本發(fā)明屬于核酸的提取與純化領(lǐng)域，具體涉及一種高效抽提血清和血漿中游離dna的方法。
背景技術(shù)：
：游離dna(cellfreedna，cf-dna)是無細(xì)胞狀態(tài)的胞外dna，主要由單鏈dna、雙鏈dna和單雙鏈dna混合物組成，以dna-蛋白質(zhì)和游離dna兩種形式存在于血液中，主要來源于正常體內(nèi)細(xì)胞的凋亡和死亡。對孕婦而言，血液中約有10％-15％的cfdna來至胎盤的滋養(yǎng)層，具有和胎兒一致的遺傳背景，因此對cf-dna的檢測可以實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。無論哪種起源產(chǎn)生的cf-dna都會很快在外周血中被清除，同時(shí)又有細(xì)胞裂解產(chǎn)生新的cf-dna，所以人體血液中cf-dna的量一直保持在一個(gè)相對穩(wěn)定的較低水平。一般情況下血液中的cf-dna的量保持在10-200ng/ml，而且cf-dna片段較小一般集中在100-240bp之間，大多數(shù)為160-200bp，日常dna提取方式對此類型dna提取效率不高。目前cf-dna提取方法有酚-氯仿-異戊醇法、柱提法和磁珠法。酚氯仿異戊醇法是把血液中全部的dna提取出來，不能將其依據(jù)片段大小進(jìn)行分離，且純度較低，試劑大多有毒害；柱提法雖然效率提高，但也不能就片段大小進(jìn)行分離；磁珠法運(yùn)用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠，該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合，既可以高效分離也能完成對片段的初步篩選。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在離液鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中將dna和rna分離出來，可應(yīng)用在臨床疾病診斷、血液篩查、法醫(yī)學(xué)鑒定、環(huán)境微生物檢測、食品安全檢測、分子生物學(xué)研究等多種領(lǐng)域。磁珠法提取核酸一般可以分為四步：裂解—結(jié)合—洗滌—洗脫。雖然有傳統(tǒng)核酸提取方法無法比擬的優(yōu)勢，但操作步驟較多，需要洗滌多次，還需要加熱和晾干，需要花費(fèi)較多時(shí)間，對設(shè)備和實(shí)現(xiàn)自動化要求較高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種高效抽提血清和血漿中游離dna的方法，能快速獲取高質(zhì)量的獲取血清和血漿中的游離dna，避免了現(xiàn)有的磁珠法和離心柱法進(jìn)行游離dna分離的繁瑣步驟。為達(dá)上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)解決手段是提供一種高效抽提血清和血漿中游離dna的方法，包括以下步驟：1.將血清或血漿加入到離心管中作為樣本；2.向步驟1的離心管中加入裂解液、核酸助沉劑和磁珠，漩渦混勻，室溫放置5-30min；3.將步驟2的離心管放在磁力架上，待磁珠完全聚集后，完全吸出上清液；4.加入洗滌液至步驟3的離心管中，漩渦混勻，離心管放置在磁力架上，待磁珠完全聚集后，完全吸出上清液；5.向步驟4的離心管內(nèi)加入洗脫液，漩渦混勻，室溫放置2-20min；6.將步驟5的離心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液至另一新的離心管內(nèi)，即得到純化的游離dna；所述裂解液的成分為1-6mol/l離液鹽、20-200mmol/l檸檬酸鈉、5-20mmol/ledta、10-200mmol/ltris-hcl、0.2-2.0％n-月桂?；“彼徕c、0-20％非離子表面活性劑、20-50％異戊醇，更進(jìn)一步地，所述離液鹽為鹽酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉、高氯酸鉀等離液序列高的鹽，所述非離子表面活性劑為tween-20、tritonx-100、np-40、span-80等，所述tris-hcl的ph為4.0-8.0。優(yōu)選地，所述離液鹽濃度為2-4mol/l；所述檸檬酸鈉濃度為50-100mmol/l；所述edta的濃度為5-10mmol/l；所述tris-hcl的濃度為20-50mmol/l，ph為5.0-7.0；所述n-月桂酰基肌氨酸鈉的濃度為0.5-1.0％；所述非離子表面活性劑的濃度為5-10％；所述異戊醇的濃度為30-40％。所述步驟2中的核酸助沉劑為polya、carrierrna、acylcarrier中的任意一種，所述polya的用量為20-50μg，carrierrna的用量為5-50μg，acylcarrier的用量為5-20μg。所述步驟2中的磁珠是粒徑為0.1-1μm的硅羥基磁珠。所述步驟2中的樣本、裂解液、核酸助沉劑和磁珠的體積比為100:200:5:2，所述樣本的體積為50-500μl。