本發(fā)明涉及生物技術(shù)與分子標(biāo)記，具體地說，涉及一種與大豆植酸磷利用效率相關(guān)的功能標(biāo)記。
背景技術(shù)：
：土壤磷有50％～80％以有機(jī)態(tài)形式存在，植酸磷占一半以上；且植酸磷大多不溶于水，不能被植物直接吸收利用(lungetal.,2006；bilyeuetal.,2008；georgeetal.,2008)。同時(shí)，每年施入土壤的大部分磷肥還會(huì)由于吸附、沉降和轉(zhuǎn)化作用成為有機(jī)態(tài)形式而被固定于土壤，不能被當(dāng)季植物吸收(baeketal.,2013；wangetal.,2013)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年約施用1100萬噸純磷，占世界總用量30％左右，但磷肥當(dāng)季利用率卻僅有10％～15％，相當(dāng)于每年約有1000萬噸純磷積累于土壤，形成植物不能直接利用的非有效態(tài)(吳平，2010)。由此可見，土壤中的總磷含量并不低，只是植物可吸收利用的有效態(tài)磷含量較低，即所謂的“遺傳學(xué)缺磷”，土壤現(xiàn)已成為巨大的“潛在磷庫”，亟待開發(fā)利用(roseetal.,2013；tengetal.,2013)。因此，如何充分利用土壤中的有機(jī)態(tài)磷(尤其是植酸磷)，減少外部磷肥施入量就成為磷素營養(yǎng)研究中的重要課題，對于提高磷肥利用效率、解決植物磷素短缺、緩解磷肥危機(jī)及減少環(huán)境磷污染等均具有重要意義。磷利用效率是多基因控制的數(shù)量性狀，通過傳統(tǒng)育種很難達(dá)到預(yù)期的效果，分子標(biāo)記輔助育種為改良作物磷利用效率提供了新的途徑。分子標(biāo)記作為較理想的遺傳標(biāo)記，能夠直接反映生物個(gè)體間dna水平的差異(clarketal.,1974；丁玉川等,2004；simonsetal.,2014)。諸多學(xué)者利用rflp、rapd、aflp、ssr、snp等分子標(biāo)記進(jìn)行了qtl分析，發(fā)掘了一些與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記(salvietal.,2005；wissuwaetal.,2005)。gamuyao等發(fā)現(xiàn)水稻pup1與磷利用緊密連鎖，可用于分子輔助育種，并根據(jù)該位點(diǎn)克隆了水稻pstol1(phosphorus-starvationtolerance1)，該基因編碼一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，超量表達(dá)pstol1顯著提高水稻磷的吸收和產(chǎn)量，進(jìn)一步證明pup1的可靠性。有學(xué)者通過分析g19833(磷高效菜豆)和dor364(磷低效菜豆)發(fā)現(xiàn)，磷高效基因型中缺少一個(gè)酸性磷酸酶亞型，同時(shí)對二者重組自交系群體的葉片酸性磷酸酶活性分析發(fā)現(xiàn)，其分布接近1:1，表明該表現(xiàn)差異可能由單基因或單主效基因控制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)f701d與葉片酸性磷酸酶活性緊密連鎖(liangetal.,2010)。li等根據(jù)株高、地上部鮮重、根系鮮重、根系干重、根長、葉中磷含量、根中磷含量定位了大豆磷營養(yǎng)效率相關(guān)性狀的qtl位點(diǎn)(lietal.,2005)；zhang等對大豆磷利用相關(guān)性狀進(jìn)行了qtl，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sat_183，sat_724與大豆磷效率利用連鎖(zhangetal.,2009)。盡管qtl定位了許多與磷利用效率相關(guān)的分子標(biāo)記，然而這些標(biāo)記通常與目標(biāo)基因距離較遠(yuǎn)，并且評價(jià)這些標(biāo)記與性狀連鎖的緊密程度限于作圖群體，因此很少一部分用于分子輔助育種?；蚬δ軜?biāo)記與該基因控制的性狀緊密聯(lián)系，通過其檢測的序列多態(tài)性與表型直接相關(guān)，且與性狀完全共分離。因此，該類標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助育種準(zhǔn)確性更高?；蚬δ軜?biāo)記開發(fā)基于功能明確的基因以及該基因在品種間的等位變異(andersenetal.,2003)。目前，基因功能標(biāo)記開發(fā)已在小麥、水稻等作物深入研究。何心堯等克隆了普通小麥2a和2d染色體上ppo基因ppo-a1與ppo-d1全長序列，針對ppo-d1位點(diǎn)等位變異ppo-d1a和ppo-d1b分別開發(fā)了顯性標(biāo)記ppo16和ppo29，ppo16在低ppo活性品種擴(kuò)增713bp條帶，而ppo29在高ppo活性品種擴(kuò)增490bp條帶，且與ppo活性相關(guān)(heetal.,2007)。hur等(huretal.,2013)克隆了不同抗性水稻中xa3，序列比對發(fā)現(xiàn)，序列間存在多態(tài)性，根據(jù)其多態(tài)性開發(fā)了顯性功能標(biāo)記bb3-rf/bb3-rr，該標(biāo)記僅在抗病品系中擴(kuò)增出255bp條帶。