本發(fā)明屬于可降解生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著基因治療研究的不斷深入，開(kāi)發(fā)具有目的基因靶向、可控并有效表達(dá)的載體是基因治療成功的關(guān)鍵。雖然目前采用的基因治療中，約有80％的載體是病毒性載體，但是由于其免疫原性高且存在潛在的致癌性，所以它的使用存在很多安全問(wèn)題，但是非病毒載體能夠很好地解決這些問(wèn)題，并且包裝尺寸小、成本低，所以非病毒載體越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

目前，對(duì)于合成型生物可降解高分子材料的使用中，聚酯類生物材料以可控的力學(xué)及降解性能和優(yōu)異的生物相容性的特點(diǎn)，成為最具發(fā)展?jié)摿Φ囊活惿锊牧?。聚酯類生物材料可分為線性聚酯生物材料和網(wǎng)絡(luò)型聚酯生物材料，前者有：聚ε-己內(nèi)酯(PCL)、聚丙交酯(PLA)等，后者有：聚癸二酸-甘油酯(PGS)、聚檸檬酸-1,8-辛二醇酯(POC)等。POC由檸檬酸和1,8-辛二醇通過(guò)縮合反應(yīng)形成的，具有合成單體無(wú)毒、生物相容性良好、反應(yīng)條件容易達(dá)到并且反應(yīng)過(guò)程中不引入雜質(zhì)、后期成型容易、供應(yīng)豐富、價(jià)格便宜，并且POC的單體檸檬酸還是人體三羧酸代謝產(chǎn)物，而且其上三個(gè)羧酸基團(tuán)可以進(jìn)行多次修飾，但是POC表面沒(méi)有正電荷，而且水溶性很差，使其作為基因載體在機(jī)體內(nèi)的應(yīng)用受到了很大的局限，如果能夠通過(guò)進(jìn)一步修飾POC，使其表面電荷和水溶性得到提高，在機(jī)體中的應(yīng)用將會(huì)得到很大的提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體及其制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，制得的彈性體具有良好的生物相容性和基因轉(zhuǎn)染效率。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備方法，包括以下步驟：

1)將摩爾比為1:1的檸檬酸和二醇加入到50mL的圓底燒瓶中進(jìn)行熱聚合，待反應(yīng)單體檸檬酸和二醇在160℃油浴中全部熔解后，立即降溫至140℃，氮?dú)猸h(huán)境或真空條件下反應(yīng)5小時(shí)；反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯POCG溶于15mL，50mM，pH為4～6的MES緩沖液中，攪拌使其完全溶解；再加入1.5mmol的EDC，室溫?cái)嚢?0min；隨后加入1.5mmol的NHS，室溫?cái)嚢?2h；再加入陽(yáng)離子聚合物，室溫?cái)嚢?2h；產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到POCG-PEI聚合物；

3)將POCG-PEI聚合物和基因按照(2～10):1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH為7.4的HEPES緩沖液中，在37℃水浴中溫育30分鐘形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于：

步驟1)中的熱聚合在氮?dú)鈿夥?、惰性氣體或真空環(huán)境下進(jìn)行。

步驟1)中的二醇為1,8-辛二醇和聚乙二醇，檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇的摩爾比為1:(1～0.4):(0～0.6)。

步驟2)中的陽(yáng)離子聚合物為聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚β-氨酯或聚酰胺-胺型樹(shù)狀物；其中，聚乙烯亞胺的分子量為：600Da、1.8K Da或10K Da。

步驟3)中的基因?yàn)镈NA、siRNA或miRNA；POCG-PEI聚合物和DNA、siRNA或miRNA溶解到HEPES緩沖液中，得POCG-PEI/DNA復(fù)合物、POCG-PEI/siRNA復(fù)合物或POCG-PEI/miRNA復(fù)合物。

