本發(fā)明涉及核酸雜交檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的檢測方法及檢測探針。

背景技術(shù)：

mirna是一類內(nèi)源性非編碼小分子(18-22nt)，在基因表達(dá)或反轉(zhuǎn)錄中起著重要的調(diào)節(jié)作用。它與廣泛的生物過程相關(guān)，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和死亡。mirna的異常表達(dá)涉及到各種疾病，特別是人類癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、病毒感染和糖尿病。mirna在生理和病理過程中明顯的調(diào)控作用使mirna被用于臨床疾病的診斷、基因治療與新抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)。例如，mirna-203在各種惡性腫瘤的過度表達(dá)，包括乳腺癌、宮頸癌、白血病和喉癌等。因此，對于疾病狀態(tài)的診斷與預(yù)后，mirna-203的表達(dá)情況是有前景的生物標(biāo)志物，在基因治療中對遺傳性疾病和潛在的藥物靶標(biāo)提供一個有吸引力的途徑。mirna-21在多種腫瘤標(biāo)本以及細(xì)胞系都檢測出其表達(dá)水平異常升高，mirna-21是一個公認(rèn)的致癌性小rna。

然而，由于mirna同族成員之間具有低豐度、尺寸短、較高的序列同源性等特點(diǎn)，因此，檢測mirna是一個挑戰(zhàn)，對于mirna的檢測方法需要具備良好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。mirna的傳統(tǒng)檢測方法有：northern印跡法、實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)和mirna的基因芯片檢測等。其中，northern印跡法被認(rèn)為是mirna檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是由于它操作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，靈敏度相對較低并且樣品需要量大(10μg樣品)等缺點(diǎn)使得它不適用于常規(guī)的臨床診斷；pcr和基因芯片檢測法存在效率低、檢測限低、耗時、經(jīng)濟(jì)性低和操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，限制了它們的生物和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，因此，開發(fā)新的mirna的檢測策略是具有重要意義的。

核酸適配體是近年來發(fā)展起來的一類經(jīng)體外人工合成而篩選出的單鏈寡核苷酸，能高效、特異性地結(jié)合各種生物目標(biāo)分子，核酸適配體的出現(xiàn)為化學(xué)生物學(xué)界和生物醫(yī)學(xué)界提供了一種新的研究平臺。核酸適配體具有自身穩(wěn)定性好、制備合成相對簡單、快速、易獲得、易功能化修飾與標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，因此，在生物傳感器設(shè)計(jì)中應(yīng)用靈活廣泛。

目前，已有利用基于atp核酸適配體的生物傳感器檢測atp的報(bào)道，但在atp的檢測過程中，需要對核酸適配體進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，再根據(jù)識別反應(yīng)前后標(biāo)記物本身或其催化底物的變化進(jìn)行檢測，因此操作復(fù)雜，成本較高。

金納米粒子獨(dú)特的化學(xué)穩(wěn)定性、催化活性、可加工性和金屬性質(zhì)，使其成為一個引人注目的納米材料，并且具有獨(dú)特的尺寸相關(guān)的光學(xué)和電子特性，因此，金納米粒子廣泛使用在催化、納米電子學(xué)和生物醫(yī)學(xué)(傳感、診斷、影像與標(biāo)記)等技術(shù)領(lǐng)域中。然而，目前還未見有將金納米粒子與dna雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合來檢測mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的檢測方法及檢測探針。該檢測方法無需化學(xué)標(biāo)記，顏色變化肉眼可見，方法簡單，適用范圍廣，可用于mirna、具有核酸適配體的靶標(biāo)分子(例如atp、凝血酶、溶菌酶、表皮生長因子受體等)的檢測。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種探針，該探針包括：金納米粒子-h1復(fù)合物、金納米粒子-h2復(fù)合物和目標(biāo)物識別復(fù)合物；

所述金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物分別由頸環(huán)dnah1和h2與金納米粒子結(jié)合而形成；

所述目標(biāo)物識別復(fù)合物包括：用于識別mirna的羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物，和用于識別靶標(biāo)分子的dna3中的至少一種。