大豆基因功能標(biāo)記開發(fā)鮮有報(bào)道，juwattanasomran等根據(jù)控制大豆芳香氣味gmbadh2等位變異，開發(fā)了snp標(biāo)記，該標(biāo)記能夠區(qū)分芳香氣味品種和無芳香氣味品種，同時(shí)該標(biāo)記已用于分子標(biāo)記輔助育種培育芳香氣味大豆品種(juwattanasomranetal.,2011；juwattanasomranetal.,2012)。然而至今，尚無與大豆磷利用效率相關(guān)的功能標(biāo)記研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種與大豆植酸磷利用效率相關(guān)的功能標(biāo)記及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明首先提供了一種與大豆植酸磷利用效率相關(guān)的功能標(biāo)記gmpap14-intron5-36，所述功能標(biāo)記正向引物序列為：5′-atgatttcagacaaacacgattc-3′；所述功能標(biāo)記反向引物序列：5′-acagctgacgaatgcaatttaac-3′。進(jìn)一步地，本發(fā)明基于所述功能標(biāo)記，提供了其在判斷大豆品種植酸磷利用效率方面的應(yīng)用。所述應(yīng)用具體為：以待測大豆樣本基因組dna為模板，利用所述功能標(biāo)記進(jìn)行pcr擴(kuò)增，若擴(kuò)增出241bp特異片段，則判斷樣本為磷高效大豆品種，若擴(kuò)增出277bp特異片段，則判斷樣本為磷低效大豆品種。進(jìn)一步地，pcr體系為：pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min?；谏鲜鰬?yīng)用，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了所述功能標(biāo)記在大豆品種分子標(biāo)記輔助選擇育種方面的應(yīng)用。進(jìn)一步地，含有前述功能標(biāo)記的試劑或試劑盒也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明首次公開了一種與大豆植酸磷利用效率相關(guān)的功能標(biāo)記，經(jīng)過對30個(gè)大豆品種(磷高效品種17個(gè)，磷低效品種13個(gè))進(jìn)行擴(kuò)增后分析擴(kuò)增條帶與表型性狀相關(guān)性，驗(yàn)證了所述功能標(biāo)記的可靠性。附圖說明圖1為植酸磷處理下gmpap14基因在“中黃15”(磷高效大豆品種)與“牛毛黃”(磷低效大豆品種)根系中的差異表達(dá)結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)表示植酸磷處理天數(shù)，縱坐標(biāo)表示gmpap14在“中黃15”與“牛毛黃”根系表達(dá)量；圖中：nmh為牛毛黃；zh15為中黃15。圖2為gmpap14z和gmpap14n克隆電泳結(jié)果，圖中：m為dnamarkerdl10000；1為gmpap14z擴(kuò)增結(jié)果，2為gmpap14n擴(kuò)增結(jié)果。圖3為gmpap14z和gmpap14n序列比對結(jié)果。圖4為構(gòu)建gmpap14基因植物表達(dá)載體電泳結(jié)果；圖a中：m1：dl10000；1：質(zhì)粒對照；2：pbi121-gmpap14酶切結(jié)果；圖b中：m2：dl10000；1：質(zhì)粒對照；2-3：pbi121-gmpap14z與pbi121-gmpap14n酶切結(jié)果。圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥pcr檢測結(jié)果圖。圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同磷處理下的表型和gmpap14相對定量分析；圖a為適磷和植酸磷條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型表型觀察；圖b，c為轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型葉片長度測定觀察；圖d為不同磷條件下，gmpap14在轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達(dá)分析；+pi表示適磷處理；+po表示植酸磷處理。圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥酸性磷酸酶和植酸酶活性測定結(jié)果；圖a為轉(zhuǎn)基因擬南芥酸性磷酸酶活性測定；圖b為轉(zhuǎn)基因擬南芥植酸酶活性測定。圖8為轉(zhuǎn)基因擬南芥干重和磷含量測定結(jié)果；圖a為不同磷條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型生物重測定；圖b為不同磷條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型磷含量測定。