用于醫(yī)藥材料、食品工程、紡織工業(yè)等領域。作為可以代替石油基熱塑材料的可再生材料，聚乳酸具備越來越重要的商業(yè)價值。目前成熟的聚乳酸工業(yè)制備均采用發(fā)酵-化學聚合二步法：先通過微生物以可再生生物質為原料發(fā)酵和分離乳酸，然后通過化學方法將乳酸聚合為均聚物或共聚物。其流程為含淀粉生物質→糖化→乳酸發(fā)酵→乳酸單體的分離提純→化學聚合。乳酸單體的制備方法有發(fā)酵法、化學合成以及酶化法，其中發(fā)酵法因其工藝簡單，原料充足，食用安全而成為比較成熟的乳酸生產方法在世界范圍內廣泛采用。聚乳酸通常由經典的丙交酯開環(huán)聚合工藝制得，該工藝已經成熟的應用于工業(yè)化生產(Vinketal.,2004MacromolecularBioscience,4:551-564)。丙交酯開環(huán)聚合工藝雖然易于控制，但是也存在著很多缺陷：丙交酯的提純需要多次重結晶、流程長溶劑消耗多，最終產品的收率較低以及污染環(huán)境等。為了克服上述缺點，研究人員開發(fā)出很多替代的聚乳酸化學聚合方法，包括直接熔融縮聚法和不需要溶劑的固相縮聚法(Moonetal,2001HighPerformancePolymers,13(2):S189-S196；Maharanaetal.,2009ProgressinPolymerScience,34:99-124)，但這些方法多需要特殊的催化劑和極端的工藝條件，提高了生產成本并限制了它們的進一步應用。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，繁殖周期短，最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46℃。由于此菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。對于它的培養(yǎng)和代謝可以很好地人為控制，因此常用作發(fā)酵菌。大腸桿菌的這些生理特點說明它在生物發(fā)酵領域有較強的應用前景，已有研究通過對大腸桿菌的遺傳修飾來發(fā)酵生產聚羥基脂肪酸酯，如將大腸桿菌XL1-Blue經過遺傳修飾【敲除原有的乙酸激酶(ackA)基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和乙醇脫氫酶(adhE)基因，用trc啟動子取代D-乳酸脫氫酶(ldhA)基因的啟動子acs】能夠以葡萄糖為唯一碳源，合成的聚乳酸可達細胞干重的11％(JungYKetal.,2009BiotechnologyBioengineering,105:161-170)。將大腸桿菌XL1-Blue經過遺傳修飾【敲除原有的延胡索酸還原酶(frdB)基因，引入外源的丙酰輔酶A轉移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因】能夠以葡萄糖和木糖為碳源合成高濃度的目標產物聚乳酸聚羥乙酸共聚物(PLGA)，發(fā)酵產量可達細胞干重的40％(ChoiSYetal.,2016NatureBiotechnology,34(4):435-442)。因此，目前對于提高發(fā)酵生產聚乳酸產量的方法都是在對工程菌的代謝途徑及關鍵酶的改造方面，并沒有涉及對細胞形態(tài)的改造。技術實現要素：本發(fā)明涉及一種利用形態(tài)改變的工程菌合成聚乳酸的方法，在所述遺傳修飾的工程大腸桿菌中通過過表達抑制細胞分裂的基因使細胞內體積變大，從而增加聚乳酸的產量。為了實現上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案予以實現：一種形態(tài)改變的工程大腸桿菌的構建方法，步驟為1)以質粒PACYCDuet-1為出發(fā)質粒，將用于合成聚乳酸的外源性丙酰輔酶A轉移酶PCT基因和PHA合成酶基因引入質粒并導入大腸桿菌BL21；2)通過PCR的方法對合成乳酸酯的乳酸脫氫酶LDH基因引入突變位點，提高酶的活性；以質粒pTrcHis2B為出發(fā)質粒，將遺傳修飾后的LDH基因引入質粒并轉導到大腸桿菌BL21中，得到pTrcHis2B-LDH，使其表達的乳酸酯高于未遺傳修飾的對照宿主菌；3)對SOS細胞分裂抑制sulA基因進行突變，以質粒pTrcHis2B-LDH為出發(fā)質粒，通過同源重組的方法將突變后的sulA基因引入質粒并導入大腸桿菌BL21中，通過過表達突變后的sulA基因，抑制細胞分裂，增大細胞內體積，得到工程大腸桿菌。