本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地說，涉及一種特異性DNA甲基化譜其建立方法及應用。

背景技術：

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種由遺傳和環(huán)境等多因素共同參與的慢性復雜性病變，其所致的心腦血管疾病嚴重危害了人類身體健康。近年來，隨著人們生活水平的提高、飲食習慣的改變、工作壓力的增加以及社會環(huán)境的變遷等因素影響，AS發(fā)病率呈明顯上升的趨勢，且發(fā)病年齡日趨年青化，AS所致的心腦血管疾病有可能成為世界范圍內(nèi)的首要致死致殘的原因之一，因而早期發(fā)現(xiàn)、預防和控制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展是目前臨床科學的重要目標之一。但AS的早期分子診斷、機制及方法尚未完全闡明。目前，血管造影和頸動脈超聲是診斷AS的重要手段，能夠顯示血管直徑、血管狹窄程度和斑塊晚期病變，長期以來都被作為冠狀動脈、頸動脈以及周圍動脈病變等解剖學診斷的金標準。但超聲檢測僅僅對已經(jīng)發(fā)生了動脈結構改變的動脈粥樣硬化有診斷意義，很難直接觀察到尚未發(fā)生結構及電生理改變的動脈粥樣硬化的病變；而血管造影雖然能較為直觀的觀察到已經(jīng)發(fā)生的病變，但造影具有創(chuàng)傷性，尤其是那些對造影劑過敏、腎臟功能不好的患者無法適用。因此，尋找一種動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的早期分子診斷標志物及簡單易行、快捷無創(chuàng)的檢測手段將對動脈粥樣硬化的預防和診斷有著重要的意義。

DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，經(jīng)DNA甲基轉移酶的調節(jié)，將供體的甲基轉移到5’端CpG二核苷酸的胞嘧啶上，使之變?yōu)?-甲基胞嘧啶，其本質是DNA基因堿基序列本身沒有改變而其功能發(fā)生的變化，是除遺傳學調控基因表達外又一重要調控方式，主要受環(huán)境因素的影響，是聯(lián)系遺傳和環(huán)境因素的紐帶。在細胞轉化過程中，DNA甲基化現(xiàn)象比臨床癥狀改變更早，是在疾病未出現(xiàn)臨床癥狀前DNA甲基化已發(fā)生了典型改變。DNA甲基化模式改變，包括DNA甲基化程度升高和降低，高甲基化抑制基因的表達，而低甲基化則可促進基因的表達。在腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化異常是引起腫瘤的一個重要因素，已經(jīng)在部分腫瘤的早期預測、分類及預后評估中進行了應用，而AS也屬于多因素復雜性疾病，其發(fā)生發(fā)展的相關機制如血管平滑肌細胞增殖及表型轉化、脂質浸潤及內(nèi)皮細胞損傷等都與其調控因子啟動子區(qū)的CpG島甲基化異常有關。在人類和ApoE基因敲除鼠的動脈粥樣硬化斑塊中存在廣泛的基因組甲基化水平降低，使部分染色體發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定，導致平滑肌細胞增生；AS病人的主動脈等組織中雌激素受體α基因的DNA甲基化水平升高；另外，在AS發(fā)生發(fā)展中，ATP結合盒轉運子A1(ABCA1)、膽固醇?；D移酶1(ACAT1)等基因也存在DNA甲基化修飾狀態(tài)的改變。由此可見，多個基因啟動子區(qū)的甲基化改變是AS發(fā)生中的普遍現(xiàn)象，基因DNA異常甲基化有可能是動脈粥樣硬化形成的早期生物學標志物，以高頻率的基因CpG島甲基化事件作為一種表遺傳學標志，在AS的早期診斷與預后評估中具有重要的潛在價值。

以往對AS的研究中，大多局限于觀察單個或少數(shù)基因甲基化與AS的關系，其基因表型和疾病表型間的復雜關系并不能通過將單個基因的獨立作用進行簡單的加和來充分解釋，僅依靠單個或少數(shù)基因的異常甲基化狀況不能準確判斷AS的發(fā)展狀況，因此，如能從多基因水平尋找出AS表遺傳標志物，即建立AS早期診斷的特異性甲基化譜，對復雜疾病篩查的實際臨床應用具有重要意義。但目前國內(nèi)外尚無對AS特異的DNA甲基化譜的研究及其作為表遺傳學標志與AS發(fā)生發(fā)展之間的關系的研究的公開報道，因此，找到有效的早期診斷方法和干預手段，指導AS的靶向性治療及潛在的干預靶點，對提高人們生活水平和質量有不可估量的作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性DNA甲基化譜其建立方法及應用，該方法該方法取材來自血液，患者普遍容易接受，簡單易行，容易推廣。