圖9為gmpap14功能標(biāo)記開發(fā)與大豆品種標(biāo)記分型結(jié)果。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例(一)gmpap14基因分子克隆1.基因克隆所用材料處理：選取飽滿、整齊一致的大豆品種“中黃15”和“牛毛黃”種子進(jìn)行催芽，催芽后選擇出芽一致的材料播種于石英砂，3d后移栽至蛭石。待生長21d后取樣，所取樣品迅速在液氮中冷凍，-80℃超低溫冰箱保存待用。2.實(shí)時(shí)定量pcr分析所用材料處理：選取飽滿、整齊一致的磷高效大豆“中黃15”和磷低效大豆“牛毛黃”種子播種于蛭石，7d后選取植株根系樣品進(jìn)行分析，并記為0d；隨后進(jìn)行2個(gè)不同磷素處理(適磷條件為1.0mmol/l的kh2po4，植酸磷條件為1.0mmol/l植酸磷)，并在磷處理后的7d、14d、21d、28d、35d、42d、48d、56d、63d及70d分別取樣，所取樣品進(jìn)行液氮冷凍，-80℃超低溫冰箱保存待用。3.大豆dna提取：大豆植株dna提取采用ctab法進(jìn)行。4.大豆總rna提取：大豆植株總rna(適磷、植酸磷處理)提取參照trnzoltotalrnareagent操作指南進(jìn)行。5.cdna反轉(zhuǎn)錄合成：大豆植株總rna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cdna，合成過程參照primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit操作指南進(jìn)行。6.pcr擴(kuò)增所用引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)大豆紫色酸性磷酸酶基因gmpap14(genbankno.jn967626)cdna序列設(shè)計(jì)特異性引物gmpap14-f1、gmpap14-r1，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。其中g(shù)mpap14-f1、gmpap14-r1引物序列如下：gmpap14-f1：5’-atgggtgttgtggagggtctct-3’gmpap14-r1：5’-ttaatgtgaaacatgagccgtgg-3’7.gmpap14z和gmpap14n分子克?。豪迷O(shè)計(jì)好的引物gmpap14-f1、gmpap14-r1，以“中黃15”和“牛毛黃”dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，克隆gmpap14z和gmpap14n基因開放閱讀框序列。pcr反應(yīng)體系及程序如下：pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，并連接于pmd18-t載體，反應(yīng)體系如下：pcrproduct4μlpmd18-tvector(50ng)1μl10×ligationbuffer1μlt4dnaligase1μlddh2o3μl將上述混合液混勻后，16℃連接12h。8.利用上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株top10，挑取陽性克隆，進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)酶切和測序分析，獲得gmpap14z序列，長度3040bp，gmpap14n序列，長度3076bp。序列如下：大豆紫色酸性磷酸酶gmpap14基因在大豆品種“中黃15”中基因組dna序列(gmpap14z)，長度為3040bp，序列如seqidno.1所示。大豆紫色酸性磷酸酶gmpap14基因在大豆品種“牛毛黃”中基因組dna序列(gmpap14n)，長度為3076bp，序列如seqidno.2所示。根據(jù)已有的gmpap14cdna序列設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增“中黃15”與“牛毛黃”大豆品種中的gmpap14gdna序列，經(jīng)凝膠電泳檢測結(jié)果顯示(如圖2所示)，gmpap14dna序列(gmpap14gdna)大小約為3000bp，經(jīng)回收目的片段、連接t載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞top10，篩選陽性單克隆，dna測序分析最終獲得了2個(gè)大豆品種gmpap14dna序列。(二)gmpap14基因在不同大豆品種中的表達(dá)分析以gmpap14為目標(biāo)基因，大豆組成型表達(dá)actin11基因?yàn)閮?nèi)參對照，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量pcr引物gmpap14-f2和gmpap14-r2，采用greenⅰ熒光染料法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量pcr，通過比較ct進(jìn)行g(shù)mpap14基因表達(dá)水平的相對定量分析。