本發(fā)明涉及融合蛋白表達純化方法技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種融合蛋白表達純化方法。

背景技術(shù)：

在生命科學(xué)研究和生物制品的生產(chǎn)過程中，利用表達載體制備重組蛋白時最重要的技術(shù)之一，獲得大量有活性的重組蛋白是進行生物制品研究和生產(chǎn)的必要條件。構(gòu)建有效的表達載體是表達目的基因的基本要求，同時也是影響基因表達水平及蛋白活性的重要因素。一般來說，非融合型表達載體雖然能較好的保持外源蛋白的一級結(jié)構(gòu)，但其表達量較低、外源蛋白分離純化困難，回收率低，分離純化工藝復(fù)雜，工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)的成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白表達純化方法，具有表達量高、外源蛋白分離純化簡單、回收率高、分離純化工藝簡便和成本低的優(yōu)點，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種融合蛋白表達純化方法，包括以下實驗用品：1ul重組的pET32a質(zhì)粒、BL21(DE3)菌株、100ug/ml氨芐青霉素、0.5mM的IPTG、PBS緩沖液、220rpm、2M尿素、50mMTris、300mMNaCl、1mMDTT、溶菌酶、0.2%TritonX-100、5mL NI-NTA、EK酶、鎳瓊脂糖親和層析和SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒。

一種融合蛋白表達純化方法，包括以下實驗過程：

S1:融合蛋白的原核表達；

S2:融合蛋白的純化；

S3:分析純化后融合蛋白，通過SDS-PAGE電泳和灰度分析，檢測分析純化后融合蛋白的純度，用SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

優(yōu)選的，所述S1包含以下步驟：

S1-1：轉(zhuǎn)化，取1ul重組的pET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，42℃熱擊90s，冰上靜置2min后涂平板(100ug/ml氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)過夜；

S1-2：選擇誘導(dǎo)條件；

S1-3：大量誘導(dǎo)，將培養(yǎng)的菌液按1:100比例接種于4L 的LB液體培養(yǎng)基中，添加100ug/ml氨芐青霉素，37℃，220rpm培養(yǎng)，當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5mM的IPTG，20℃，220rpm，誘導(dǎo)過夜，離心收集細胞菌體。

優(yōu)選的，所述S2包含以下步驟：

S2-1：超聲破碎菌體；

S2-2：鎳瓊脂糖親和層析。

優(yōu)選的，所述S3包含以下步驟：

S3-1：融合蛋白的表達及定位，通過S1和S2步驟小試樣品進行SDS-PAGE分析；

S3-2：融合蛋白的純化，SerD融合蛋白鎳瓊脂糖親和層析純化后，SDS-PAGE分析；

S3-3：融合蛋白Western-Blot分析，SerD純化的融合蛋白經(jīng)過Western-Blot分析；

S3-4：SerD融合蛋白EK酶切鎳瓊脂糖親和層析SDS-PAGE分析，SerD融合蛋白EK酶切后鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE分析；

S3-5：蛋白濃度測定，用SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度:0.8mg/ml，BSA濃度為2mg/ml，測定的蛋白體積為20ul。

優(yōu)選的，所述S1-2還包括以下步驟：

S1-2-1：挑取表達菌株BL21(DE3)的單菌落于試管中（4mL LB培養(yǎng)基加100ug/ml氨芐青霉素）37℃，220rpm過夜培養(yǎng)；

S1-2-2：將培養(yǎng)的菌液按1:100比例分別接種于4mL的LB培養(yǎng)基中，添加100ug/ml氨芐青霉素，37℃，220rpm培養(yǎng)；

S1-2-3：當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5mM的IPTG，分別20℃，220rpm，誘導(dǎo)16h和37℃，220rpm誘導(dǎo)4h，未加IPTG 誘導(dǎo)劑的作為陰性對照；

S1-2-4：收集菌體并用PBS緩沖液懸浮；

S1-2-5：SDS-PAGE電泳檢測，選擇最佳的蛋白表達誘導(dǎo)條件。

優(yōu)選的，所述S2-1還包括以下步驟：

S2-1-1：將收集的細菌菌體用破碎Buffer（2M尿素，50mMTris，300mMNaCl，1mMDTT，溶菌酶，0.2%TritonX-100，pH=8.0）溶解，冰浴中超聲破碎菌體，功率400W，20min（超聲3S，暫停5S為一個循環(huán)）；

S2-1-1：超聲完畢，12000rpm，4℃，離心20min，上清做下一步純化。

優(yōu)選的，所述S2-2還包括以下步驟：

S2-2-1：取5mL NI-NTA，用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。將樣品和平衡好的柱料4℃孵育1h；