其具體技術方案為：

一種特異性DNA甲基化譜，包括TIMP-1、ACAT1、ABCA1三個基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

一種特異性DNA甲基化譜的建立方法，包括以下步驟：

(1)篩選與動脈粥樣硬化相關的候選基因；

(2)篩選動脈粥樣硬化患者和與之匹配的正常人的血液標本,檢測血脂水平并提取血液中單個核細胞的DNA,確定DNA的純度和濃度；

(3)將提取的DNA進行重亞硫酸鹽修飾,用巢氏降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測ABCA1、ACAT1、PPARα、PDGFβ、5-LO、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF、NFκB 12個基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化的改變；

(4)提取血液中單個核細胞的RNA并將其逆轉錄成cDNA,熒光Real-Time PCR法測血液單個核細胞中ABCA1、ACAT1、PPARα、5-LO、TIMP-1基因mRNA的表達；

(5)建立由ABCA1、ACAT1、TIMP-1三基因組成的動脈粥樣硬化特異性DNA甲基化譜；

(6)分析比較多個基因甲基化改變與頸動脈多普勒超聲相比診斷動脈粥樣硬化的特異性、敏感性等指標并進行評價。

進一步，動脈粥樣硬化患者血液中單個核細胞中ACAT1、PPARα基因DNA啟動區(qū)甲基化程度降低，而ABCA1、TIMP-1、5-LO基因DNA啟動子區(qū)甲基化程度升高。

進一步，動脈粥樣硬化患者血液中單個核細胞中ACAT1、PPARα基因mRNA表達減少,而ABCA1、TIMP-1、5-LO基因mRNA表達增加。

進一步，ABCA1、ACAT1、TIMP-1三個基因聯(lián)合組成的譜特異性和靈敏度均與影像學診斷的結果一致。

本發(fā)明所述特異性DNA甲基化譜在動脈粥樣硬化性疾病早期診斷過程中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明篩選ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO作為建立動脈粥樣硬化早期診斷的候選基因。

2、本發(fā)明建立了由TIMP-1、ACAT1、ABCA1這三個基因組成了AS特異性的DNA甲基化譜。

3、本發(fā)明的由TIMP-1、ACAT1、ABCA1這三個基因組成了AS特異性的DNA甲基化譜敏感度和特異度與影像學診斷的結果高度吻合。

4、本發(fā)明的方法取材來自血液，患者普遍容易接受，簡單易行，容易推廣。

附圖說明

圖1動脈粥樣硬化患者和正常對照組血脂水平。TG，甘油三脂；TC，膽固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05；

圖2為MMP9、5-LO、ICAM-1、ACAT1、LRP1及PDGF-β啟動子區(qū)CpG Island Searcher在線預測各基因啟動子區(qū)CpG島；

圖3為PPAR-α、NFkappaB、ABCA1、TIMP-1、VEGF和LCAT啟動子區(qū)CpG Island Searcher在線預測各基因啟動子區(qū)CpG島；

圖4基因組DNA電泳圖。Marker，DNA分子量標準；DNA，基因組DNA；

圖5為ACAT1、TIMP-1、ABCA1、5-LO、PPAR-α和VEGF啟動子區(qū)甲基化電泳圖。

圖6為ICAM-1、MMP9、LRP1、PDGF-β、LCAT和NFkappaB啟動子區(qū)甲基化電泳圖。

圖7為ACAT1、TIMP-1、ABCA1、5-LO、PPAR-α和VEGF啟動子區(qū)甲基化統(tǒng)計圖。M：甲基化，U：非甲基化。與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

圖8為ICAM-1、MMP9、LRP1、PDGF-β、LCAT和NFkappaB啟動子區(qū)甲基化統(tǒng)計圖。M：甲基化，U：非甲基化。與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方案對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明。