gmpap14-f2：5’-tcaagcagccccttcattag-3’gmpap14-r2：5’-agttttccttcggcaatcttc-3’gmpap14基因在不同大豆品種根系中的相對表達(dá)量＝2–△△ct，其中δδct＝(ctgmpap14–ctactin11)植酸磷處理–(ctgmpap14–ctactin11)對照處理。由圖1可見，在植酸磷處理14d～70d，中黃15gmpap14表達(dá)量始終顯著高于牛毛黃(除植酸磷處理21d二者無顯著差異外)，說明gmpap14與中黃15大豆品種磷素高效利用密切相關(guān)。(三)gmpap14真核表達(dá)載體構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)帶xbaⅰ/sacⅰ酶切位點(diǎn)引物，擴(kuò)增gmpap14c序列。引物如下：gmpap14-f3：5’-tctagaatgggtgttgtggagggtctct-3’；gmpap14-r3：5’-gagctcttaatgtgaaacatgagccgtgg-3’。設(shè)計(jì)帶xbaⅰ/sacⅰ酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增gmpap14z序列，引物如下：gmpap14-f4：5’-tctagaatgggtgttgtggagggtctct-3’；gmpap14-r4：5’-gagctcttaatgtgaaacatgagccgtgg-3’。設(shè)計(jì)帶bamhⅰ/sacⅰ酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增gmpap14n序列，引物如下：gmpap14-f5：5’-ggatccatgggtgttgtggagggtc-3’；gmpap14-r5：5’-gagctcttaatgtgaaacatgagccgtgg-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物與pbi121載體連接構(gòu)建植物表達(dá)載體，并通過pcr、酶切、測序最終確定連接正確的單克隆，用于后續(xù)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。gmpap14c擴(kuò)增體系和程序如下：pcr擴(kuò)增體系：cdna1.0μlgmpap14-f31.0μlgmpap14-r31.0μl2.5mmdntps2.0μl10×buffer2.0μllataqdnapolymerase0.2μlddh2o12.8μlpcr擴(kuò)增程序：95℃10min98℃10s72℃1.5mingotostep230cycles72℃10min(2)采用qxbai和qsaci酶切pmd-gmpap14c和pbi121載體，反應(yīng)體系如下：qxbai1μlqsaci1μl10×qbuffer2μlplasmid5μlh2o11μl(3)酶切完成后，經(jīng)電泳檢測，將片段大小正確的目的條帶，分別進(jìn)行膠回收；利用紫外分光光度計(jì)測定其濃度，使回收的載體片段與目的片段摩爾比在1:3～1:10。將目的片段與載體片段進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：混勻后，16℃連接12～16h。(4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，菌液pcr和酶切鑒定陽性克隆，并進(jìn)行測序分析，測序正確的重組子即為構(gòu)建成功的pbi121-gmpap14c載體。(5)gmpap14z和gmpap14n擴(kuò)增體系、擴(kuò)增程序、酶切體系、連接體系參照gmpap14c方法。利用已有中間載體pmd19-gmpap14與植物超表達(dá)載體pbi121，構(gòu)建gmpap14植物超表達(dá)載體。經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆、dna測序分析，獲得了紫色酸性磷酸酶gmpap14的植物超表達(dá)載體pbi121-gmpap14(gmpap14c)。根據(jù)gmpap14z和gmpap14n序列，設(shè)計(jì)帶有各自酶切位點(diǎn)的引物，通過pcr擴(kuò)增、測序并與pbi121載體連接，成功構(gòu)建了35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pbi121-gmpap14z和pbi121-gmpap14n植物超表達(dá)載體。(四)gmpap14基因生物學(xué)功能分析1.擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化：采用浸花法(floraldip)將攜帶有pbi121-gmpap14c、pbi121-gmpap14z、pbi121-gmpap14n的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入擬南芥columbia生態(tài)型。2.轉(zhuǎn)基因陽性植株dna分子鑒定：根據(jù)表達(dá)載體序列和gmpap14序列設(shè)計(jì)跨載體引物，pcr鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。陽性植株自交，植株成熟后，分單株收獲種子，干燥后的種子在-20℃保存待用。