所述步驟4中的洗滌液的體積與所述步驟1中樣本的體積比為5:1，洗滌液的成分為5-20％peg-4000、5-20mmol/ledta、10-20mmol/l檸檬酸鈉、10-50mmol/ltris-hcl、0-2.0％非離子表面活性劑和5-20％甘油，更進(jìn)一步地，所述非離子表面活性劑為tween-20、tritonx-100、np-40和span-80等，所述tris-hcl的ph值為3.0-5.5。優(yōu)選地，所述peg-4000濃度為9-12％；所述edta濃度為6-8mmol/l；所述檸檬酸鈉的濃度為10-12mmol/l；所述tris-hcl的濃度為15-20mmol/l，ph為4.5-5.0；所述非離子表面活性劑濃度為0.2-0.5％；所述甘油的濃度為10-15％。所述步驟5中的洗脫液的成分為10mmtris-hcl，ph值為8.0，優(yōu)選地，步驟5中室溫放置的時(shí)間為8-15min，洗脫液的體積為20-100μl。本發(fā)明的有益效果是：1、進(jìn)一步簡化了磁珠法的提取流程，僅需裂解結(jié)合—洗滌—洗脫三個(gè)步驟，洗滌僅有1次，相較通常的蛋白酶k法減少了加熱等繁瑣的操作，大大提高了提取效率，2、在不同試劑的配合下，裂解結(jié)合一步完成，一步洗滌得以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)游離dna的提取效率和產(chǎn)物純度也能得到最大程度的保障，3、全程無需加熱、離心等操作，極大地節(jié)省時(shí)間，對設(shè)備要求較低，4、有利于推進(jìn)游離dna提取自動化的實(shí)現(xiàn)。附圖說明圖1為實(shí)施例2的樣本和裂解液不同配比的提取效果的對比，1為一號模板的擴(kuò)增曲線，2為二號模板的擴(kuò)增曲線，3為三號模板的擴(kuò)增曲線。圖2為實(shí)施例3的本發(fā)明方法和蛋白酶k法兩種提取方案對于β-actin136bp基因的熒光定量檢測的對比，4為本發(fā)明方法的擴(kuò)增曲線，5為蛋白酶k法的擴(kuò)增曲線。圖3為實(shí)施例3本發(fā)明方法和蛋白酶k法兩種提取方案對于β-actin420bp基因的熒光定量檢測的對比，6為本發(fā)明方法的擴(kuò)增曲線，7為蛋白酶k法的擴(kuò)增曲線。圖4為實(shí)施例3本發(fā)明方法和蛋白酶k法兩種提取方案對于β-globin基因的熒光定量檢測的對比，8為本發(fā)明方法的擴(kuò)增曲線，9為蛋白酶k法的擴(kuò)增曲線。圖5為本發(fā)明方法和蛋白酶k法兩種提取方案的電泳效果對比，ck為蛋白酶k法的電泳條帶，iv為本發(fā)明方法的電泳條帶。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例提供的方案為優(yōu)選方案，但不作為對本申請的限定。實(shí)施例1試劑準(zhǔn)備與配制1.裂解液將354.5g硫氰酸胍、29.4g檸檬酸鈉(二水)、25毫升ph值5.8的1mtris-hcl、10毫升500mmedta和400毫升去離子水混合攪拌溶解后，再加入9gn-月桂酰肌氨酸鈉和100毫升np-40置于37℃輕柔攪拌溶解，再加入333毫升異丙醇，混勻后定容至1000毫升。2.洗滌液將100gpeg-4000、2.94g檸檬酸鈉(二水)、15毫升ph值5.5的1mtris-hcl、15毫升500mmedta、150毫升甘油和550毫升去離子水混合置于37℃攪拌溶解后，再加入5毫升np-40輕柔攪拌溶解混勻后，定容至1000毫升。3.洗脫液將10毫升ph值8.0的1mtris-hcl混勻后，定容至1000毫升。4.核酸助沉劑5mg/mlpolya5.磁珠50mg/ml硅羥基磁珠懸液6.參比試劑盒游離dna提取試劑盒(海貍生物，ref：70404，詳細(xì)信息參考網(wǎng)站：http://www.beaverbio.com/product/list/490.html#490)實(shí)施例2樣本和裂解液不同配比的提取效果測試1.提取游離dna取血清或血漿作為樣本，將190bp的核酸片段摻入樣本中，使終濃度為50ng/ml，制備三個(gè)相同且均為200μl的一號樣本、二號樣本和三號樣本，一號樣本、二號樣本和三號樣本分別采用樣本：裂解液(實(shí)施例1所述)＝1:1、1:2和1:3三種體積配比進(jìn)行提取，其他條件均相同，三個(gè)樣本均加入實(shí)施例1所述核酸助沉劑5μl、磁珠2μl，渦旋混勻20s后室溫放置10min；磁力架分離磁珠，吸除上清；加入實(shí)施例1所述洗滌液1ml，渦旋混勻20s后，磁力架分離磁珠，吸除上清；加入實(shí)施例1所述洗脫液50μl，渦旋混勻20s后室溫放置5min(中途渦旋3次，每次10s)，磁力架分離磁珠，移出清液至一新的離心管。2.擴(kuò)增檢測將一號樣本、二號樣本和三號樣本提取的核酸分別作為一號模板、二號模板和三號模板且在同樣的條件下進(jìn)行擴(kuò)增檢測，針對摻入的核酸片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增反應(yīng)混合液體系如表1，并進(jìn)行相同的擴(kuò)增反應(yīng)程序如表2，然后對熒光定量pcr擴(kuò)增結(jié)果得到的ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)如表3，擴(kuò)增曲線如圖1所示。