1材料

1.1主要試劑

AxyPrep血基因組DNA制備試劑盒、AxyPrep血RNA小量制備試劑盒是美國Axygen公司產(chǎn)品；DNA修飾試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)是美國Zymo公司產(chǎn)品；逆轉錄試劑盒、2×EcoTaq PCR SuperMix購自北京全式金公司；Maxima^TMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix購自美國Fermentas公司。

1.2主要儀器

PCR儀、核酸分析儀、凝膠成像系統(tǒng)購自百樂公司，低溫冰箱購自三洋公司，ADVIA-2400型全自動生化分析儀購自德國SIEMENS公司，高速低溫離心機購自德國Heraeus公司。

2方法

2.1臨床標本的選擇

選擇2011.5月至2013.9月在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院心內(nèi)科就診者和體檢者，以年齡30-60歲人群為研究對象，所有研究對象在抽血前回答流行病學調查問卷，所有標本取材前均通過寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會審核，家屬知情同意。入選者在空腹狀態(tài)下抽取10ml靜脈血，其中5.0ml靜脈血，經(jīng)3000r/min，4℃，離心10min，取上清，當日用全自動生化分析儀檢測臨床生化指標：甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白；另外5.0ml的EDTA抗凝血，用于DNA和RNA的提取。

AS組：根據(jù)入選者的臨床癥狀和血脂指標，并經(jīng)頸動脈多普勒超聲確診為動脈粥樣硬化患者200例。對照組：選取200例無既往動脈粥樣硬化史，無臨床癥狀，血脂正常，且經(jīng)頸動脈超聲證實無粥樣硬化斑塊的正常檢者，年齡、性別與AS組匹配。排除標準：上述兩組中均排除以下患者：兩周內(nèi)接受過降脂藥物治療者或其他服用有可能對本次研究有潛在影響的藥物者；孕婦及哺乳期婦女；惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全者、感染性疾病和其他等可能對研究有潛在影響的疾病。

2.2基因的篩選

在NCBI和OMIM內(nèi)輸入關鍵詞動脈粥樣硬化，再結合文獻報道，篩選和AS相關的基因約118個，然后在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)尋找這些基因啟動子區(qū)序列，經(jīng)CpG Island Searcher(http://cpgislands.usc.edu/)在線預測各基因的啟動子區(qū)CPG島情況；再根據(jù)各基因的主要表達場所，排除不在血液循環(huán)中表達的基因；再根據(jù)基因的功能篩選出和AS發(fā)生發(fā)展密切相關的基因。

2.3血脂水平的測定

將分離好的血清用ADVIA-2400型全自動生化分析儀檢測兩組的血脂水平：膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白。其中，血清TC和TG的檢測運用終點法，HDL采用選擇性遮蔽法檢測，LDL的檢測則采用直接清除法檢測。

2.4巢式降落式甲基化PCR(ntMS-PCR)檢測基因啟動子區(qū)DNA甲基化

甲基化特異性PCR(MSP)法的原理是重亞硫酸鹽可以使CpG位點中未甲基化的胞嘧啶(C)經(jīng)脫氨基作用轉化為尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶不變，是一種基于亞硫酸氫化修飾基礎上的甲基化檢測方法，用特殊設計的DNA序列的引物可以區(qū)分甲基化片段和未甲基化片段。巢式降落式甲基化特異性PCR(nested touchdown methylation-spciic PCR，ntMS-PCR)，是針對經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后的DNA序列設計一對非特異的外引物，即是巢氏，該引物避開CG二核苷酸，既能與DNA的甲基化片段結合，也能與非甲基化片段結合。操作時首先用外引物對修飾后的DNA樣本進行擴增，然后再用第一輪PCR產(chǎn)物作為模板加入特異性的甲基化和非甲基化引物繼續(xù)第二輪擴增。降落PCR(TD-PCR)的方法，是在PCR擴增開始時先在Tm值允許范圍內(nèi)選擇高于Tm值的退火溫度，每個循環(huán)都依次降低溫度，最終使退火溫度低于非特異性雜交的Tm值，此時擴增目的片段的數(shù)量已占絕對優(yōu)勢，可對非特異性擴增產(chǎn)生競爭性抑制，從而提高PCR的特異性和效率。