引物如下：gmpap14-f6：5’-aggtggctcctacaaatgcc-3’；gmpap14-r6：5’-agacatcgctgtcaagtggc-3’。將上述鑒定正確的含有pbi121-gmpap14c、pbi121-gmpap14z、pbi121-gmpap14n的農(nóng)桿菌陽性克隆分別轉(zhuǎn)化擬南芥植株，并收獲轉(zhuǎn)化后的種子。通過卡那霉素篩選獲得抗性植株，根據(jù)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行抗性植株pcr鑒定(如圖5所示)，結(jié)果表明，能夠擴(kuò)增出大小為400bp目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，證明3個(gè)表達(dá)載體均已成功轉(zhuǎn)入擬南芥。通過連續(xù)自交最終獲得了轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14nt3擬南芥株系。3.轉(zhuǎn)基因陽性植株實(shí)時(shí)定量pcr分析：將轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n和野生型擬南芥種子分別播種于蛭石，進(jìn)行適磷(kh2po4)和植酸磷(phytate-p)處理，28d后取樣，進(jìn)行g(shù)mpap14定量表達(dá)分析，以期驗(yàn)證差異序列與gmpap14轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性。定量表達(dá)分析所用引物序列如下：基因引物：gmpap14-f7：5’-atgacagaaccacagccagag-3’；gmpap14-r7：5’-actgggtgccagtatctgttg-3’。內(nèi)參引物：eef1a-f：5’-tacctcccaggctgattgtg-3’；eef1a-r：5’-gggttgtagccgaccttctt-3’。磷素處理28d后觀察植株結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在適磷處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n擬南芥植株長勢與野生型對照基本一致；而在植酸磷處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n擬南芥植株長勢顯著優(yōu)于野生型對照(見圖6a)。分析轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片長度發(fā)現(xiàn)，植酸磷處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n擬南芥與野生型對照葉片長度存在顯著差異，且按照gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n的順序依次降低(見圖6c)。通過分析轉(zhuǎn)不同表達(dá)載體(pbi121-gmpap14c、pbi121-gmpap14z、pbi121-gmpap14n)擬南芥的gmpap14表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適磷處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z擬南芥植株的gmpap14表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)gmpap14n植株，且以轉(zhuǎn)gmpap14c植株表達(dá)量最高；植酸磷處理?xiàng)l件下，與適磷處理相比，轉(zhuǎn)gmpap14c擬南芥的gmpap14表達(dá)量提高了2.8倍，轉(zhuǎn)gmpap14z擬南芥的gmpap14表達(dá)量提高了1.8倍，而轉(zhuǎn)gmpap14n擬南芥的gmpap14表達(dá)量沒有明顯改變。由此可見，gmpap14gdna序列第5內(nèi)含子36bp的等位變異在一定程度上影響了gmpap14cdna轉(zhuǎn)錄水平，即“中黃15”的gmpap14序列中36bp缺失更利于基因的轉(zhuǎn)錄，增加了基因表達(dá)量。4.轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株生化指標(biāo)測定將轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n和野生型擬南芥種子分別播種于蛭石，進(jìn)行適磷(kh2po4)和植酸磷(phytate-p)處理，觀察不同磷條件下擬南芥生長狀態(tài)，28d后取樣，進(jìn)行植株酶活、干重、全磷含量分析。(1)根系酸性磷酸酶活性測定轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對照生長28d，移至2.0ml離心管(含1mmol/lρ-npp，ρ-npp為測定酸性磷酸酶活性的標(biāo)準(zhǔn)底物)，24℃生長1d，取500μl0.5mmol/lnaoh終止反應(yīng)，在410nm波長下測定其吸光值；酸性磷酸酶活性為每個(gè)植株每小時(shí)催化ρ-npp釋放ρ-np的數(shù)量(ρ-np為ρ-npp被分解后的產(chǎn)物)。