POCG-PEI聚合物和DNA、siRNA或miRNA均是以(2～10):1的氮磷比溶解到HEPES緩沖液中的。

本發(fā)明上述方法制備的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體，該聚合物的結(jié)構(gòu)式為：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有基因載體所存在的生物相容性差、基因轉(zhuǎn)染效率低等缺點(diǎn)，提供了一種自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備方法，該方法以人體天然代謝產(chǎn)物檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇為單體，通過(guò)熱聚合得到聚檸檬酸酯高分子預(yù)聚物(POCG)；將該預(yù)聚物與不同分子量的聚乙烯亞胺(PEI)通過(guò)催化聚合，得到PEI接枝的高分子聚合物(POCG-PEI)。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，且無(wú)有機(jī)溶劑殘留，所使用的熱聚合合成方法環(huán)保、操作方便、原料成本低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：該方法制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)具有良好的生物相容性和較高的基因轉(zhuǎn)染效率，能夠有效的攜帶基因(DNA/siRNA/miRNA)進(jìn)入細(xì)胞，并且表現(xiàn)出一定的生物學(xué)效應(yīng)。

本發(fā)明中所使用的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇具有良好的生物相容性和降解性，通過(guò)引入PEG，很好的改善了POC的溶解性，且PEG對(duì)于陽(yáng)離子聚合物(POCG-PEI)的修飾，可以屏蔽陽(yáng)離子表面的正電荷，降低其毒性和免疫原性，從而提高細(xì)胞兼容性和轉(zhuǎn)染率，還可以增加陽(yáng)離子聚合物在血漿中的穩(wěn)定性，并減少?gòu)?fù)合物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)清除，延長(zhǎng)其在血液循環(huán)中滯留的時(shí)間。

本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明所使用的聚檸檬酸-二醇或多元醇(POCG預(yù)聚物)是一種可降解脂肪族聚酯高分子，其單體生物相容性良好，且廉價(jià)易得。

(2)本發(fā)明利用聚乙二醇對(duì)聚檸檬酸-二醇或多元醇(POC預(yù)聚物)進(jìn)行改性，PEG的共價(jià)接入，改善了原本聚檸檬酸-二醇或多元醇的水溶性。

(3)本發(fā)明中聚乙烯亞胺(PEI)的接入，使得原本不具有表面正電荷的聚檸檬酸-二醇或多元醇(POC預(yù)聚物)展現(xiàn)出了一定的表面正電荷，能夠有效的通過(guò)靜電作用結(jié)合基因(DNA/siRNA/miRNA)，并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并具有較高的基因轉(zhuǎn)染效果。

(4)本發(fā)明中制備的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)在紫外激發(fā)下具有很強(qiáng)的熒光，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)材料在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)向。

(5)本發(fā)明中使用的溶劑為緩沖液，所制備的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)不存在任何的有機(jī)溶劑。

【附圖說(shuō)明】

圖1是本發(fā)明合成的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體中各單體以及聚合物的結(jié)構(gòu)式。

圖2是制得的POCG預(yù)聚物和POCG-PEI聚合物的1H-NMR圖譜。

圖3為本發(fā)明制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)的光學(xué)特性。

圖4為本發(fā)明制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)對(duì)于成肌細(xì)胞(C2C12，圖4A)和人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7，圖4B)細(xì)胞毒性的測(cè)定。

圖5為本發(fā)明制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)的活細(xì)胞熒光成像以及基因轉(zhuǎn)染結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述：