上述探針中，所述頸環(huán)dnah1的序列如seqidno.1所示，h2的序列如seqidno.2所示，具體如下：

h1：5’-sh-gcgattcctaggttgagcccagggttttttcacagtccctgggctcaacctagg-3’；(seqidno.1)

h2：5’-ccctgggctcaacctaggaatcgcttttttcctaggttgagcccagggactgtg-sh-3’；(seqidno.2)。

上述探針中，所述羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物由兩條部分互補(bǔ)的dna1和dna2鏈接在羧基修飾的磁性微球上而成。

所述dna1中包含與待檢測的mirna互補(bǔ)和/或部分互補(bǔ)的序列。

所述dna3中包含與待檢測的靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適配體序列。

優(yōu)選的，所述金納米粒子的粒徑為5nm。

優(yōu)選的，所述羧基磁性微球粒徑為1μm。

優(yōu)選的，所述mirna為mir-203或mir-21。

當(dāng)待檢測的mirna為mir-203時，所述探針中，dna1包含與mir-203部分互補(bǔ)的序列，其序列如seqidno.3所示，dna2的序列如seqidno.4所示，具體如下：

dna1：5’-gggctagtggtcctaaacatttcac-nh2-3’；(seqidno.3)

dna2：5’-ggaccactagccctgggctcaacctaggaatcgc-3’；(seqidno.4)。

當(dāng)待檢測的mirna為mir-21時，所述探針中，dna1’包含與mir-21部分互補(bǔ)的序列，其序列如seqidno.5所示，dna2’的序列如seqidno.6所示，具體如下：

dna1’：5’-gggtcaacatcagtctgataagcta-nh2-3’；(seqidno.5)

dna2’：5’-ctgatgttgaccctgggctcaacctaggaatcgc-3’；(seqidno.6)。

優(yōu)選的，所述靶標(biāo)分子為atp。

當(dāng)檢測的靶標(biāo)分子為atp時，所述探針中，dna3的序列如seqidno.7所示，具體如下：

5’-cccaggtccctgggctcaacctaggaatcgcgggacctgggggagtattgcggaggaaggt-3’；(seqidno.7)

本發(fā)明還提供上述探針在檢測mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子中的用途。

上述探針在制備檢測mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的試劑盒中的用途也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的第二方面，提供上述探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物的制備：分別將頸環(huán)dnah1和h2與金納米粒子在緩沖液中進(jìn)行孵育，反應(yīng)5-7h；采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，將分離的條帶放入透析膜中透析，即得；

(2)羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物的制備：將羧基修飾的磁珠進(jìn)行活化處理，向活化后的磁珠中加入dna1，反應(yīng)3-5h，對所得復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，即得羧基磁性微球-dna1復(fù)合物；再加入dna2，反應(yīng)1-3h，再進(jìn)行磁性分離，即得羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物。

步驟(1)中，所述金納米粒子的制備方法為：在氯金酸和檸檬酸三鈉混合液中加入冰的硼氫化鈉，攪拌至溶液變成粉紅色，反應(yīng)2-5h，即得。

優(yōu)選的，氯金酸和檸檬酸三鈉混合液中，氯金酸的濃度為0.25mm，檸檬酸三鈉的濃度為0.25mm，冰的硼氫化鈉的濃度為0.1m。

步驟(1)中，h1和h2與金納米粒子加入的摩爾比均為1：2。

步驟(1)中，所述緩沖液為0.5×tbe緩沖液，其組成為：89mmtris，89mm硼酸，2mmedta，ph8.0。

步驟(2)中，羧基修飾的磁珠的活化方法為：向羧基修飾磁珠中加入n-羥基琥珀酰亞胺鈉鹽(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，室溫下反應(yīng)1h，將混合物進(jìn)行磁性分離，即得。

本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的方法，步驟如下：

(1)將目標(biāo)物識別復(fù)合物分別與系列濃度梯度的待檢測目標(biāo)物溶液混合，反應(yīng)，向反應(yīng)后的溶液中加入金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育3-5h，測定孵育后溶液的紫外吸收光譜，構(gòu)建待檢測目標(biāo)物濃度與紫外吸收峰值之間的工作曲線；