(2)根系植酸酶活性測定：轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型對照生長20d后，移至2.0ml離心管(含1mmol/l植酸鈉，植酸鈉為測定植酸酶活性的標(biāo)準(zhǔn)底物)，24℃生長2d，測定其植酸酶活性；植酸酶活性為每個(gè)植株每小時(shí)催化植酸鈉釋放無機(jī)磷的數(shù)量(無機(jī)磷為植酸鈉被分解后的產(chǎn)物)。通過分析轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n擬南芥植株與野生型的酸性磷酸酶活性，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z擬南芥酸性磷酸酶活性顯著高于轉(zhuǎn)gmpap14n擬南芥與野生型對照，而轉(zhuǎn)gmpap14n擬南芥酸性磷酸酶活性顯著高于野生型對照，轉(zhuǎn)gmpap14c與gmpap14z擬南芥間的酸性磷酸酶活性差異不顯著(圖7a)。轉(zhuǎn)基因植株植酸酶活性分析結(jié)果顯示，植酸酶活性從高到低依次為gmpap14z、gmpap14c、gmpap14n、野生型，且兩兩之間差異均達(dá)到顯著水平(圖7b)。(3)轉(zhuǎn)基因陽性植株表型觀察及生物重與磷含量測定分別觀察上述轉(zhuǎn)基因材料和野生型對照植株在植酸磷處理下的生長情況，并收獲擬南芥植株，80℃烘干，進(jìn)行生物重測定，通過鉬藍(lán)分光光度法進(jìn)行磷含量測定。分析不同磷素處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)gmpap14c、gmpap14z、gmpap14n擬南芥與野生型對照的地上部干重、磷素含量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)gmpap14c、轉(zhuǎn)gmpap14z和轉(zhuǎn)gmpap14n擬南芥地上部干重均顯著高于野生型對照，轉(zhuǎn)gmpap14c最高，轉(zhuǎn)gmpap14z與轉(zhuǎn)gmpap14n差異不顯著。轉(zhuǎn)基因植株磷含量分析結(jié)果顯示，適磷處理?xiàng)l件下，各轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照間差異不顯著；而植酸磷處理?xiàng)l件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系磷素含量均顯著高于野生型對照，依次為轉(zhuǎn)gmpap14c>轉(zhuǎn)gmpap14z>轉(zhuǎn)gmpap14n>野生型，說明轉(zhuǎn)gmpap14擬南芥增強(qiáng)植株對其根際周圍植酸磷分解利用，且36bp序列差異影響基因功能(圖8)。(五)功能標(biāo)記開發(fā)及其實(shí)用性初步驗(yàn)證(1)通過基因組網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/)進(jìn)行g(shù)mpap14基因染色體定位，根據(jù)定位結(jié)果，利用dnaman軟件進(jìn)行等位基因差異位點(diǎn)分析。利用大豆基因組網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/)，對獲得的gmpap14z和gmpap14n序列進(jìn)行blast分析(如圖3所示)，結(jié)果顯示，其定位于大豆基因組chr12，且在2個(gè)品種間存在序列差異，其中“中黃15”的gmpap14z大小為3040bp，“牛毛黃”的gmpap14n大小為3076bp；經(jīng)比較gmpap14z與gmpap14n發(fā)現(xiàn)，二者在基因的第5內(nèi)含子存在一個(gè)突變位點(diǎn)，與gmpap14z相比，gmpap14n在第5內(nèi)含子處存在一個(gè)36bp插入序列。(2)根據(jù)gmpap14z和gmpap14n在第5內(nèi)含子存在的36bp序列差異，開發(fā)了一對特異擴(kuò)增chr12并能區(qū)分上述等位變異的共顯性功能標(biāo)記gmpap14-intron5-36，標(biāo)記引物如下：gmpap14-intron5-36f：5’-atgatttcagacaaacacgattc-3’；gmpap14-intron5-36r：5’-acagctgacgaatgcaatttaac-3’。該標(biāo)記在磷高效大豆品種中擴(kuò)增出一條241bp特異片段，而在磷低效大豆品種中擴(kuò)增一條277bp特異片段。(3)利用該標(biāo)記擴(kuò)增課題組已鑒定的30個(gè)不同磷效率大豆品種，結(jié)果表明，17個(gè)磷高效品種中有14份能夠擴(kuò)增出241bp片段，符合率為82.4％；13個(gè)磷低效品種中有6份能夠擴(kuò)增出277bp片段，符合率為46.2％。進(jìn)一步利用該標(biāo)記鑒定155份大豆品種，結(jié)果顯示能夠?qū)⒐┰嚻贩N劃分為2種類型，一種為gmpap14z基因型，共計(jì)118份，另一種為gmpap14n基因型，共計(jì)37份。