2.4.1外周血DNA提取及質量鑒定

按照試劑盒說明書提取外周血DNA，取出DNA溶液5μL，與1μL電泳加樣緩沖液混勻后加入到1％瓊脂糖凝膠加樣孔中，電泳25min在紫外凝膠成像分析儀中觀察。按照1:10比例用TE緩沖液稀釋待測的DNA樣品，用TE溶液調零(紫外分光光度計波長260nm處)，調零后分別測定各個DNA樣品在260nm處的OD值。DNA樣品純度判斷依據(jù)OD₂₆₀/OD₂₈₀，OD₂₆₀/OD₂₈₀是指DNA在260nm和280nm的OD值的比值，用于判斷DNA樣品純度。

OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.8-2.0之間的DNA溶液可用于后續(xù)實驗。DNA樣品濃度計算公式如下：

DNA＝10×OD₂₆₀×稀釋倍數(shù)(μg/mL)。

2.4.2基因組DNA的甲基化處理

按照試劑盒說明書對基因組DNA進行甲基化處理。先將130μL CT轉換試劑加入PCR管，再加入20μL DNA溶液，將樣品管放入熱循環(huán)儀(PCR儀)上，98℃10min，64℃2.5h；加入600μL M-Binding Buffer到Zymo-spin旋轉柱中混勻，12000g，離心30s，棄上清；加100μL M-Wash Buffer離心30s；加200μL M-Desulphonation Buffer室溫放置15-20min后，12000g，離心30s；重復該步驟1-2次；將旋轉柱放到另一個新的1.5mL的離心管中，直接加10μL M-Elution Buffer到柱中，12000g離心，30s，洗脫DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 ntMS-PCR檢測DNA甲基化

在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)網(wǎng)站中尋找基因啟動子區(qū)序列，使用在線甲基化引物設計軟件(htty://www.urogene.org/methprimer)，設計各基因的引物，每個基因共設計三對引物，分別設計一對外引物和兩對內(nèi)引物，即甲基化引物和非甲基化引物。向反應體系中依次加入：Mix 12.5μL，Up引物1μL，DNA模板4μL，去離子水6.5μL，總體積25μL。擴增條件：外引物：95℃預變性5min；95℃30s，72℃30s，每個循環(huán)降0.5℃，循環(huán)20次；再以恒定的退火溫度下進行94℃變性30s，56℃30s，72℃30s，20次循環(huán)；最后72℃繼續(xù)延伸7min。將外引物擴增的產(chǎn)物加入到第二輪擴增中為模板進行繼續(xù)擴增，本試驗中直接取外引物PCR產(chǎn)物2μL做模板進行第二輪擴增。第二輪內(nèi)引物擴增反應條件：95℃預變性5min；然后采用降落式PCR程序，95℃30s，64℃30s，72℃30s，每個循環(huán)降0.5℃，20次循環(huán)；再于恒定的退火溫度下進行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共20次循環(huán)；72℃再延伸7min。取5μL PCR擴增產(chǎn)物，在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳，在凝膠成像儀紫外線照像分析各個條帶的光密度值(OD值)，按如下公式計算結果：甲基化％＝甲基化(OD值)/[甲基化(OD值)+非甲基化(OD值)]。

2.5熒光Real-Time PCR法測mRNA的表達

2.5.1外周血RNA提取

按照RNA提取試劑盒說明書提取外周血單個核細胞的RNA。取200-400μl抗凝血與1-2ml Buffer RL充分混勻后在冰上孵育10-15min，在這期間渦旋混勻兩次，直至懸液透明，然后4℃，3000g,離心5min，棄上清，留下離心管底部的細胞團塊；加入0.5-1ml Buffer RL，輕輕振蕩使白細胞重懸，冰上孵育5min；4℃，3000g，離心5min，棄上清；再向沉淀中加400μl Buffer R-I，渦旋震蕩15-30s充分混勻；加入200μl Buffer R-II，渦旋混勻后4℃，12000g，離心10min；將上清轉移到另一2ml離心管內(nèi)，加入250μl異丙醇，顛倒混勻后轉移到吸附柱內(nèi)，6000g，4℃，離心1min，棄濾液；再加700μl Buffer W1A到吸附柱內(nèi)，12000g離心，1min，棄濾液；加入700μl Buffer W2，12000g離心，1min，取Buffer TE 80μl加入到吸附柱內(nèi)，室溫下靜置1min，12000g離心，1min，洗脫RNA，為避免RNA降解，-80℃保存待用。