(2)提取待檢測樣品中的目標(biāo)物，采用步驟(1)的方法，測得孵育后溶液的紫外吸收光譜，代入工作曲線，即得待檢測樣品中目標(biāo)物的濃度。

具體的，檢測mirna的方法為：

(1)將羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物分別與系列濃度梯度的待檢測mirna溶液混合，20-30℃條件下反應(yīng)1-3h，反應(yīng)后進(jìn)行磁分離并吸取上清液；向上清液中加入金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育3-5h，測定孵育后溶液的紫外吸收光譜，構(gòu)建mirna濃度與紫外吸收峰值之間的工作曲線；

(2)提取待檢測樣品中的rna，采用步驟(1)的方法，測得孵育后溶液的紫外吸收光譜，代入工作曲線，即得待檢測樣品中mirna的濃度。

檢測具有核酸適配體的靶標(biāo)分子(以atp為例)的方法為：

(1)將dna3與系列濃度梯度的atp溶液混合，20-30℃條件下反應(yīng)1-3h，向反應(yīng)后的溶液中加入金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育3-5h，測定孵育后溶液的紫外吸收光譜，構(gòu)建atp濃度與紫外吸收峰值之間的工作曲線；

(2)提取待檢測樣品中的atp，采用步驟(1)的方法，測得孵育后溶液的紫外吸收光譜，代入工作曲線，即得待檢測樣品中atp的濃度。

本發(fā)明的檢測mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的原理為：

對于mirna的檢測，本發(fā)明首先構(gòu)建了一種基于金納米粒子-dna雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的探針，該探針包括：金納米粒子-h1復(fù)合物、金納米粒子-h2復(fù)合物和羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物；其中，羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物是在羧基修飾的磁性微球鏈接兩條部分互補(bǔ)的dna(即dna1和dna2)，dna1中包含與待檢測mirna部分互補(bǔ)的序列，當(dāng)有目標(biāo)物mirna存在時，目標(biāo)物mirna與dna1作用，從而釋放出dna2。再加入金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物，在dna2的誘導(dǎo)下，h1和h2的頸環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，從而使金納米粒子-h1和金納米粒子-h2發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使得金納米粒子相互距離靠近，顏色發(fā)生變化，通過比色法即可實(shí)現(xiàn)對mirna的識別和檢測，具體原理圖如圖1所示。

對于具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的檢測，本發(fā)明首先構(gòu)建包含能夠與待檢測的靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適配體序列的dna3，該dna3正常狀態(tài)下為頸環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)有目標(biāo)物靶標(biāo)分子存在時，dna3與靶標(biāo)分子特異性的結(jié)合，dna3本身的頸環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，再加入金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物，頸環(huán)結(jié)構(gòu)打開后的dna3能夠誘導(dǎo)h1和h2的頸環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，從而使金納米粒子-h1和金納米粒子-h2發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使得金納米粒子相互距離靠近，顏色發(fā)生變化，通過比色法即可實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)分子的識別和檢測，具體原理圖如圖2所示。

本發(fā)明的關(guān)鍵之一在于對mirna和或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子具有檢測能力的探針的設(shè)計(jì)，即如何對h1和h2進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其一方面能夠穩(wěn)定存在，另一方面，在目標(biāo)物識別復(fù)合物的誘導(dǎo)下能夠順利的打開頸環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其中，若h1和h2中雜交的堿基數(shù)過多，則會使h1和h2的頸環(huán)結(jié)構(gòu)過于穩(wěn)定，不易在目標(biāo)物識別復(fù)合物的誘導(dǎo)下打開；若h1和h2中雜交的堿基數(shù)過少，則會使h1和h2的頸環(huán)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在沒有目標(biāo)物存在的情況下也容易打開，導(dǎo)致檢測假陽性的情況出現(xiàn)。本發(fā)明在試驗(yàn)過程中設(shè)計(jì)了多組不同結(jié)構(gòu)、不同雜交堿基數(shù)的h1和h2，經(jīng)實(shí)際檢測效果比較，采用具有seqidno.1和seqidno.2所示的h1和h2，其對mirna和靶標(biāo)分子的檢測效果最為優(yōu)異。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明首次將金納米粒子與dna雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)巧妙聯(lián)系起來，通過金納米粒子的相互距離的靠近而發(fā)生的顏色變化來檢測mirna和具有核酸適配體的靶標(biāo)分子，檢測方法簡單，靈敏度高，對mirna檢測的最低濃度可達(dá)1.0×10^-11m；對atp檢測的最低濃度可達(dá)1.0×10^-8m。