S2-2-2：樣品上柱，流速為2mL/min，收集穿透液；

S2-2-3：10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液清洗柱子，流速10mL/min；

S2-2-4：洗雜，流速5ml/min，收集洗脫液；

S2-2-5：洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本融合蛋白表達純化方法，采用SDS-PAGE檢測，將(500mM咪唑)含目標蛋白洗脫液透析到1M尿素，50mMTris，300mMNaCl，pH8.0緩沖液中，4℃透析過夜，將透析過夜的樣品加入EK酶(EK酶的量是1：1000（EK酶量：蛋白量）)，4℃酶切過夜，酶切后的蛋白過鎳瓊脂糖親和層析，去除標簽和EK酶，通過SDS-PAGE電泳和灰度分析，檢測分析純化后融合蛋白的純度，用SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，使其相比較非融合型表達載體具有表達量高、外源蛋白分離純化簡單、回收率高、分離純化工藝簡便和成本低的優(yōu)點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的小試樣品進行SDS-PAGE分析結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明的SerD融合蛋白鎳瓊脂糖親和層析純化后，SDS-PAGE分析結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明的SerD純化的融合蛋白經(jīng)過Western-Blot分析結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明的SerD融合蛋白EK酶切后鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE分析結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明的蛋白濃度測定結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行親楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種融合蛋白表達純化方法，包括以下實驗用品：1ul重組的pET32a質(zhì)粒、BL21(DE3)菌株、100ug/ml氨芐青霉素、0.5mM的IPTG、PBS緩沖液、220rpm、2M尿素、50mMTris、300mMNaCl、1mMDTT、溶菌酶、0.2%TritonX-100、5mL NI-NTA、EK酶、鎳瓊脂糖親和層析和SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒。

一種融合蛋白表達純化方法，包括以下實驗過程：

S1:融合蛋白的原核表達，轉(zhuǎn)化，取1ul重組的pET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，42℃熱擊90s，冰上靜置2min后涂平板(100ug/ml氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)過夜；選擇誘導(dǎo)條件，挑取表達菌株BL21(DE3)的單菌落于試管中（4mL LB培養(yǎng)基加100ug/ml氨芐青霉素）37℃，220rpm過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)的菌液按1:100比例分別接種于4mL的LB培養(yǎng)基中，添加100ug/ml氨芐青霉素，37℃，220rpm培養(yǎng)：當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5mM的IPTG，分別20℃，220rpm，誘導(dǎo)16h和37℃，220rpm誘導(dǎo)4h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的作為陰性對照：收集菌體并用PBS緩沖液懸??；SDS-PAGE電泳檢測，選擇最佳的蛋白表達誘導(dǎo)條件；大量誘導(dǎo)，將培養(yǎng)的菌液按1:100比例接種于4L 的LB液體培養(yǎng)基中，添加100ug/ml氨芐青霉素，37℃，220rpm培養(yǎng)，當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5mM的IPTG，20℃，220rpm，誘導(dǎo)過夜，離心收集細胞菌體；

S2:融合蛋白的純化，超聲破碎菌體，將收集的細菌菌體用破碎Buffer（2M尿素，50mMTris，300mMNaCl，1mMDTT，溶菌酶，0.2%TritonX-100，pH=8.0）溶解，冰浴中超聲破碎菌體，功率400W，20min（超聲3S，暫停5S為一個循環(huán)）；超聲完畢，12000rpm，4℃，離心20min，上清做下一步純化；鎳瓊脂糖親和層析，取5mL NI-NTA，用10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液清洗平衡柱子，流速5mL/min。將樣品和平衡好的柱料4℃孵育1h；樣品上柱，流速為2mL/min，收集穿透液；10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液清洗柱子，流速10mL/min；洗雜（2M尿素，50mMTris，300mMNaCl，10/50mM咪唑，pH=8.0），流速5ml/min，收集洗脫液；洗脫（2M尿素，50mMTris，300mMNaCl，500mM咪唑，pH=8.0），流速2ml/min，收集洗脫液；

S3:分析純化后融合蛋白，通過SDS-PAGE電泳和灰度分析，檢測分析純化后融合蛋白的純度，用SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，融合蛋白的表達及定位，通過S1和S2步驟小試樣品進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖一；融合蛋白的純化，SerD融合蛋白鎳瓊脂糖親和層析純化后，SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖二；融合蛋白Western-Blot分析，SerD純化的融合蛋白經(jīng)過Western-Blot分析，結(jié)果如圖三；SerD融合蛋白EK酶切鎳瓊脂糖親和層析SDS-PAGE分析，SerD融合蛋白EK酶切后鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖四；蛋白濃度測定，用SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度:0.8mg/ml，BSA濃度為2mg/ml，測定的蛋白體積為20ul，測定結(jié)果如圖五。

綜上所述：本發(fā)明使用了一種融合蛋白表達純化的方法，采用SDS-PAGE檢測，將(500mM咪唑)含目標蛋白洗脫液透析到1M尿素，50mMTris，300mMNaCl，pH8.0緩沖液中，4℃透析過夜，將透析過夜的樣品加入EK酶(EK酶的量是1：1000（EK酶量：蛋白量）)，4℃酶切過夜，酶切后的蛋白過鎳瓊脂糖親和層析，去除標簽和EK酶，通過SDS-PAGE電泳和灰度分析，檢測分析純化后融合蛋白的純度，用SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，使其相比較非融合型表達載體具有表達量高、外源蛋白分離純化簡單、回收率高、分離純化工藝簡便和成本低的優(yōu)點。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。