2.5.2逆轉錄成cDNA

在經(jīng)DEPC處理的PCR管中依次加入總RNA5μL，OligodT(0.5μg/μL)1μL，2×TS Reaction Mix 10μL，TransScript RT/RI Enazyme Mix 1μL，最后加入去離子水補足至總體積20μL，放于-80℃保存。

2.5.3 PCR擴增

在Genbank中尋找各基因序列，使用primer5.0設計引物，反應體系：SYBR Green qPCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DEPC水8.5μL，cDNA模板2μL，終體積為25μL。反應條件：94℃預變性3min；94℃45s，根據(jù)各個基因的引物的Tm，按照每個引物的Tm值溫度退火45s，72℃延伸45s，擴增40個循環(huán)。

2.5.4結果計算

實驗結果的計算按照如下公式：檢測目的基因的相對表達量＝2^－△△Ct，其中，ΔΔCt＝[CtGI(檢測樣品)-CtGAPDH(檢測樣品)]-[CtGI(校正樣本)–CtGAPDH(校正樣本)]。GI是指所測目的基因，Ct是指檢測到的反應體系中熒光信號強度，校正樣本指的是所有被選做能夠代表1倍所測目的基因表達量的樣本。應用這一方法能直接獲得目的基因相對于管家基因的定量結果。

3.統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩樣本均數(shù)間比較采用兩樣本獨立t檢驗，應用ROC曲線分析多個基因甲基化改變，頸動脈多普勒超聲相比診斷AS的特異性、敏感性等指標進行評價。以P<0.05為差異有顯著性。靈敏性是指實際有病者按照某種診斷方法被正確地診斷為有病的概率，又被稱為真陽性率。特異性是指實際上沒病者根據(jù)某個診斷方法被正確地診斷為無病的概率，又稱真陰性率。

4結果

4.1對照組和AS組的血脂水平

全自動生化儀分別檢測入選的400例樣本，對照組和AS組血脂水平變化可見AS組中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白含量與對照相比，AS患者甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白含量分別升高了2.4倍、1.1倍和1.3倍，差異具有顯著性(P<0.05)；而與對照組相比，HDL濃度降低，差異具有顯著性(P<0.05)(見圖1)。

4.2 AS相關基因的初步篩選

在NCBI和OMIM內(nèi)輸入關鍵詞動脈粥樣硬化，再結合文獻報道，篩選和AS發(fā)生發(fā)展相關的基因約118個，然后在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)在線尋找這些基因啟動子區(qū)序列，CpG Island Searcher(http://cpgislands.usc.edu/)在線預測啟動子區(qū)CpG島，并選擇和AS密切相關，初步確定候選基因12個(ABCA1，ACAT1，PPARα，PDGFβ，5-LO，LRP1，LCAT，TIMP-1，MMP-9，ICAM-1，VEGF and NFκB)(見圖2，圖3)。

4.3基因組DNA質量

將提取的DNA加入至1％的瓊脂糖凝膠中電泳30min后，關閉電源取出凝膠，紫外凝膠成像分析儀下拍照，得到理想的DNA條帶(圖4)，用核酸分析儀檢測DNA濃度，測量三次后取均值，濃度在1.78×10³g/mL左右；OD260/OD280均在1.81左右，介于1.7～1.9之間，DNA可用于后續(xù)實驗。

4.4 DNA甲基化水平顯著改變的動脈粥樣硬化相關基因

采用ntMS-PCR分別檢測ATP結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)、膽固醇?；D移酶(ACAT1)、氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)、5-脂氧合酶(5-LO)、基質金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP-1)、低密度脂蛋白受體蛋白1(LRP1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血小板源性生長因子β(PDGFβ)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、卵磷脂膽固醇酯酰轉移酶(LCAT)和核轉錄因子(NFκB)的啟動子區(qū)DNA甲基化水平。對照組和AS組各個基因均能夠擴增出DNA甲基化特異性PCR產(chǎn)物和非甲基化特異性PCR產(chǎn)物，目的條帶單一，無非特異性條帶(見圖5、圖6)。在AS患者外周血中ACAT1(P<0.01)、ABCA1(P<0.01)、PPARα(P<0.05)、TIMP-1(P<0.01)和5-LO(P<0.05)的甲基化水平變化十分明顯，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異；而PDGFβ、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF和NFκB基因的DNA甲基化水平在兩組間差異沒有顯著性(P>0.05)(見圖7、圖8)。表明ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO基因的甲基化改變可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展，提示ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO基因可能是建立AS特異性DNA甲基化譜的候選基因。