附圖說明

圖1：本發(fā)明檢測mirna的原理圖；

圖2：本發(fā)明檢測atp的原理圖；

圖3：實(shí)施例1中金納米粒子的透射電鏡圖；

圖4：檢測不同濃度mir-203的工作曲線(a)及檢測溶液照片(b)；

圖5：本發(fā)明對檢測mir-203的選擇性；

圖6：檢測不同濃度mir-21的工作曲線。

圖7a：實(shí)施例7中檢測不同濃度atp的紫外吸收光譜圖及照片；

圖7b：檢測不同濃度atp的工作曲線。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1：檢測mirna探針的制備：

該探針包括：金納米粒子-h1復(fù)合物、金納米粒子-h2復(fù)合物和羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物；其中：h1、h2的序列如下：

h1：5’-sh-gcgattcctaggttgagcccagggttttttcacagtccctgggctcaacctagg-3’；(seqidno.1)

h2：5’-ccctgggctcaacctaggaatcgcttttttcctaggttgagcccagggactgtg-sh-3’；(seqidno.2)。

dna1中包含與待檢測的mirna互補(bǔ)和/或部分互補(bǔ)的序列；dna1與dna2部分互補(bǔ)。

其中，金納米粒子-h1復(fù)合物、金納米粒子-h2復(fù)合物的制備方法為：

(1)直徑5nm的金納米粒子的制備：在20ml的氯金酸(0.25mm)和檸檬酸三鈉(0.25mm)混合液中加入0.6ml0.1m冰的硼氫化鈉，攪拌至溶液變成粉紅色，反應(yīng)2-5h。金納米粒子溶液置于4℃下保存?zhèn)溆?。金納米粒子的透射電鏡圖見圖3，體現(xiàn)了較好的分散性和粒徑均一性。

(2)金納米粒子-h1復(fù)合物和金納米粒子-h2復(fù)合物的制備：h1和h2分別與金納米粒子以1:2的比例在0.5×tbe緩沖液(89mmtris，89mm硼酸，2mmedta，ph8.0)中進(jìn)行孵育，室溫下反應(yīng)6h，反應(yīng)過程中少量多次添加nacl，使其濃度達(dá)致50mm。利用3％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離(電泳凝膠緩沖液：0.5×tbe,70v,1.5h)。條帶放入透析膜(截留分子量14000)中透析，金納米粒子-dna復(fù)合物保存在4℃。

羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物的制備方法為：

200μl羧基修飾磁珠(1μm)中加入100μl0.01mn-羥基琥珀酰亞胺鈉鹽(nhs)和100μl0.01m1m1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，在室溫下反應(yīng)1h，將混合物進(jìn)行磁性分離，并用去離子水洗三次，活化后的磁珠重懸于200μl去離子水中，并加入200μl1.0×10^-5mol/l的dna1，然后，在室溫下反應(yīng)4h，最后，對所得復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，用0.01mph為7.4的pbs緩沖溶液洗滌3次之后再重懸于200μlmlpbs緩沖溶液中，就得到了羧基磁性微球-dna1復(fù)合物。在上述羧基磁性微球-dna1復(fù)合物中加入200μl1.0×10^-4mol/l的dna2，然后，在室溫下反應(yīng)2h，對所得羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，用0.01mph為7.4的pbs緩沖溶液洗滌3次之后再重懸于100μlpbs緩沖溶液中。