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>河北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種與大豆植酸磷利用效率相關(guān)的功能標(biāo)記及其應(yīng)用<130>khp161118781.4q<160>20<170>patentinversion3.5<210>1<211>3040<212>dna<213>gmpap14z<400>1atgggtgttgtggagggtctcttagcattggctttggttctgagtgtttgcgtggtgtgc60aatggaggctcaagcagccccttcattaggaaagttgagaagacagtggatatgccactt120gacagcaatgtctttgctgttcctcctggttataatgctccccagcaggtatctacctac180ccttctcttcttcttctttactatcttcatttttaattctggttttctgttagagtagag240agggaagtggttaatgatgctttgctgcccagtgaatcaagttctgtacttgccattaac300caatgagtgaaatttagatgcagttttatgcttgtgtgccattctccaattcaaattaga360gtttcactttgataatttgaggtgatgtttgatagaaatctttattatcatcatattatc420caagtgaaatttcagttctgataccagcatagcaccaaaaacaccaatagagctacatct480atgctttgtgcttaaccaattctctttctaaattcaacatttttacatttttgcaccctt540tgggattttttctttctttgatttgaatcaatggctcctatgcattaaggttcatataac600gcaaggtgaccttgtggggaaagcagtgatcgtgtcatgggtgacagtggatgaaccggg660gtcgagcgaagtgcattactggagtgagaacagtgacaagaagaagattgccgaaggaaa720acttgttacttataggttcttcaattacacatctggttttattcatcacaccaccatcag780aaatttggaggtaattctcttttccattactttggctttatgctgtttattgtccagata840gatgccaggctagaatcttgtgaaagaaaagaaaaagggcattttgctttgtgaatcaat900tgttgatacgtgtgcttcttttggggcagtacaacaccaaatactactatgaggttggac960ttgggaacacaacacggcagttttggtttgtgactcctcctgaaatcggtcccgatgtgc1020catatacatttggtctcataggtaagtgtactattctatcaaagtaattcggagtcactg1080agggggtctagctcaactgtctttatcaccttgaattgttgagcattcatcattaatttg1140ggaaggaaaaatgctatatgtttgtgtaccaataggccattatgtttcctgtaaactggt1200ttgtctttatttgcaggggatcttggtcagagttttgattcaaataaaactctttctcac1260tatgaattgaacccaagaaaaggacaaactgtactattcgttggagacctctcttatgcg1320gataactacccaaatcatgataacattaggtgggattcttggggaaggtttacagaaagg1380agtgttgcttatcaaccatggatatggactgcaggaaaccatgaaattgattttgctcca1440gaaattgtaagcttctcataagaattgactttattttgttttaactatctgagaaactct1500tcattcttttattttttcaaccataaattctaaccctcgtgtaatgcattttcctagtcc1560aaattagtaagaagtaagtttttaacatggatcactgctttgttgtagggtgaaactgta1620cctttcaagccttatacccaccgttaccatgtttcttataaagcatctcaaagtacttca1680cccttctggtattctatcaagagagcttcagcacacatcattgttttggcctcatattca1740gcgtatggtaatgctagatgtcttttgcatgatacatatttatgtagagagcactggctg1800attctatgatttcagacaaacacgattctgtttgtaataatttcaccttagtgattacct1860atatgacttggaaaagatcaaattttactgaataatttcagttcttagatctatatatat1920ctatctgtatgtatgtatgtttccattaaatgtggaatgttaaatatcacagacaaacac1980ttgccttaaatgatctgtgcgtgtgtctg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