本發(fā)明致力于制備一種具有良好的生物相容性和較高基因轉(zhuǎn)染效率的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體，實(shí)現(xiàn)其能攜帶基因進(jìn)入細(xì)胞并產(chǎn)生一定生物學(xué)效應(yīng)。聚檸檬酸酯預(yù)聚物(POC)因?yàn)榫哂锌煽氐纳锝到?、良好的生物相容性以及低成本，已?jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而POC水溶性極差并且表面不含任何正電荷，導(dǎo)致其作為基因載體的應(yīng)用受到了限制；聚乙二醇(PEG)，又稱聚(環(huán)氧乙烷)或聚氧乙烯，是環(huán)氧乙烷的寡聚物或聚合物，是一種無(wú)毒性、無(wú)刺激性的聚合物，具有良好的親水性，如果用PEG修飾POC，就可以改善POC的溶解性，且PEG對(duì)于陽(yáng)離子聚合物的修飾，可以屏蔽陽(yáng)離子表面的正電荷，降低其毒性和免疫原性，從而提高細(xì)胞兼容性和轉(zhuǎn)染率，還可以增加陽(yáng)離子聚合物在血漿中的穩(wěn)定性，并減少?gòu)?fù)合物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)清除，延長(zhǎng)其在血液循環(huán)中滯留的時(shí)間；聚乙烯亞胺(PEI)含氮原子密度大，氨基種類多、數(shù)量大，導(dǎo)致其正電荷密度較大，可以與DNA之間強(qiáng)力結(jié)合，而且超支化的PEI含有大量的伯仲叔三種氨基，有較寬的質(zhì)子緩沖區(qū)間，即獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，高分子量PEI雖然轉(zhuǎn)染效率很高，但其細(xì)胞毒性較大，而低分子量PEI的細(xì)胞毒性很低，但其轉(zhuǎn)染效率卻很低。因此，在本發(fā)明中，利用PEI、PEG對(duì)聚檸檬酸酯(POC)的聚合反應(yīng)所形成的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)，不僅具有良好的生物相容性和較高基因轉(zhuǎn)染效率，而且材料在紫外照射下具有熒光特征，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)材料在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)向，是一種用于基因治療的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸和1,8-辛二醇按照1:1的摩爾比加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 600聚合物的制備：稱取的0.5mmol聚檸檬酸酯(POCG)于DMSO中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量600Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體、DMSO溶劑以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 600留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 600聚合物和DNA按照3:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例2

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.4:0.6加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 600聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量600Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 600留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 600聚合物和DNA按照3:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中,37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例3

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 600聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量600Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 600留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 600聚合物和DNA按照8:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中,37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例4

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 600聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量600Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 600留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 600聚合物和siRNA按照10:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中,37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例5

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 600聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量600Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 600留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 600聚合物和miRNA按照10:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中,37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例6

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 1.8K聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量1.8K Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 1.8K留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 1.8K聚合物和DNA按照4:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例7

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 1.8K聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量1.8K Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 1.8K留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 1.8K聚合物和siRNA按照8:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例8

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 1.8K聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量1.8K Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 1.8K留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 1.8K聚合物和miRNA按照8:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例9

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 10K聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量10K Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 10K留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 10K聚合物和DNA按照2:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例10

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 10K聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量10K Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 10K留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 10K聚合物和siRNA按照4:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例11

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PEI 10K聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入分子量10K Da的聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PEI 10K留作后用。

3)自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PEI 10K聚合物和miRNA按照4:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例12

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PLL聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入聚賴氨酸，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PLL留作后用。

3)可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PLL聚合物和DNA 按照10:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例13

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PAE聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入聚β-氨酯，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PAE留作后用。

3)可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PAE聚合物和siRNA按照10:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

實(shí)施例14

1)POCG預(yù)聚物的制備：將總質(zhì)量6g的檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇按照摩爾比1:0.7:0.3加入到50mL圓底燒瓶中，氮?dú)猸h(huán)境下攪拌放入160℃油浴中熔解；待反應(yīng)單體檸檬酸、1,8-辛二醇和聚乙二醇全部熔解后，溫度立即降至140℃，氮?dú)猸h(huán)境下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，冷凍干燥留做后用；

2)POCG-PAMAM聚合物的制備：稱取的0.5mmol水溶性聚檸檬酸酯(POCG)于15mL，50mM，pH 4-6的MES緩沖液中攪拌使其完全溶解，再加入1.5mmol EDC，室溫?cái)嚢?0min，隨后加入1.5mmol NHS，室溫?cái)嚢?2h，再加入聚酰胺-胺型樹(shù)狀物，室溫?cái)嚢?2h，產(chǎn)物在去離子水中透析純化2天，以除去未發(fā)生反應(yīng)的單體以及催化劑EDC和NHS，冷凍干燥得到陽(yáng)離子聚合物POCG-PAMAM留作后用。

3)可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體的制備：將POCG-PAMAM聚合物和miRNA按照10:1的氮磷比加入到10μl，50mM，pH 7.4的HEPES緩沖液中，37℃溫育30分鐘以便形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，即得到可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體。