實(shí)施例2：本發(fā)明的探針在檢測mir-203中的應(yīng)用

1.試驗(yàn)材料：

mir-203的核苷酸序列如下：

5’-gugaaauguuuaggaccacuag-3’。

探針的組成和制備方法同實(shí)施例1，探針中：

h1、h2的序列如下：

h1：5’-sh-gcgattcctaggttgagcccagggttttttcacagtccctgggctcaacctagg-3’；(seqidno.1)

h2：5’-ccctgggctcaacctaggaatcgcttttttcctaggttgagcccagggactgtg-sh-3’；(seqidno.2)；

dna1、dna2的序列如下：

dna1：5’-gggctagtggtcctaaacatttcac-nh2-3’；(seqidno.3)

dna2：5’-ggaccactagccctgggctcaacctaggaatcgc-3’；(seqidno.4)。

2.檢測方法：

具體方法如下：

(1)mir-203工作液的配制：mir-203工作液的配制：將含有1‰(體積比)的depc水的pbs緩沖溶液(ph7.4)進(jìn)行滅菌，并用其配制不同濃度的mir-203溶液。

(2)工作曲線的繪制：將100μl的羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物與100μl不同濃度的mir-203溶液(0，1.0×10^-11m，5.0×10^-11m，1.0×10^-10m，3.0×10^-10m)混合均勻，在25℃下反應(yīng)2h后進(jìn)行磁分離并吸取上清液，然后，在上清液中加入100μl金納米粒子-h1復(fù)合物和100μl金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育4h后記錄溶液顏色變化，并測紫外吸收光譜。以mir-203濃度為橫坐標(biāo)，以620nm與520nm處的紫外吸收峰值比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線圖。從圖4可以看出，伴隨著mir-203濃度的提高，620nm和520nm處紫外吸收峰值比發(fā)生相應(yīng)變化。本方法檢測mir-203的工作曲線方程為y＝0.022x+0.437(y表示620nm和520nm處紫外吸收峰值比，x表示mir-203濃度，單位10^-10m，r＝0.99)，mir-203的濃度范圍為1.0×10^-11m-3.0×10^-10m。隨著mir-203濃度的提高，同時觀察到體系顏色逐漸由淺酒紅色變?yōu)樽仙僮優(yōu)闇\藍(lán)色(圖4)，說明mir-203濃度的增加，提高了金納米粒子的聚集程度，體系的顏色也就不同。

(3)mir-203的檢測：提取待檢測樣品中的rna，采用步驟(1)的方法，測得孵育后溶液的紫外吸收光譜，代入工作曲線，即得待檢測樣品中mir-203的濃度。

采用本發(fā)明的金納米粒子-dna雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的探針比色法檢測mir-203最低濃度為1.0×10^-11m。

實(shí)施例3：mir-203檢測方法的選擇性考察

mir-203、mir-21(核酸序列：5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’)和mir-16(核酸序列：5’-uagcagcacguaaauauuggcg-3’)溶液的配制：將含有1‰(體積比)的depc水的pbs緩沖溶液(ph7.4)進(jìn)行滅菌，并用其配制1.0×10^-10mmir-203、2.0×10^-9mmir-21和2.0×10^-9mmir-16溶液。

將100μl的羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物與100μlmir-203溶液(1.0×10^-10m)或mir-21溶液(1.0×10^-9m)或mir-16溶液(1.0×10^-9m)，混合均勻，在25℃下反應(yīng)2h后進(jìn)行磁分離并吸取上清液，然后，在上清液中加入100μl金納米粒子-h1復(fù)合物和100μl金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育4h后，記錄620nm與520nm處的紫外吸收峰值比。如圖5所示，只有mir-203溶液對金納米粒子的紫外光譜引起了明顯改變，溶液顏色也產(chǎn)生了變化。盡管mir-21溶液和mir-16溶液的濃度比mir-203溶液濃度高1個數(shù)量級，但是依然沒有引起紫外吸收峰值比得明顯變化，因此本方法對mir-203具有很好的選擇性。