由于微生物包涵體的積累總是受到微生物細胞大小的限制，本發(fā)明所述的工程大腸桿菌經過遺傳修飾抑制細胞分裂FtsZ環(huán)的裝配，改變細胞形態(tài)，使棒狀大腸桿菌變成纖維狀，增大了細胞體積，因此增加了細胞包涵體的產量。進一步，步驟1)中對轉移酶PCT基因進行優(yōu)化，得到PCTcp，序列為SEQIDNO:1。進一步，步驟1)中對PHA合成酶基因進行優(yōu)化，得到PHApse，序列為SEQIDNO:2。進一步，步驟2)遺傳修飾后的LDH基因的序列為SEQIDNO:3。進一步，步驟3)突變后的sulA基因的序列為SEQIDNO:4。本發(fā)明還保護經上述構建方法得到的工程大腸桿菌。本發(fā)明的工程大腸桿菌應用于合成乳酸、聚乳酸或3羥基丙酸共聚物；具體是以葡萄糖為底物合成聚乳酸，轉化時溫度為35-37℃，是在溫和的條件下進行。與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：本發(fā)明構建了遺傳修飾的大腸桿菌，使之適用于將葡萄糖底物發(fā)酵轉化為聚乳酸，并增加了聚乳酸的產量。采用的技術手段是，在工程大腸桿菌中過表達乳酸脫氫酶(LDH)基因，大大增加了乳酸酯的形成。同時引入外源性丙酰輔酶A轉移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因，丙酰輔酶A轉移酶基因能顯著增加聚乳酸前體乳酰輔酶A的產量，PHA合成酶基因能促進乳酰輔酶A的聚合。然后通過過表達sulA基因進行遺傳修飾，抑制細胞分裂，使得大腸桿菌細胞形態(tài)由棒狀變成纖維狀，增大了細胞內體積，使得聚乳酸的產量高于現有的傳統(tǒng)棒狀大腸桿菌的發(fā)酵產量。同時，相互纏繞的纖維狀細胞比單一的棒狀細胞重，更容易從發(fā)酵液中沉淀出來，降低下游分離成本，使整體的生產成本得到降低，經濟性得到提高。附圖說明圖1.實施例3中核磁共振氫譜圖；圖2.實施例3中核磁共振碳譜圖；圖3.實施例3中紅外譜圖。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例1步驟1)含外源性丙酰輔酶A轉移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因的表達載體的構建。根據已公布的丙酸桿菌(Clostridumpropionicum)丙酰輔酶A轉移酶(PCT)基因(ChoiSYetal.,2016NatureBiotechnology,34(4):435-442)和假單胞菌(Pseudomonassp.)MBEL6-19的PHA合成酶基因(YangTHetal.,2011ApplMicrobiolBiotechnol,90:603-614)的全長序列信息，對兩個序列進行優(yōu)化使之適用于在大腸桿菌中進行表達，優(yōu)化后得到PCTcp(序列為SEQIDNO:1)和PHApse(序列為SEQIDNO:2)。根據PHApse進行化學合成，合成時分別在序列的兩端加上NdeI和XhoI酶切位點的序列。分別用NdeI和XhoI酶切通用表達質粒PACYCDuet-1和合成的線性DNA片段并連接為新表達載體PACYC-PHApse。根據PCTcp進行化學合成，并用同源重組的方法無縫克隆到表達質粒PACYC-PHApse中，構建表達載體PACYC-PHApse-PCTcp。步驟2)乳酸脫氫酶(LDH)基因和SOS細胞分裂抑制(sulA)基因的過表達。設計引物(見表1)從大腸桿菌BL21(DE3)中克隆出乳酸脫氫酶(LDH)基因和SOS細胞分裂抑制(sulA)基因。分別在基因的上游和下游設計15bp的同源臂，用同源重組的方法克隆到通用表達質粒pTrcHis2B中構建表達載體pTrcHis2B-LDH-sulA。其中LDH優(yōu)化基因的序列為SEQIDNO:3。本實施例還對sulA基因的幾個位點進行了突變，具體是L23E,I80E,F106A,C69G,A360G,T495C，突變后的sulA基因的序列為SEQIDNO:4，使其更適應大腸桿菌，能在大腸桿菌中穩(wěn)定表達，而且有利于增加底物特異性，提高表達量，加強對FtsZ環(huán)的抑制作用，使細胞增大，增加聚乳酸產量。表1擴增目的基因的引物序列步驟3)工程大腸桿菌的構建。將表達載體PACYC-PHApse-PCTcp和pTrcHis2B-LDH-sulA通過傳統(tǒng)的熱激轉化法轉入大腸桿菌BL21中，構建生產聚乳酸的工程大腸桿菌。實施例2利用實施例1中構建的工程大腸桿菌以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產聚乳酸。