4.5建譜基因的mRNA的表達

用real-time PCR檢測ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO在對照組和AS組中mRNA表達。與對照組相比，AS組中TIMP-1、ABCA1的啟動子區(qū)DNA甲基化升高，而其mRNA的表達水平明顯下降；和對照組相比，AS組中ACAT1、5-LO和PPARα的甲基化水平降低，而mRNA的表達量則明顯升高(表1)。結果證實了，DNA甲基化降低可以導致基因的mRNA表達升高；相反，甲基化升高則可使其mRNA的表達減少，說明基因表達符合甲基化調控的規(guī)律，這在基因的表達調控中起著重要的作用。

表1 DNA甲基化譜相關基因的mRNA表達

與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

4.6特異性DNA甲基化譜的建立

根據(jù)不同組中基因甲基化頻率的改變，我們將甲基化程度明顯變化的ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO作為候選基因。對照組和AS組中ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO五個基因DNA甲基化對AS診斷的敏感性和特異性分析發(fā)現(xiàn)，TIMP-1、ACAT1、ABCA1、5-LO和PPARα診斷的特異度分別為84％、84％、78％、60％、72％，敏感度依次為78％、68％、62％、48％、44％，其中TIMP-1、ACAT1、ABCA1在對照組和AS組的差異P<0.01，5-LO和PPARα兩個基因P<0.05(表2)。

表2各基因在對照組和AS組的特異度和靈敏度

AUC：曲線下面積；PPV：陽性預測值；NPV：陰性預測值

TIMP-1、ACAT1、ABCA1診斷的敏感性和特異性相對較好，在多種候選基因中優(yōu)化選擇TIMP-1、ACAT1、ABCA1這3個相關程度高的基因，可以做到在檢測較少指標的同時保持標志物的敏感性和特異性。將三個選定的基因TIMP-1、ACAT1、ABCA1的聯(lián)合使用，其中，ACAT1+TIMP-1、ABCA1+TIMP-1、ACAT1+ABCA1兩兩組合診斷AS的特異度為78％、94％、74％，敏感度分別為82％、76％、76％。聯(lián)合檢測TIMP-1、ACAT1、ABCA1的特異度和敏感度達到了90％和88％(表3)。

表3多基因對AS的診斷效果

4.7特異性DNA甲基譜診斷AS的可靠性分析

為了驗證TIMP-1、ACAT1和ABCA1甲基化譜的診斷效果，另外選取400例樣本(AS患者200例，正常人200例)進行TIMP-1、ACAT1、ABCA1三個基因的甲基化改變與頸動脈多普勒超聲相比，并根據(jù)我們制定的用基因DNA甲基化譜(TIMP-1、ACAT1和ABCA1)檢測AS結果的標準，聯(lián)合檢測的200例AS患者中陽性176例，陰性24例；檢測200例正常者假陽性60例，陰性140例，統(tǒng)計分析后，診斷的靈敏度88％，特異度70％。

5結論

ACAT1、PPARα、TIMP-1、ABCA1、5-LO基因啟動子區(qū)DNA甲基化是AS早期的、頻發(fā)的事件，由TIMP-1、ACAT1、ABCA1構成的AS特異性DNA甲基化譜對AS的診斷特異性和靈敏性均較高，DNA甲基化譜評估和診斷AS是可靠的。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧夏醫(yī)科大學

<120> 一種特異性DNA甲基化譜其建立方法及應用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgccaggtag cctctgtttg aatcccggcc atgccctgtg atcttaggaa aattctacag 60

ttcctctacg ccccatattt cctcatccgt aaaacgggaa taagaaccgg taccca 116

<210> 2

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcctctggg caacatggtg aaaacccgtc tctactaaaa tacaaaagat tagccaggct 60

tggcagcgtg cgcctgtaat cccagctact cgtgaggctg aggcgaactc aggaggcaga 120

ggttgcag 128

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaattccact ggtgcccttg gctgccggga acgtggacta gagagtctgc ggcgcagccc 60

cgagcccagc gcttcccgcg cgtcttaggc cggcgggccc gggcggggga aggggacgca 120

gaccgcggac cctaagacac c 141