實(shí)施例4：細(xì)胞內(nèi)的mir-203濃度檢測

細(xì)胞中rna的提?。涸?7℃、含有5％co2的濕潤環(huán)境中，用含有10％的胎牛血清和1％雙抗的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)mcf-7細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)取1.0×10⁴個mcf-7細(xì)胞并用pbs(10mm，ph7.4)沖洗兩遍，在3min內(nèi)使mcf-7細(xì)胞在37℃和液氮兩個環(huán)境下循環(huán)放置3次，加入300μl細(xì)胞裂解液，然后，40μl的三氯甲烷和200μl的pbs(10mm，ph7.4)加入到細(xì)胞中，并劇烈攪拌15s，然后室溫下放置3min，把混合溶液在12000轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，然后，100μl的異丙醇加入到上清液中，混合均勻后在室溫下放置10min，將混合物在13000轉(zhuǎn)速下離心10min來沉淀rna，最后，得到的rna再分散于depc處理的pbs緩沖溶液(ph7.4)中。

比色探針法檢測細(xì)胞中的mir-203：將100μl的羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物與細(xì)胞中提取的100μlrna溶液混合均勻，在25℃下反應(yīng)2h后進(jìn)行磁分離并吸取上清液，然后，在上清液中加入100μl金納米粒子-h1復(fù)合物和100μl金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育4h后記錄溶液顏色變化，比色法檢測mir-203。測紫外吸收光譜，計(jì)算出620nm與520nm處的峰值比，并依據(jù)圖4中繪制的工作曲線圖計(jì)算得到細(xì)胞中mir-203的濃度為460copys/cell。

實(shí)施例5：基于金納米粒子-dna雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的探針在檢測mir-21中的應(yīng)用

1.試驗(yàn)材料：

mir-21的核苷酸序列如下：

5’-gugaaauguuuaggaccacuag-3’。

探針的組成和制備方法同實(shí)施例1，探針中：

h1、h2的序列如下：

h1：5’-sh-gcgattcctaggttgagcccagggttttttcacagtccctgggctcaacctagg-3’；(seqidno.1)

h2：5’-ccctgggctcaacctaggaatcgcttttttcctaggttgagcccagggactgtg-sh-3’；(seqidno.2)；

dna1’、dna2’的序列如下：

dna1’：5’-gggtcaacatcagtctgataagcta-nh2-3’；(seqidno.5)

dna2’：5’-ctgatgttgaccctgggctcaacctaggaatcgc-3’；(seqidno.6)。

2.檢測方法：

具體方法如下：

(1)mir-21工作液的配制：mir-21工作液的配制：將含有1‰(體積比)的depc水的pbs緩沖溶液(ph7.4)進(jìn)行滅菌，并用其配制不同濃度的mir-21溶液。

(2)工作曲線的繪制：將100μl的羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物與100μl不同濃度的mir-21溶液(0，1.0×10^-11m，5.0×10^-11m，1.0×10^-10m，3.0×10^-10m)混合均勻，在25℃下反應(yīng)2h后進(jìn)行磁分離并吸取上清液，然后，在上清液中加入100μl金納米粒子-h1復(fù)合物和100μl金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育4h后記錄溶液顏色變化，并測紫外吸收光譜。以mir-21濃度為橫坐標(biāo)，以620nm與520nm處的紫外吸收峰值比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線圖。從圖6可以看出，伴隨著mir-21濃度的提高，620nm和520nm處紫外吸收峰值比發(fā)生相應(yīng)變化。本方法檢測mir-21的工作曲線方程為y＝0.025x+0.359(y表示620nm和520nm處紫外吸收峰值比，x表示mir-21濃度，單位10^-10m，r＝0.99)，mir-21的濃度范圍為1.0×10^-11m-3.0×10^-10m。隨著mir-21濃度的提高，同時觀察到體系顏色逐漸由淺酒紅色變?yōu)樽仙僮優(yōu)闇\藍(lán)色，說明mir-21濃度的增加，提高了金納米粒子的聚集程度，體系的顏色也就不同。