使用該菌株發(fā)酵生產聚乳酸的條件為：在1L發(fā)酵體系中(上海百侖，1L生物反應器)使用400mL裝液量，接種量5％，發(fā)酵溫度37℃，pH值控制在6.95，培養(yǎng)基組分見表2，初始葡萄糖添加量為20g/L，攪拌速度為300至600rap/min，溶氧控制在體積濃度為10％-30％，發(fā)酵72h后，離心培養(yǎng)液收集菌體。菌體沉淀用乙醇洗一次，蒸餾水洗兩次，然后再烘干。烘干后的菌體用索氏提取法提取聚乳酸。表2實驗用培養(yǎng)基組成以不同遺傳修飾的工程大腸桿菌(見表3)發(fā)酵聚乳酸的產量見表4。產物用核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和紅外分析，1HNMR和13CNMR分別在500MHz和125MHz由BrukerAM-500MHz光譜儀檢測，條件及結果見圖1-3。表3外源基因的遺傳修飾外源基因氨基酸取代PCTcpV193APHApseE130D,S325T,S477G,Q481K表4不同遺傳修飾下的聚乳酸產量從以上結果可以看出，丙酰輔酶A轉移酶和PHA合成酶存在的情況下可以合成可提取量的聚乳酸。僅過表達乳酸脫氫酶基因沒有聚合物產生，而與丙酰輔酶A轉移酶和PHA合成酶共同存在的情況下聚乳酸產量大大增加，說明前體乳酸酯的量是決定聚乳酸產量的關鍵因素之一。過表達sulA基因后，聚乳酸產量明顯增加，說明所構建的纖維狀大腸桿菌增大了細胞內空間，從而能增加聚乳酸的產量。以上實施例僅是本發(fā)明若干種優(yōu)選實施方式中的幾種，應當指出，本發(fā)明不限于上述實施例；對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明所要求保護的技術方案的精神和范圍。SEQUENCELISTING<110>青島科技大學<120>一種形態(tài)改變的工程大腸桿菌的構建方法、工程大腸桿菌及應用<130><160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1572<212>DNA<213>人工序列<400>1ATGCGCAAAGTGCCGATTATTACCGCGGATGAAGCGGCGAAACTGATTAAAGATGGCGAT60ACCGTGACCACCTCAGGCTTTGTGGGCAATGCGATTCCGGAAGCGCTGGATCGCGCGGTG120GAAAAACGCTTTCTGGAAACCGGCGAACCGAAAAATATTACCTATGTTTATTGTGGTAGC180CAGGGTAATCGTGATGGTCGTGGTGCAGAACATTTTGCCCATGAAGGTCTGCTGAAACGT240TATATTGCCGGTCATTGGGCCACCGTTCCGGCCCTGGGTAAAATGGCAATGGAAAATAAA300ATGGAAGCATATAATGTTAGCCAGGGTGCACTGTGTCATCTGTTTCGTGATATTGCAAGC360CATAAACCGGGTGTTTTTACCAAAGTTGGTATTGGTACCTTTATTGATCCGCGTAATGGT420GGCGGCAAAGTGAATGATATTACCAAAGAAGATATTGTGGAACTGGTGGAAATTAAAGGT480CAGGAATATCTGTTTTATCCGGCCTTTCCGATTCATGTGGCGCTGATTCGCGGCACCTAT540GCGGATGAATCAGGCAATATTACCTTTGAAAAAGAAGCCGCCCCGCTGGAAGGTACCAGT600GTTTGTCAGGCTGTGAAAAATTCTGGCGGCATTGTGGTGGTTCAGGTTGAACGTGTTGTT660AAAGCAGGTACCCTGGATCCGCGCCATGTGAAAGTGCCGGGCATTTATGTGGATTATGTG720GTGGTGGCTGATCCGGAAGATCATCAGCAGTCACTGGATTGCGAATATGATCCGGCGCTG780AGCGGTGAACATCGTCGTCCGGAAGTTGTTGGTGAACCGCTGCCGCTGAGTGCCAAAAAA840GTGATTGGCCGCCGCGGCGCGATTGAACTGGAAAAAGATGTGGCGGTGAATCTGGGCGTG900GGCGCCCCGGAATATGTTGCCTCAGTGGCGGATGAAGAAGGCATTGTTGATTTTATGACC960CTGACCGCTGAATCTGGCGCTATTGGTGGTGTTCCGGCAGGCGGCGTGCGCTTTGGCGCC1020AGTTATAATGCCGATGCCCTGATTGATCAGGGTTATCAGTTTGATTATTATGATGGTGGT1080GGTCTGGATCTGTGTTATCTGGGCCTGGCTGAATGCGATGAAAAAGGCAATATTAATGTG1140TCACGCTTTGGCCCGCGTATTGCCGGTTGCGGCGGCTTTATTAATATTACCCAGAATACC1200CCGAAAGTGTTTTTTTGCGGCACCTTTACCGCTGGCGGCCTGAAAGTGAAAATTGAAGAT1260GGTAAAGTTATTATTGTGCAGGAAGGTAAACAGAAAAAATTTCTGAAAGCGGTGGAACAG1320ATTACCTTTAATGGCGATGTGGCCCTGGCCAATAAACAGCAGGTGACCTATATTACCGAA1380CGTTGCGTGTTTCTGCTGAAAGAAGATGGTCTGCATCTGTCAGAAATTGCCCCGGGCATT1440GATCTGCAGACCCAGATTCTGGATGTTATGGATTTTGCTCCGATTATTGATCGCGATGCG1500AATGGCCAGATTAAACTGATGGATGCAGCACTGTTTGCAGAAGGTCTGATGGGCCTGAAA1560GAAATGAAATCA1572<210>2<211>1680<212>DNA<213>人工序列<400>2ATGTCAAATAAAAGCAATGATGAACTGAAATATCAGGCGTCAGAAAATACCCTGGGCCTG60AATCCGGTGGTGGGCCTGCGCGGCAAAGATCTGCTGGCGTCAGCGCGTATGGTGCTGCGC120CAGGCGATTAAACAGCCGGTGCATTCAGTGAAACATGTGGCGCATTTTGGCCTGGAACTG180AAAAATGTGCTGCTGGGCAAATCAGGCCTGCAGCCGACCTCAGATGATCGCCGCTTTGCG240GATCCGGCGTGGTCACAGAATCCGCTGTATAAACGCTATCTGCAGACCTATCTGGCGTGG300CGCAAAGAACTGCATGATTGGATTGATGAATCAAATCTGGCGCCGAAAGATGTGGCGCGC360GGCCATTTTGTGATTAATCTGATGACCGATGCGATGGCGCCGACCAATACCGCGGCCAAT420CCGGCCGCTGTGAAACGCTTTTTTGAAACCGGCGGCAAATCTCTGCTGGATGGCCTGTCT480CATCTGGCTAAAGATCTGGTGCATAATGGCGGTATGCCGAGCCAGGTTAATATGGGTGCA540TTTGAAGTTGGTAAAAGTCTGGGTGTTACCGAAGGTGCCGTTGTTTTTCGTAATGATGTT600CTGGAACTGATTCAGTATAAACCGACCACCGAACAGGTTTATGAACGTCCGCTGCTGGTG660GTGCCGCCGCAGATTAATAAATTTTATGTGTTTGATCTGTCACCGGATAAAAGCCTGGCT720CGCTTTTGCCTGCGCAATAATGTGCAGACCTTTATTGTGTCTTGGCGCAATCCGACCAAA780GAACAGCGTGAATGGGGTCTGAGCACCTATATTGAAGCACTGAAAGAAGCCGTGGATGTG840GTGACCGCCATTACCGGCAGTAAAGATGTTAATATGCTGGGTGCCTGTAGTGGTGGTATT900ACCTGCACCGCTCTGCTGGGCCATTATGCTGCTATTGGCGAAAATAAAGTGAATGCCCTG960ACCCTGCTGGTGACCGTTCTGGATACCACCCTGGATAGCGATGTTGCACTGTTTGTTAAT1020GAACAGACCCTGGAAGCAGCAAAACGTCATAGCTATCAGGCCGGTGTTCTGGAAGGTCGT1080GATATGGCTAAAGTTTTTGCTTGGATGCGTCCGAATGATCTGATTTGGAATTATTGGGTT1140AATAATTATCTGCTGGGTAATGAACCGCCGGTTTTTGATATTCTGTTTTGGAATAATGAT1200ACCACCCGTCTGCCGGCCGCCTTTCATGGCGATCTGGTTGAACTGTTTAAAAATAATCCG1260CTGATTCGTCCGAATGCACTGGAAGTTTGTGGTACCCCGATTGATCTGAAACAGGTTACC1320GCAGATATTTTTAGCCTGGCAGGTACCAATGATCATATTACCCCGTGGAAATCTTGCTAT1380AAATCTGCTCAGCTGTTTGGCGGCAATGTTGAATTTGTTCTGAGTAGTGGTGGTCATATT1440AAAAGCATTCTGAATCCGCCGGGCAATCCGAAAAGTCGTTATATGACCTCTACCGAAGTT1500GCAGAAAATGCAGATGAATGGCAGGCAAATGCCACCAAACATACCGATTCTTGGTGGCTG1560CATTGGCAGGCCTGGCAGGCTCAGCGTTCTGGTGAACTGAAAAAAAGCCCGACCAAACTG1620GGTAGTAAAGCATATCCGGCTGGTGAAGCTGCACCGGGTACCTATGTTCATGAACGTTAA1680<210>3<211>990<212>DNA<213>人工序列<400>3ATGAAGCTGGCGGTGTACAGCACCAAACAGTACGACAAGAAATATCTGCAGCAAGTTAAC60GAGAGCTTCGGTTTTGAGCTGGAATTCTTTGATTTCCTGCTGACCGAGAAGACCGCGAAA120ACCGCGAACGGTTGCGAAGCGGTGTGCATCTTTGTTAACGACGATGGCAGCCGTCCGGTG180CTGGAGGAACTGAAGAAACACGGTGTTAAGTACATTGCGCTGCGTTGCGCGGGCTTCAAC240AACGTGGACCTGGATGCGGCGAAGGAGCTGGGTCTGAAAGTGGTTCGTGTGCCGGCGTAT300GACCCGGAGGCGGTTGCGGAACACGCGATCGGCATGATGATGACCCTGAACCGTCGTATT360CACCGTGCGTACCAGCGTACCCGTGATGCGAACTTCAGCCTGGAAGGTCTGACCGGCTTT420ACCATGTATGGCAAGACCGCGGGCGTGATCGGTACCGGCAAAATTGGTGTTGCGATGCTG480CGTATCCTGAAAGGTTTCGGCATGCGTCTGCTGGCGTTTGACCCGTACCCGAGCGCGGCG540GCGCTGGAGCTGGGCGTGGAATATGTTGACCTGCCGACCCTGTTCAGCGAAAGCGATGTT600ATTAGCCTGCACTGCCCGCTGACCCCGGAGAACTACCACCTGCTGAACGAAGCGGCGTTT660GACCAAATGAAGAACGGTGTGATGATCGTTAACACCAGCCGTGGTGCGCTGATCGACAGC720CAGGCGGCGATTGAGGCGCTGAAGAACCAAAAAATTGGTAGCCTGGGCATGGACGTGTAT780GAGAACGAACGTGACCTGTTCTTCGAAGACAAAAGCAACGATGTGATCCAGGACGATGTT840TTTCGTCGTCTGAGCGCGTGCCACAACGTTCTGTTCACCGGTCACCAAGCGTTTCTGACC900GCGGAGGCGCTGACCAGCATTAGCCAGACCACCCTGCAAAACCTGAGCAACCTGGAGAAG960GGCGAAACCTGCCCGAACGAACTGGTGTAA990<210>4<211>510<212>DNA<213>人工序列<400>4ATGTACACCAGCGGTTATGCGCACCGTAGCAGCAGCTTCAGCAGCGCGGCGAGCAAGATC60GCGCGTGTGAGCACCGAAAACACCACCGCGGGCCTGATTAGCGAAGTGGTTTACCGTGAG120GACCAGCCGATGATGACCCAACTGCTGCTGCTGCCGCTGCTGCAGCAACTGGGTCAGCAA180AGCCGTTGGCAGCTGTGGCTGACCCCGCAGCAAAAGCTGAGCCGTGAATGGGTGCAAGCG240AGCGGTCTGCCGCTGACCAAAGTTATGCAGATCAGCCAACTGAGCCCGTGCCACACCGTG300GAGAGCATGGTTCGTGCGCTGCGTACCGGTAACTACAGCGTGGTTATTGGCTGGCTGGCG360GACGATCTGACCGAGGAAGAGCACGCGGAACTGGTGGATGCGGCGAACGAGGGTAACGCG420ATGGGCTTTATCATGCGTCCGGTTAGCGCGAGCAGCCACGCGACCCGTCAGCTGAGCGGT480CTGAAAATTCACAGCAACCTGTATCACTAA510當前第1頁1 2 3