表1擴(kuò)增反應(yīng)混合液體系名稱用量模板22.3μl上游引物10μm1μl下游引物10μm1μl探針10μm0.2μlrox10μm0.5μlqpcrbuffermix(2x)25μl表2擴(kuò)增反應(yīng)程序表3熒光定量pcr擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)模板熒光定量pcrct值一號模板16.41二號模板15.89三號模板17.423.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析ct值是每個(gè)模板的反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即ct值越小相當(dāng)于起始模板量越高，因此，本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二號模板中的模板量最高，可得按照樣本：裂解液＝1:2的方案進(jìn)行提取效果最佳。實(shí)施例3本發(fā)明方法與蛋白酶k法提取效果對比1.提取游離dna1)取新鮮人血清或血漿作為樣本，制備兩個(gè)相同且樣本量均為200μl的四號樣本和五號樣本；2)利用本發(fā)明的方法對四號樣本提取在四號樣本中，加入實(shí)施例1所述裂解液400μl、核酸助沉劑5μl、磁珠2μl，渦旋混勻20s后室溫放置10min；磁力架分離磁珠，吸除上清；加入實(shí)施例1所述洗滌液1ml，渦旋混勻20s后，磁力架分離磁珠，吸除上清；加入實(shí)施例1所述洗脫液50μl，渦旋混勻20s后室溫放置5min(中途渦旋3次，每次10s)，磁力架分離磁珠，移出清液至一新的離心管備用。3)蛋白酶k法利用實(shí)施例1中的參比試劑盒對五號樣本提取在五號樣本中，加入proteinasek20μl，lysisbuffer160μl，渦旋混勻后置于55℃裂解10min；加入bindingbuffer360μl，渦旋震蕩30s后，加入?yún)⒈仍噭┖械拇胖?0μl，渦旋混勻后室溫靜置10min；然后磁力架分離磁珠，吸除上清；加入washingbuffer600μl，渦旋震蕩1min，磁力架分離磁珠，吸除上清；加入75％乙醇600μl，渦旋震蕩1min，磁力架分離磁珠，吸除上清；再次加入75％乙醇600μl，渦旋震蕩1min，磁力架分離磁珠，充分吸除上清；保持離心管在磁力架上，室溫靜置10min；加入elutionbuffer50μl，渦旋震蕩1min，置于55℃加熱洗脫5min，磁力架分離磁珠，移出清液至一新的離心管備用。2.兩種提取方法的操作步驟和條件對比如下表4所示表4本發(fā)明方法與蛋白酶k方法的比較3.擴(kuò)增檢測用上述兩種方法提取的游離dna為模板，結(jié)合不同內(nèi)參基因(β-actin136bp；β-actin420bp；β-globin)的引物探針進(jìn)行熒光定量檢測(引物和探針參照文獻(xiàn))，以takara的qpcr反應(yīng)buffermix進(jìn)行檢測，擴(kuò)增反應(yīng)混合液體系參照表1所示，擴(kuò)增條件參照表2所示(其中循環(huán)數(shù)調(diào)整為45)，然后對得到的ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)如表5，擴(kuò)增曲線如圖2-圖4所示。表5兩種方法的熒光定量pcr擴(kuò)增結(jié)果對比統(tǒng)計(jì)內(nèi)參基因本發(fā)明方法提取的游離dna蛋白酶k法提取的游離dnaβ-actin13626.4327.90β-actin42028.8431.11β-globin30.8631.904.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析從提取流程和提取效果兩方面看來，本發(fā)明提供的方法相比經(jīng)典蛋白酶k方法均具有明顯的優(yōu)勢。實(shí)施例4本發(fā)明方法與蛋白酶k法的電泳效果對比1.提取取新鮮人血漿或血清作為樣本，制備兩個(gè)相同且樣本量均為500μl的樣本，一個(gè)樣本采用本發(fā)明的方法進(jìn)行提取，另一個(gè)樣本采用蛋白酶k法進(jìn)行提取，參照實(shí)施例3方法進(jìn)行，本實(shí)施例樣本量為500ul是實(shí)施例3中樣本量的2.5倍，所以本實(shí)施例所用的相關(guān)試劑是實(shí)施例3的2.5倍，最后洗脫液體積均為50μl。2.檢測兩種方法提取的核酸中各取25μl作為模板，分別加入5μl6xloadingbuffer，然后分別在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，電泳效果參考圖5所示。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析兩種方法抽提得到的dna條帶集中在170bp和340bp，與游離dna的分布完全一致，表明對游離dna抽提的有效性，同時(shí)可以看出，本發(fā)明的抽提方法條帶亮度更好，不同分子量dna片段提取效率更高。當(dāng)前第1頁12