(3)mir-21的檢測：提取待檢測樣品中的rna，采用步驟(1)的方法，測得孵育后溶液的紫外吸收光譜，代入工作曲線，即得待檢測樣品中mir-21的濃度。

實(shí)施例6：細(xì)胞內(nèi)的mir-21濃度的檢測

細(xì)胞中rna的提?。涸?7℃、含有5％co2的濕潤環(huán)境中，用含有10％的胎牛血清和1％雙抗的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)mcf-7細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)取1.0×10⁴個mcf-7細(xì)胞并用pbs(10mm，ph7.4)沖洗兩遍，在3min內(nèi)使mcf-7細(xì)胞在37℃和液氮兩個環(huán)境下循環(huán)放置3次，加入300μl細(xì)胞裂解液，然后，40μl的三氯甲烷和200μl的pbs(10mm，ph7.4)加入到細(xì)胞中，并劇烈攪拌15s，然后室溫下放置3min，把混合溶液在12000轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，然后，100μl的異丙醇加入到上清液中，混合均勻后在室溫下放置10min，將混合物在13000轉(zhuǎn)速下離心10min來沉淀rna，最后，得到的rna再分散于depc處理的pbs緩沖溶液(ph7.4)中。

比色探針法檢測細(xì)胞中的mir-21：將100μl的羧基磁性微球-dna1/2復(fù)合物與細(xì)胞中提取的100μlrna溶液混合均勻，在25℃下反應(yīng)2h后進(jìn)行磁分離并吸取上清液，然后，在上清液中加入100μl金納米粒子-h1復(fù)合物和100μl金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育4h后記錄溶液顏色變化，比色法檢測mir-21。測紫外吸收光譜，計(jì)算出620nm與520nm處的峰值比，并依據(jù)圖6中繪制的工作曲線圖計(jì)算得到細(xì)胞中mir-21的濃度為7600copys/cell。

實(shí)施例7：本發(fā)明的探針在檢測atp中的應(yīng)用

(1)將100μldna3與100μl不同濃度的atp溶液(0，1.0×10^-8m，5.0×10^-8m，1.0×10^-7m，5.0×10^-7m)混合均勻，在25℃下反應(yīng)1h后，加入100μl金納米粒子-h1復(fù)合物和100μl金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育4h后記錄溶液顏色變化。從圖7a可以看出，伴隨著atp濃度的提高，體系顏色逐漸由淺酒紅色變?yōu)樽仙僮優(yōu)闇\藍(lán)色(圖7a)，說明atp濃度的增加，提高了金納米粒子的聚集程度，體系的顏色也就不同。以atp濃度為橫坐標(biāo)，以620nm與520nm處的紫外吸收峰值比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線圖。從圖7b可以看出，伴隨著atp濃度的提高，620nm和520nm處紫外吸收峰值比發(fā)生相應(yīng)變化。本方法檢測atp的工作曲線方程為y＝1.62x+0.17(y表示620nm和520nm處紫外吸收峰值比，x表示atp濃度，單位10^-6m，r＝0.99)，atp的濃度范圍為1.0×10^-8m-5.0×10^-7m。

(2)atp的檢測：提取待檢測樣品中的atp，采用步驟(1)的方法，測得孵育后溶液的紫外吸收光譜，代入工作曲線，即得待檢測樣品中atp的濃度。

dna3的序列如下：

5’-cccaggtccctgggctcaacctaggaatcgcgggacctgggggagtattgcggaggaaggt-3’。

實(shí)施例8：細(xì)胞破碎液中的atp濃度的檢測

在37℃、含有5％co2的濕潤環(huán)境中，用含有10％的胎牛血清和1％雙抗的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)mcf-7細(xì)胞。將mcf-7細(xì)胞并用pbs(10mm，ph7.4)沖洗兩遍，冰浴超聲，得到細(xì)胞破碎液。將100μldna3與100μl細(xì)胞破碎液混合均勻，在25℃下反應(yīng)1h后，加入100μl金納米粒子-h1復(fù)合物和100μl金納米粒子-h2復(fù)合物，孵育4h后，測紫外吸收光譜，計(jì)算出620nm與520nm處的峰值比，并依據(jù)圖7b中繪制的工作曲線圖計(jì)算得到細(xì)胞破碎液中atp的濃度為3.2×10^-6m。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>臨沂大學(xué)

<120>mirna和/或具有核酸適配體的靶標(biāo)分子的檢測方法及檢測探針

<130>2017

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t61