本發(fā)明所制備的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)可以有效的結(jié)合各種基因(DNA/siRNA/miRNA),并且形成的復(fù)合物能夠有效的防止基因被機(jī)體內(nèi)的核酸酶降解，在聚陰離子(肝素鈉)的作用下，基因又能有效的從材料中釋放出來(lái)，POCG-PEI也表現(xiàn)出良好的生物相容性以及較高的基因轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)，POCG-PEI也表現(xiàn)出一定的熒光特性和光學(xué)穩(wěn)定性，這使得在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中對(duì)于材料的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了可能，下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳細(xì)分析。

由本發(fā)明方法制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體，其結(jié)構(gòu)式為：

圖1是本發(fā)明合成的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體中各種單體以及聚合物的結(jié)構(gòu)式，其中A為檸檬酸的結(jié)構(gòu)式，B為1,8-辛二醇的結(jié)構(gòu)式，C為聚乙二醇的結(jié)構(gòu)式，D為POCG預(yù)聚物的結(jié)構(gòu)式，E為POCG-PEI聚合物的結(jié)構(gòu)式。

圖2是制得的POCG預(yù)聚物和POCG-PEI聚合物的1H-NMR圖譜，從圖2A中可以看出，1,8-辛二醇上的亞甲基(-CH2)質(zhì)子峰分別位于1.2，1.5，3.9和4.1ppm，聚乙二醇上的亞甲基(-CH2)質(zhì)子峰分別位于3.5,4.2和4.3ppm，而位于2.6-3.0ppm的多重峰歸屬于檸檬酸的亞甲基質(zhì)子；其中3.9,4.1,4.2和4.3ppm的出現(xiàn)說(shuō)明POCG的成功合成，此外，圖2B中，2.4和2.9ppm的為聚乙烯亞胺的亞甲基峰(-NHCH2CH2-)，而3.0和3.1ppm的質(zhì)子峰(-CONHCH2-)的出現(xiàn)說(shuō)明PEI已成功接枝到POCG預(yù)聚物上并形成了新的POCG-PEI聚合物。

圖3為本發(fā)明制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)的光學(xué)特性。從圖3A和3B可以看出，POCG-PEI在365nm的激發(fā)波長(zhǎng)下表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，其發(fā)生波長(zhǎng)在440nm，從圖3C中可以看出，預(yù)聚物POCG和單體PEI具不具備熒光特性，只有兩者結(jié)合在一起，在紫外激發(fā)下才會(huì)表現(xiàn)出一定的熒光特性。

圖4為本發(fā)明制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)對(duì)于成肌細(xì)胞(C2C12，圖4A)和人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7，圖4B) 細(xì)胞毒性的測(cè)定?？梢钥闯?，POCG-PEI 600和POPCG-PEI 1.8K相比POCG-PEI 10K的細(xì)胞毒性特別低，甚至對(duì)細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用。

圖5為本發(fā)明制得的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)的活細(xì)胞熒光成像以及基因轉(zhuǎn)染結(jié)果，圖5A的藍(lán)光表示POCG-PEI聚合物，圖5B的紅光表示細(xì)胞核，圖5C的綠光是miRNA轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞中表達(dá)的一種綠色熒光蛋白，圖5E是細(xì)胞在明場(chǎng)條件下的照片，圖5D和5F是幾種照片的合并圖?？梢钥闯觯琍OCG-PEI聚合物可以攜帶基因順利進(jìn)入細(xì)胞并使基因表達(dá)，這些結(jié)果為POCG-PEI聚合物有望作為一種基因載體提供了可能。

本發(fā)明中所制備的自發(fā)熒光可降解聚檸檬酸酯的非病毒基因載體(POCG-PEI)，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，可以有效的結(jié)合各種基因(DNA/siRNA/miRNA),并且形成的復(fù)合物能夠有效的防止基因被機(jī)體內(nèi)的核酸酶降解，在聚陰離子(肝素鈉)的作用下，基因又能有效的從材料中釋放出來(lái)，POCG-PEI也表現(xiàn)出良好的生物相容性以及較高的基因轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)，POCG-PEI也表現(xiàn)出一定的熒光特性和光學(xué)穩(wěn)定性，因此該聚合物體在基因治療中有著很好的應(yīng)用前景。

以上內(nèi)容僅為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動(dòng)，均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護(hù)范圍之內(nèi)。